Introduction : L’apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine membranaire impliquée dans le catabolisme des lipoprotéines riches en triglycérides (TG). Le polymorphisme du gène de l’apolipoprotéine E epsilon 4 (APOE4) est considéré comme le plus grand facteur de risque génétique de la maladie d’Alzheimer tardive. Il est connu que la consommation d’acide gras polyinsaturé oméga 3 (AGPI n-3) serait associée à une diminution du risque de déclin cognitif. L’acide docosahexaénoïque (DHA) est un AGPI n-3 contenu dans les poissons riches en gras. Des résultats publiés par la professeure Mélanie Plourde ont démontré que suite à une diète riche en DHA, la concentration plasmatique en DHA était 3 fois moins élevée chez les porteurs de l’APOE4. Cela laisse supposer que les porteurs d’APOE4 auraient possiblement une perturbation dans l’homéostasie des AGPI n-3 au niveau entérocytaire. Objectif : Déterminer le profil en acides gras (AG) dans le duodénum et le jéjunum selon la diète et le polymorphisme de l’APOE chez le modèle animal murin. Évaluer si la diète et/ou le polymorphisme de l’APOE affectent l’expression protéique des transporteurs d’AG dans le jéjunum chez le modèle animal murin. Matériel et méthodes : Des souris knock-in pour les différentes formes de l’APOE (APOE3 ou APOE4) ont été utilisées. À 4 mois, celles-ci ont reçu pendant 8 mois soit une diète contrôle ou une diète riche en DHA. Après sacrifice des animaux, le duodénum et le jéjunum ont été prélevés. Une extraction des lipides totaux par la méthode de Folch a été effectuée. Le profil en AG a ensuite été réalisé par chromatographie en phase gazeuse. L’expression protéique des transporteurs d’AG entérocytaire a été mesurée par immunobuvardage de type western. Résultats et discussion : Les souris nourries avec la diète DHA avaient une augmentation en DHA dans le duodénum et le jéjunum établissant ainsi que le DHA est bien absorbé par les entérocytes dans ce modèle animal. Le génotype de l’APOE ne semble pas affecter spécifiquement le métabolisme du DHA puisqu’aucune différence significative n’a été observée pour le génotype. Par ailleurs, les souris ayant consommé la diète DHA avaient une diminution en acide arachidonique. Cette diminution semble plus prononcée chez les souris porteuses de l’APOE4, ce qui pourrait suggérer une demande plus importante en DHA chez les souris porteuses de l’APOE4. D’autre part, les souris nourries avec la diète DHA avaient une augmentation significative de l’expression relative des transporteurs d’AG Cd36 et Fabp2. Finalement, le transporteur d’AG Fabp1 tend à être diminué chez les souris porteuses de l’APOE4 Conclusion : Ces résultats suggèrent une possible perturbation dans le transit et l’exportation des AG sous forme de chylomicron plutôt que dans l’absorption de ceux-ci.

Lors de l’obésité, les défauts d’expansion du tissu adipeux blanc sont à l’origine des désordres métaboliques. Lorsque les adipocytes atteignent leurs capacités maximales de stockage de triglycérides, des dépôts ectopiques de lipides apparaissent dans le foie et le muscle conduisant à la résistance à l’insuline. De plus, les adipocytes dysfonctionnels sécrètent des facteurs d’alertes établissant une inflammation dans le tissu adipeux. Cette inflammation est médiée par les communications entre les adipocytes et les cellules immunitaires qui sont contrôlées par l’endocytose et le trafic intracellulaire. L’endocytose et les protéines Rab gouvernant ce processus pourraient être des éléments clés de l’expansion du tissu adipeux. L’équipe a démontré que l’expression de Rab4b était diminuée dans le tissu adipeux de patients obèses diabétiques et de souris obèses. Nos travaux montrent que l’expression de Rab4b est diminuée dans les lymphocytes T du tissu adipeux de souris et de patients obèses. L’invalidation de Rab4b dans les lymphocytes T in vivo induit une résistance à l’insuline et une accumulation d’acides gras dans le foie et dans le muscle sous régime normal. Ces défauts sont dus à une inhibition de l’adipogenèse par l’IL-6 et l’IL-17, limitant l’expansion du tissu adipeux. L’augmentation de ces cytokines pro-inflammatoires est une conséquence de l’augmentation du nombre de lymphocytes Th17 et une diminution des lymphocytes T régulateurs. Nous décrivons un nouveau mécanisme par lequel l’expression de Rab4b dans les lymphocytes T régule les complications métaboliques de l’obésité en changeant les sous-populations de cellules immunitaires dans le tissu adipeux. / Expendability defect of adipose tissue during obesity is at the basis of obesity-related metabolic complications. Indeed, when adipocytes reach their maximal triglyceride storage capacity, ectopic lipid depots are appearing in liver and muscles, leading to insulin resistance. Moreover, dysfunctional adipocytes secrete alarming factors leading to adipose tissue inflammation. This inflammation is sustained by adipocytes and immune cells communications that are controlled by endocytosis and intracellular trafficking. Endocytosis and its governing proteins, the Rab GTPases, could be pivotal in the regulation of adipose tissue expandability. Our team has demonstrated that Rab4b expression is reduced in obese diabetic patients and mice adipose tissues. The present work demonstrates that Rab4b is decreased in adipose tissue T cells in both obese patient and mice. The depletion of Rab4b in T cells in vivo leads to insulin resistance and lipid accumulation in liver and muscles under normal diet. These defects are due to adipogenesis inhibition by IL-6 and IL-17, which limits adipose tissue expansion. These pro-inflammatory cytokines are increased in adipose tissue of the mice depleted for Rab4b in T cells because the number of Th17 is increased at the expense of the number of regulatory T cells. We describe here a new mechanism in which Rab4b expression in T cells control obesity-related metabolic complications by tuning T cells subpopulations in adipose tissue.

Le but de ce travail de thèse a été de développer à MIRC en une capacité à observer deux aspects clefs du métabolisme cérébral chez le rongeur par spectroscopie RMN des noyaux X : le métabolisme mitochondrial du glucose à partir de l’observation du 13C et la synthèse d’ATP par observation du 31P. Ces développements s’inscrivent à la fois dans une recherche fondamentale pour améliorer notre compréhension du signal RMN et raffiner son analyse ainsi que du métabolisme cérébral chez les sujets sains. Ils s’inscrivent aussi dans une recherche translationnelle avec la possibilité d’évaluer certains aspects du métabolisme comme potentiels biomarqueurs de maladies neurodégénératives. Ces travaux ont pu être réalisés à très haut champ (11.7T) permettant d’obtenir un meilleur rapport signal à bruit. Dans un premier temps, nous présenterons le développement d’une séquence de transfert de saturation pour la mesure des flux de synthèse d’adénosine triphosphate (ATP) et de phosphocréatine (PCr). Cette séquence a été optimisée pour sélectionner avec un module de localisation ISIS le signal émis par le cerveau uniquement. Avec l’augmentation de la résolution spectrale à haut champ, cette séquence a pu être utilisée pour caractériser le phosphate inorganique extracellulaire, et prévenir un biais de quantification possible à plus bas champ. De plus, elle a permis l’observation de l’adaptation du métabolisme cérébral chez les rats transgéniques BACHD, modèles de la maladie de Huntington. Ces rats présentent une augmentation d’environ 10% de la concentration de PCr permettant de pallier à leur plus faible taux de synthèse d’ATP qui lui est diminué de moitié. Dans un second temps, la mise en place d’un pipeline automatisé d’analyse des données a permis d’explorer le modèle métabolique bicompartimental de la consommation de glucose observée en spectroscopie 13C, qui prend en compte le cycle de Krebs dans les neurones et les astrocytes. Deux corrections majeures ont été apportées au modèle traditionnel permettant d’expliquer les dynamiques à moyen et long termes. La première est la mise en évidence d’un pool de glutamate vésiculaire agissant comme tampon temporel au marquage du glutamate, la seconde est la présence d’une dilution 6 fois plus importante de pyruvate vers les astrocytes que vers les neurones. Ces résultats viennent renforcer les hypothèses entourant le couplage métabolique entre ces deux types cellulaires. Ces hypothèses ont pu être testées après l’optimisation d’une séquence d’acquisition du signal RMN des noyaux 13C par transfert de polarisation (DEPT), testée in vivo dans le cerveau du rat sain. Finalement, l’utilisation combinée de la spectroscopie 31P et 13C a été appliquée chez le rat sous intoxication chronique au 3-NP, une toxine inhibant le cycle de Krebs et utilisée comme modèle de la maladie de Huntington. / The aim of this thesis was to develop at MIRCen new capabilities to observe two key aspects of energy metabolism in rodent brains using X nuclei NMR spectroscopy: glucose consumption with 13C spectroscopy and adenosine triphosphate (ATP) synthesis with 31P measurements. These developments will be used to both expand general understanding of brain metabolism in healthy subjects but also provide technical tools to search for biomarkers in translational projects of drug development applied to neurodegenerative diseases. This work was done at very high field (11.7T) where signal to noise could be maximized. In the first part, we present the optimization of saturation transfer sequence to measure ATP synthesis rate as well as phosphocreatine (PCr) synthesis rate. With ISIS module, the signal was localized to a voxel containing only the brain, eliminating outside source of signal. With the higher spectral resolution offered by high fields, a second, extracellular pool of Pi was characterized which could prevent possible biases in flux quantification of ATP synthesis. This sequence was also applied to measure metabolic adaptation of BACHD rat models (models of Huntington’s disease, HD) where it was found that the 10% increase in PCr concentration could palliate the ATP synthase activity that is halved in this model. In the second part, we present how deeper analysis of 13C data using automatic differential equation writing script was used to better understand the bicompartmental model of glucose degradation to glutamate and glutamine, which accounts for TCA cycle in neurons and astrocytes. Two major corrections were made to the traditional model, to fit mid- and long-term unexplained dynamics. Looking at glutamate and glutamine isotopomer labeling dynamics, the necessity of adding a vesicular glutamate temporal buffer was made evident. The distinction between astrocytic and neuronal pyruvate dilution also showed that astrocytes use up to 6 times more pyruvate than neurons showing intricate metabolic coupling between the two cell types. These results have then been tested in vivo after optimization of the ISIS-DEPT sequence to observe 13C labeling in the rat brain. Finally, experiments combining 31P and 13C spectroscopy were performed on rats chronically intoxicated with 3-NP, a toxin inhibiting TCA cycle which is used as a model of HD.

Le carcinome hépatocellulaire constitue la 3ème cause de décès par cancer dans le monde. Il a été montré que des mutations activatrices du gène CTNNB1, codant la β-caténine, étaient à l’origine de 20 à 40% des CHC humains. Ces CHC sont peu prolifératifs et présentent un phénotype métabolique particulier associé notamment au développement d’une cholestase et à une absence de stéatose. De nombreuses tumeurs présentent un effet Warburg, c’est-à-dire une addiction au glucose et à la glutamine avec une hyperproduction de lactate, or il a été mis en évidence par l’équipe que les CHC activés pour la β-caténine étaient négatifs en PET-scan FDG et donc ne présentaient pas d’utilisation accrue du glucose.L’objectif de ce travail a été d’analyser la reprogrammation métabolique accompagnant la tumorigenèse β-caténine dans le foie. Nous disposons d’un modèle murin de tumorigenèse β-caténine, les souris TTR-Cre-Apclox/lox inductible au tamoxifène, dans lequel la perte d’Apc dans quelques hépatocytes conduit au développement de tumeurs β-caténine activée après quelques mois. Je dispose aussi d’un modèle dit « prénéoplasique » dans lequel la β-caténine est constitutivement active dans tout le lobule hépatique.Des analyses de flux métaboliques sur ces hépatocytes β-caténine activée a permis de mettre en évidence une absence d’effet Warburg : pas d’altération de la glycolyse ni de la production de lactate lors d’une activation anormale de la voie β-caténine. En revanche, le glucose est réorienté vers une hyperproduction de glutamine, qui n’est pas réutilisée par le cycle de Krebs. Ces hépatocytes présentent aussi une diminution de la lipogenèse avec une réorientation des acides gras produits dans la synthèse de phospholipides.D’autre part, nous avons pu mettre en évidence sur les hépatocytes et les tumeurs murines présentant une activation anormale de la β-caténine, une très forte augmentation de l’oxydation des acides gras et de la production de corps cétoniques. Cette augmentation de l’oxydation des acides gras est spécifique à la reprogrammation métabolique des CHC avec une activation anormale de la β-caténine, puisque nous ne l’avons pas retrouvée dans des CHC ne présentant pas d’hyperactivation de la β-caténine.De plus, l’invalidation d’Apc dans un modèle murin présentant un défaut d’oxydation des acides gras ne conduit pas au développement de tumeurs montrant ainsi que la -oxydation des acides gras serait primordiale pour la tumorigenèse associée à une suractivation de la -caténine. La β-caténine activerait donc un programme génique conduisant à une augmentation de l’oxydation des acides gras et cette reprogrammation métabolique est indispensable à la l’initiation tumorale. / Cancer cells are characterized by uncontrolled and rapid proliferation requiring metabolic adjustments to provide macromolecules and energy to fuel cell growth and division. Most tumors are characterized by a “Warburg effect” consisting in an addiction to glucose, at the basis for detecting them by fluorodeoxyglucose (FDG) positron emission tomography (PET) imaging. Twenty to 40% of Hepatocellular carcinomas (HCC) are caused by activating mutations in the CTNNB1 gene coding for β-catenin. They present a specific metabolic phenotype as they are cholestatic and never steatotic. But our group has observed that β-catenin activated livers were negative in FDG-PET imaging, indicating that they do not have an increased glucose consumption. The aim of this study was to determine the metabolic alterations leading to this distinctive metabolic phenotype in HCC where β-catenin is over-activated.In a mouse model, we have either activated constitutively β-catenin in the whole hepatic lobule to mimic a “preneoplasic” situation or we have abnormally activated β-catenin in few hepatocytes that will then generate tumors after 6 months. Using these two approaches, we analyzed metabolic fluxes to determine the carbon fate from different potential substrates in order to identify the source of energy and cellular components of β-catenin activated hepatocytes or tumors.Our results confirm the absence of a Warburg effect in β-catenin overactivated hepatocytes with no difference in glycolysis nor in lactate production. However, glucose is rerouted into glutamine overproduction and this glutamine is not reused in the Krebs cycle. These hepatocytes also show a decreased lipogenesis with a rerouting of neo-synthetized fatty acids into phospholipids.On the other hand, both the preneoplasic and the tumoral models displayed a sharp increase in fatty acid oxidation and ketone body production. We did not find this in HCC with no β-catenin activation, showing that this increased fatty acid oxidation is specific to β-catenin dependent metabolic reprogramming.Strikingly, β-catenin activation in the β-oxidation defective mouse model, does not lead to tumor development. The increased fatty oxidation observed in the β-catenin activated models is mandatory for β-catenin dependent tumorigenesis. We thus propose that lipids are the main source of energy that fuels β-catenin tumors. These results pave the way for treatments against β-catenin activated HCC by targeting fatty acid oxidation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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