La SRM proton constitue un outil non invasif unique pour l'exploration biochimique quantitative des tissus vivants. Les deux études présentées dans cette thèse visent à maîtriser chacune des phases impliquées depuis l’acquisition des données jusqu’à l’estimation fiable et précise des profils métaboliques des tissus explorés. Des protocoles expérimentaux d’acquisition des signaux de spectrométrie de résonance magnétique proton in vivo à temps d’écho courts ont été définis puis optimisés pour une application pré-clinique (souris) sur un imageur 4.7T et pour une étude en environnement clinique menée à 1.5T. La première étude a permis de mesurer longitudinalement les altérations des métabolites cérébraux (N-acétyl-aspartate, choline, créatine, taurine) chez un modèle murin de neuro-inflammation sur un imageur 4.7T, et la seconde étude avait pour objectif la mesure de la quantité totale et la composition lipidique hépatique en environnement clinique à 1.5T chez des sujets stéatosiques. Des méthodes d’estimation des contributions métaboliques et lipidiques adaptées aux propriétés physiques de signaux ont été validées pour chacune de ces applications. Ces méthodes sont fondées sur des algorithmes de moindres carrés non linéaires. Des stratégies multi-tirages des valeurs initiales et des contraintes ont été favorablement validées. Les atouts et les originalités de ce projet reposent sur les développements synergiques des protocoles d’acquisitions et des méthodes de traitement du signal associées. Ces développements ont pour vocation d’enrichir la palette des informations biochimiques collectées pour l’aide au pronostic et diagnostic médical / The proton MRS is a unique non-invasive method to quantitative biochemical exploration of living tissues. The studies presented in this thesis aim to handle each one of the involved steps, from data acquisition to reliable and precise metabolic profile estimation of explored tissues. Protocols for experimental acquisition of in vivo, short echo-time magnetic resonance signals were defined, and optimized for a pre-clinical application (mice) on a 4.7T scanner and for a clinical study at 1.5T. The first study allowed yo measuring cerebral metabolite (N-acetyl-aspartate, choline, creatine, taurine) alterations along time in a murine model of neuro-inflammation on a 4.7T scanner and the second study aimed to measure the total quantity and the composition of liver fat in patients with hepatic steatosis in a clinical environment at 1.5T. Signal processing methods for metabolite and fat contribution estimates, coping with physical signal properties were validated for both studies. These methods are based on non-linear least squares algorithms. Multiple starting values and constraints strategies were successfully validated. The assets and the originality of this project are based on the synergic developments of acquisition protocols and the associated signal processing methods. These developments were designed to enrich the list of the biochemical information non-invasively measured, in order to help medical prognostic and diagnostic

Des études morphologiques, phylogénétiques et des analyses phytochimiques ont été menées sur neuf espèces de lichens fruticuleux du genre Stereocaulon à partir d'échantillons provenant de zones tropicales (Indonésie, Île de la Réunion) et de zones tempérées (France, Italie). Les divers résultats et la comparaison des observations ont permis de préciser certains éléments pour la classification et la diagnose très délicate de ces lichens et de sélectionner deux espèces pour une analyse plus approfondie de leurs métabolites secondaires. L'étude phytochimique a été conduite sur S. halei et S. montagneanum, qui ont été récolté dans l'île de Sumatra. Parmi la quinzaine de métabolites isolés, certains sont communs à ces deux espèces et correspondent à un depside abondant, l'atranorine et des dérivés mono-aromatiques associés. Des depsidones différencient les deux espèces comme l'acide lobarique et des dérivés dans S. halei, l'acide lobariolcarboxylique étant isolé pour la première fois et caractérisé sous forme de conformères. Dans S. montagneanum, ce sont l'acide stictique et des dérivés qui ont été identifiés. Ces profils métaboliques différents rejoignent les résultats de l'étude phylogénétique qui distingue respectivement S. halei et S. montagneanum dans les sous-genres Aciculisporae et Holostelidium. Malgré des activités inégales, aucun des 6 composés obtenus en quantité suffisante pour des test à visée photoprotective ne montre de résultat remarquable. Certains composés de type mycrosporine ont été caractérisés dans diverses parties du pseudopodétion et pourraient aussi présenter un intérêt pour la compréhension des répartitions métaboliques au sein des lichens tripartites.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La thèse porte sur le développement de stratégies non conventionnelles de peptides contraints et la modulation des structures secondaires pour augmenter la reconnaissance biologique de ces peptides.Les peptides jouent un rôle important dans de nombreux processus et sont donc d’un intérêt grandissant pour l’industrie pharmaceutique. Cependant, leur utilisation comme médicament reste limitée à cause de leur flexibilité conformationnelle, leur sensibilité aux protéases et leur faible biodisponibilité et pharmacodynamie. Dans ce contexte, la caractérisation des interactions ligands-récepteurs est cruciale pour comprendre les processus de reconnaissance et le design d’agonistes sélectifs, potentiels nouveaux médicaments. Ainsi, le développement d’outils portant des modifications structurales présente un intérêt grandissant pour trouver de nouveaux médicaments. Ces changements structuraux permettent d’affiner les conformations privilégiées et donc de comprendre la spécificité d’interactions par rapport à des sous-types de récepteurs ayant des propriétés physicochimiques et pharmacologiques particulières.Dans la première partie de ce travail, une stratégie optimisée pour la synthèse de fragments N-terminaux (1-34) de la séquence PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 est décrite : H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. D’un point de vue synthètique, la formation de clusters dus à la présence de plusieurs résidus arginine, l’encombrement stérique, la longueur de la séquence et la présence de résidus hydrophobes dans la partie 19-28 du PTHrP rendent la synthèse difficile et donnent un enjeu important à la synthèse. C’est pourquoi, nous avons focalisé nos efforts sur l’optimisation du protocole opératoire. En particulier, nous avons montré l’intérêt d’utiliser une activation sous microondes pour la synthèse, avantages en termes de rendement et de pureté du peptide. La synthèse de PTHrP(1-34) a été optimisée à la fois sous activation par la temperature et sous microondes dans des conditions identiques. Les micoondes ont aussi été utilisé pour la synthèse de PTHrP(1-34)NH2. L’élongation de la chaine peptidique a été suivie par l’analyse UPLC-ESI-MS des fragments obtenus après micro clivage assisté par micro ondes. Cette stratégie nopus a permis , à travers la caractérisation des séquences délétées, d’identifier les points critiques de la synthèse, nécessitant les microondes. Dans la seconde partie de la thèse, ont été entreprises le design et la synthèse d’une série de cyclopeptides (i-to-i+5) 1,4- et 4,1-disubstitués pontés par un triazole, analogues de MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2 est un super agoniste agissant d’une manière non sélective des récepteurs de la mélanocortine MC1R, MC3R, MC4s, et MC5s. Ce peptide est caractérisé par un lien lactame entre les résidus Asp5 et Lys 10 stabilisant une structure β-turn, cruciale pour l’activité.Cependant MTII n’est pas sélectif des différents sous-type des récepteurs de la mélanocortine. L’importance particulière du système mélanocortine souligne le besoin de trouvé des analogues plus sélectifs, présentant une meilleure pharmacocinétique et une meilleure biodisponibilité. L’introduction du triazole [1,2,3] utilise dans nos analogues vise à stabiliser une conformation , à la place du lien lactame de MTII. La diversité est apportée par une variation de la position du triazole de i à i+5. Il est obtenu par une cycloaddition alcyne/azoture catalysée par le Cu(I) (CuAAC), générant très sélectivement l’adduit 1,4. Les analogues clickés de MTII présentant une position différente du triazole ont été synthétisé en phase solide et en solution. Les études conformationnelles et biologiques ont été conduites pour identifier l’analogue présentant la meilleure conformation β-turn conduisant à la meilleure activité biologique. / PhD Thesis of Chiara TESTANon conventional synthetic strategies of stapled peptides: modulation of secondary structures to optimise biological recognitionPeptides play an important role in many biologically relevant processes and are of outstanding interest in pharmaceutical research. However their use as drugs is limited by their conformational flexibility, instability to proteases, poor oral bioavailability, and pharmacodynamics. In this contest the characterization of ligand-receptor interactions is crucial to understand the biological processes and to design potent and selective agonist, which could be used as new drug candidates.Therefore, the development of an expansive toolbox of structural modifications that can be used to fine tune the predominant conformations to achieve modulation of specificity toward receptor subtypes, physicochemical and pharmacological properties continues to be of great interest in the development of peptide-based drugs.In the first part of the work it is described an optimized strategy for the synthesis of the N-terminal fragments (1-34) of PTHrP.PTHrP(1-34)NH2 sequence is: H-Ala1-Val-Ser-Glu-His-Gln-Leu-Leu-His-Asp10-Lys-Gly-Lys-Ser-Ile-Gln-Asp-Leu-Arg-Arg20-Arg-Phe-Phe-Leu-His-His-Leu-Ile-Ala-Glu30-Ile-His-Thr-Ala-NH2. Considering the presence of clusters of arginines, sterically hindered and hydrophobic amino acid residues in the 19-28 sequence of PTHrP, and the considerable length of the peptide, the synthesis of PTHrP(1-34)NH2 is quite challenging. Therefore we focused our effort in the optimization of a synthetic protocol for this peptide. In particular, we showed the advantages that the use of microwaves have, in obtaining the best results in terms of yield and purity of the final peptide. The synthesis of PTHrP(1-34) was performed following the conventional RT and the MW-assisted SPPS protocol. In both cases the synthesis was performed using the same instrument, the same excess of reagents and molar ratios.Microwaves have also been used to monitor the synthesis of the peptide PTHrP(1-34)NH2. In fact, during the elongation of the peptide chain were analyzed by UPLC-ESI-MS intermediate fragments obtained through micro-cleavages assisted by microwaves. This strategy has allowed us, through the characterization of sequences of deletion, to understand what are the critical points of the synthesis that may require the use of microwaves.In the second part of the thesis we reported the design and the synthesis of a series of (i-to-i+5) 1,4- and 4,1-disubstituted [1,2,3]triazole-bridged cyclopeptides, derived from the scaffold of MTII. MTII, Ac-Nle4-c[Asp5-D-Phe7-Lys10]αMSH4-10-NH2, is a potent long acting non-selective super-agonist of melanocortin receptors MC1R, MC3R, MC4s, and MC5s. This peptide is characterized by lactam bridge between residues Asp5 and Lys10 stabilizing a type-II β-turn structure, that is critical for its bioactivity. Nevertheless, MTII is not selective for the different subtype of melanocortin receptors. The particular importance of melanocortin system, underscores the unmet need for highly selective, pharmacokinetically diverse, and bioavailable agonists and antagonists analogs. The introduction of [1,2,3]triazole was aimed to stabilize a β-turn conformation replacing the lactam bridge of MTII with an i-to-i+5 side chain-to-side chain cyclization via CuI-catalyzed azido-to-alkyne 1,3-dipolar cycloaddition (CuAAC) generating 1,4- or 4,1-disubstituted [1,2,3]triazolyl-containing ring structures. Clicked MT-II analogs presenting different permutations of bridges, containing 4 or 5 methylenes, and a triazolyl moiety were synthesized by a combination of solid phase assembly of the peptide and in solution CuAAC. Conformational and biological studies were performed on the peptides synthesized to identify the location and direction of the [1,2,3]triazolyl in the bridge that best reproduce the β-turn conformation leading to highly potent and sel

La présente étude a pour objectif de mettre en évidence l‘intérêt du suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des métabolites thiopuriques en vue de l‘optimisation du traitement par l‘azathioprine chez les enfants atteints de maladie inflammatoire de l‘intestin et d‘hépatite autoimmune. Les travaux réalisés nous ont permis de montrer, en utilisant une analyse multi-niveaux, une corrélation significative entre la dose d‘azathioprine et les concentrations en 6-TGN et Me6-MPN ainsi qu‘avec le ratio Me6-MPN/6-TGN confortant l‘utilisation des métabolites pour ajuster la posologie d‘azathioprine chez les enfants présentant une maladie inflammatoire de l‘intestin. Différents facteurs pouvant modifier les concentrations de métabolites thiopuriques ont été identifiés. La co-administration d‘infliximab a conduit à une augmentation significative des concentrations de 6-TGN. Des concentrations plus faibles de 6-TGN ont été observées chez les jeunes enfants suggérant l‘influence de l‘âge sur le métabolisme ou sur l‘absorption de l‘azathioprine. Nous avons également montré qu‘une concentration de 6-TGN supérieure à 405 pmol/8.108RBCs chez des patients ayant une activité TPMT normale et pour lesquels la rémission clinique n‘a pas pu être obtenue en l‘absence de stéroïdes, était prédictive d‘une résistance à l‘azathioprine. Un seuil de 250 pmol/8.108RBCs en 6-TGN est significativement associé à une meilleure réponse thérapeutique. D‘autre part, une corrélation a été observée entre les métabolites thiopuriques et la leucopénie. Chez les enfants atteints d‘hépatite autoimmune, une corrélation positive entre la dose d‘azathioprine et les concentrations de métabolites a été retrouvée. L‘importante variabilité inter-individuelle dans les concentrations en métabolites thiopuriques et dans la réponse thérapeutique a été confirmée démontrant l‘intérêt d‘une individualisation de la thérapeutique. L‘instauration d‘un STP des métabolites thiopuriques associé au suivi hématologique, à la détermination de la TPMT et au suivi clinique paraît justifié afin d‘optimiser la thérapeutique par l‘azathioprine dans la population pédiatrique / The present study aimed to investigate the usefulness of thiopurine metabolite monitoring in pediatric inflammatory bowel disease (IBD) and Autoimmune Hepatitis (AIH) for optimizing azathioprine therapy. Using multilevel analysis, we demonstrated for the first time the significant positive correlations between the weight-based azathioprine dosage and the 6-thioguanine nucleotide (6-TGN) and 6-methyl-mercaptopurine (6-MeMPN) levels as well as 6-MeMPN/6-TGN ratio, supporting the use of metabolites to adjust dosing in IBD children. Other factors affecting metabolite levels were also identified. Co-administration of infliximab resulted in a significant increase in 6-TGN levels. Younger children exhibited lower metabolite levels, suggesting the influence of age on metabolism/absorption of azathioprine. We also reported that a 6-TGN level above 405 pmol/8.108RBCs in IBD children with normal TPMT activity who did not achieve steroid-free clinical remission was predictive of azathioprine refractoriness. A cut-off of 250 pmol/8.108RBCs for 6-TGN was found to be significantly associated with higher therapeutic response. Moreover, both 6-TGN and 6-MeMPN levels were correlated with leucopenia. In AIH children, a positive correlation between azathioprine dosage and metabolite levels was also observed. The wide variability in thiopurine metabolites and therapeutic response in both IBD and AIH children was confirmed, pointing to the important role of treatment individualization. Monitoring of thiopurine metabolites combined with hematological tests, TPMT activity and clinical evaluation may be of interest for optimizing thiopurine therapy and minimizing toxicity in IBD and AIH children

La baisse de la production et la prolifération des maladies engendrées par le changement climatique dans la caféiculture, particulièrement pour Coffea arabica, conduit à chercher de nouvelles pratiques culturales et étudier la réponse adaptative des caféiers aux modifications environnementales. En se basant sur l’importance des composés phénoliques dans la réponse des plantes aux stress et sur la richesse des caféiers en ces composés antioxydants, la réponse adaptative des caféiers cultivés en plein champ a été étudiée en s’intéressant à l’évolution du contenu des feuilles en ces composés dans différentes conditions de culture simulées par un gradient altitudinal, des cultures sous ombrage ou l’obtention de plants greffés. Les analyses biochimiques montrent que certains composés phénoliques s’accumulent dans les feuilles en réponse à la modification d’un paramètre météorologique spécifique. Ainsi, acides chlorogéniques et flavanols sont plus accumulés en cas de sécheresse alors que les flavonols glycosylés s’accumulent sous forte radiation solaire. La comparaison avec C. canephora permet de valider ces marqueurs. Les analyses transcriptomiques indiquent une différence d’expression des gènes de biosynthèse de ces composés suivant le stade de croissance de la feuille. Elles montrent également que la réponse à la lumière passe par la surexpression de nombreux gènes codant des HSP ainsi que ceux impliqués dans la photosynthèse et la glycosylation des flavonoïdes. Enfin, ces résultats montrent l’intérêt, suivant l’altitude, de l’ombrage et du greffage pour la culture de C. arabica. / The decline in production and the proliferation of diseases caused by climate change in coffee growing, especially for Coffea arabica, leads to search new cultural practices and to study the adaptive response of coffee trees to environmental changes. Based on the importance of phenolic compounds in the response of plants to stress and the richness of coffee in these antioxidant compounds, the adaptive response of coffee grown in the field was studied by looking at the evolution of the leaf content in these compounds under different culture conditions simulated by an altitudinal gradient, shaded cultures or obtaining grafted plants. Biochemical analyzes show that certain phenolic compounds accumulate in the leaves in response to the modification of a specific meteorological parameter. Thus, chlorogenic acids and flavanols are more accumulated in case of drought while glycosylated flavonols accumulate under strong solar radiation. The comparison with C. canephora validates these markers. Transcriptomic analyzes indicate a difference in expression of the biosynthesis genes of these compounds according to the stage of growth of the leaf. They also show that the response to light is the overexpression of many genes encoding HSPs as well as those involved in photosynthesis and flavonoid glycosylation. Finally, these results show the interest, according to altitude, of shading and grafting for the cultivation of C. arabica.

Les bactéries du genre Nocardia sont des Actinobactéries filamenteuses. Ces microorganismes sont saprophytes du sol. Les infections à Nocardia ou nocardioses se manifestent dans la majorité des cas (60%) par des infections pulmonaires et plus rarement par des infections cérébrales. La souche Nocardia cyriacigeorgica GUH-2 à causé la mort d’un patient dans les années 70. Des études sur cette souche ont montré qu’elle avait un haut pouvoir pathogène et qu’elle était capable dans certaines conditions de déclencher chez la souris et les primates le développement de troubles moteurs similaires à ceux observés dans la maladie de Parkinson. Afin d’appréhender l’implication de l’espèce pathogène opportuniste N. cyriacigeorgica dans l’une des plus importantes maladies neurodégénératives du 21ème siècle, le séquençage du génome de la souche N. cyriacigeorgica GUH-2 à été entrepris. Il a permis l’identification d’un grand nombre de gènes liés à la virulence et à la résistance aux antibiotiques ainsi que l’identification d’ilots génomiques et de séquences d’insertions reflétant une plasticité plus grande que celle qui était décrite pour ce genre bactérien. L’étude de groupements de gènes impliqués dans la production de métabolites secondaire a montré que ces molécules pourraient être responsables des propriétés neurodégénératives de la souche. L’espèce de N. cyriacigeorgica étant retrouvée fréquemment en clinique sans que son réservoir naturel n’ai été mis en évidence à ce jour, la mise au point de marqueurs de détection génétique a été réalisé afin de permettre la recherche de la niche écologique de cette espèce mais également de faciliter le diagnostic des nocardioses. / Nocardia are filamentous-growing Gram-positive soil saprophytes that belong to Actinobacteria. Nocardial infections or nocardiosis are lung infections in most of the cases (60%) and more rarely brain infections. Nocardia cyriacigeorgica strain GUH-2 had cause the death of a patient in the 70's. Studies have shown that its strain had a high pathogenicity and the ability to trigger the development of motor disorders in mice and primates similar to those seen in Parkinson's disease.In order to understand the involvement of this opportunistic pathogen in one of the major neurodegenerative diseases of the 21st century, the genome of the strain N. cyriacigeorgica GUH-2 was sequenced. It allowed the identification of a large number of genes related to virulence, antibiotic resistance and the identification of genomic islands and insertion sequences reflecting a greater plasticity that it was previously described for this bacterial genus. The study of clusters of genes involved in the production of secondary metabolites showed that these molecules could be responsible for the neurodegenerative properties of the strain. N. cyriacigeorgica species is frequently encountered in the clinic without its natural reservoir has been identified to date. The development of genetic markers for detection was carried out to allow the search for the habitat of this species but also to facilitate the diagnosis of nocardiosis.

Diagnostiquer précocement les maladies est un défi à relever pour améliorer la prise en charge des patients concernés et leur offrir une meilleure qualité de vie. Les analyses 'omiques', qui quantifient globalement, simultanément et sans a priori l'abondance de milliers de molécules dans les liquides biologiques, s'avèrent très prometteuses pour l'identification de biomarqueurs précoces des maladies complexes. Dans ce contexte, mon travail de thèse avait pour objectif de développer des outils de diagnostics, à partir d'analyses du peptidome et métabolome urinaire, pour détecter précocement la présence d'une maladie rénale chronique (MRC) et la survenue de ses complications cardiovasculaires. La première étude, insérée dans le projet européen 4C (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), s'est centrée sur les complications cardiovasculaires associées à la MRC en pédiatrie. Ces complications constituent la principale cause de mortalité des enfants en insuffisance rénale, et leur diagnostic précoce est impossible à ce jour. En analysant par électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse (CE-MS) le peptidome urinaire de 86 enfants souffrant, ou non, de complications cardiovasculaires secondaires à la MRC, nous avons identifié des peptides qui permettent de prédire à l'avance les patients à haut risque cardiovasculaire : 190 peptides étaient associés à l'épaississement de la paroi carotidienne (AUC 0.87, sensibilité 80%, spécificité 100%) et 22 peptides prédisaient l'augmentation de la rigidité artérielle (AUC 0.83, sensibilité 83%, spécificité 70%). Le second projet relevait de la médecine vétérinaire. Dans cette étude menée sur 50 chiens avec et sans MRC, nous avons caractérisé pour la première fois le peptidome urinaire canin via la technologie CE-MS et nous avons découvert 133 peptides urinaires associés à la MRC. Ces derniers ont permis de diagnostiquer la présence d'une MRC dans 80% des chiens. Les métabolites sont mieux corrélés au phénotype que les autres strates moléculaires. Cependant l'apport de la métabolomique en clinique est encore limité, dû au manque de technologies analytiques performantes. Le troisième objectif de ma thèse était donc de mettre au point une procédure de dosage par CE-MS des métabolites urinaires. Grâce à une méthode unique de normalisation interne, basée sur l'utilisation de métabolites endogènes stables, il est maintenant possible d'analyser le contenu en métabolites d'un même échantillon urinaire avec une très haute reproductibilité sur le long terme (4 ans). Comme preuve de concept, nous avons mis en évidence, via cette procédure, la présence d'une combinaison de 32 métabolites dans l'urine qui permet de repérer avec une sensibilité de 76% et une spécificité de 86% les nouveau-nés porteurs d'une malformation rénale obstructive. Enfin, la quatrième problématique s'inscrivait dans une démarche translationnelle. Son but était de développer des aptasenseurs capables de détecter avec de hautes affinités et spécificités les biomarqueurs d'origine omique, pour un diagnostic simple, rapide et à moindre coût. La cible choisie était un fragment urinaire de l'alpha-1-antitrypsine, qui est ~1000 fois plus abondant chez les adultes atteints de MRC que les chez les sains. La sélection de l'aptasenseur s'est faite par le Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Nous présentons ici les travaux préliminaires de la mise au point du SELEX sur cette cible. En conclusion, cette thèse démontre le potentiel de l'analyse du contenu urinaire en peptides et métabolites pour le diagnostic précoce des pathologies complexes telles que la MRC et les complications cardiovasculaires associées. De plus l'obtention d'aptasenseurs dirigés contre ces biomarqueurs précoces et utilisables au chevet du patient devrait révolutionner dans le futur les méthodes diagnostiques. / Early diagnosis of diseases is a big challenge to improve patients' health and quality of life. 'Omics' analyses, which allow the global and simultaneous quantification of the relative abundance of thousands of molecules in biological fluids are promising for the identification of early biomarkers of complex diseases. In this context, the objective of my thesis was to develop diagnostic tools, based on urinary peptidome and metabolome analyses, for the early detection of chronic kidney disease (CKD) and associated cardiovascular complications. The first study, as part of the 4C European project (Cardiovascular Complications in Children with Chronic kidney disease), focused on analyzing the cardiovascular complications associated to CKD in children. These complications are the main cause of mortality in children with CKD and their early diagnosis is impossible for now. Analysis of the urinary peptidome of 86 children with or without cardiovascular complications associated to CKD by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry (CE-MS), led to the identification of two sets of peptides for the early prediction of high cardiovascular risk in pediatric patients: 190 peptides were associated to an increase of the carotid intima-media thickness (AUC 0.87, sensitivity 80%, specificity 100%) and 22 peptides were associated to an increase in arterial stiffness (AUC 0.83, sensitivity 83%, specificity 70%). The second study falls in the field of veterinary medicine. In this study, carried out on 50 dogs with or without CKD, we analyzed for the first time the canine urinary peptidome using the CE-MS technology. We identified 133 urinary peptides associated to CKD allowing an accurate diagnosis of CKD in 80% of the dogs. Metabolites correlate best to phenotype compared to other molecular traits. However, the use of metabolomics for identification of clinically relevant biomarkers is very limited due to the lack of high-performance analytical technologies. The third part of my thesis was to develop a procedure for the quantification of urinary metabolites by CE-MS. Using a unique method of internal normalization based on endogenous and stable metabolites, we can now analyze the metabolite content of the same urine sample with a high reproducibility over the long-term (4 years). As a proof-of-concept, we demonstrated that this developed procedure led to the identification of a set of 32 urinary metabolites that allow the early identification of newborns with an obstructive kidney anomaly with a sensitivity of 76% and a specificity of 86%. Finally, the fourth study was dedicated to improving translational research. The aim was to develop aptasensors able to detect 'omics'-identified biomarkers with a high affinity and specificity to obtain a simple, rapid and low-cost diagnostic test. The biomarker chosen as target is a urinary fragment of alpha-1-antitrypsin, which is ~1000 more abundant in adults with CKD compared to healthy subjects. Aptasensors were selected by the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX). Here we present preliminary work on the development of the SELEX for our target. In conclusion, this thesis shows the strength of the urinary content, in terms of peptides and metabolites, for the early diagnosis of complex pathologies like CKD and the associated cardiovascular complications. Moreover, the selection of aptasensors targeting these early biomarkers and that can be used at bedside, will revolutionize future diagnostic methods.

La carotte, légume racine le plus consommé au monde, voit sa production fortement impactée par diverses maladies dont la brûlure foliaire. Cette maladie, provoquée par le champignon nécrotrophe Alternaria dauci, est considérée comme la plus préjudiciable des maladies foliaires de la carotte. Développer des variétés présentant un niveau de résistance fort et durable à cette maladie est l'un des objectifs principaux des sélectionneurs, notamment en cumulant différentes résistances partielles dans un même génotype. Afin d'optimiser un tel cumul, il est nécessaire de comprendre les mécanismes associés à ces résistances. Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'implication de métabolites de défense produits par la carotte dans la résistance partielle de la plante à A. dauci. Nous avons montré un effet inhibiteur de la 6- méthoxymelléine (6-MM) et du falcarindiol, sur le développement du champignon. Cet effet est plus important avec le falcarindiol. De plus, la teneur en falcarindiol est supérieure chez le génotype résistant (Boléro) en comparaison avec le génotype sensible (Presto) et, suite à l'inoculation de la plante par A. dauci, la 6-MM s'accumule de façon plus importante dans les feuilles du génotype résistant. Ces molécules de défense pourraient ralentir le développement du champignon et participer ainsi à la résistance. Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l'effet de métabolites toxiques produits par le champignon sur des cultures cellulaires de carotte. Nos résultats montrent une corrélation entre le comportement des cellules traitées (viabilité cellulaire, embryogenèse somatique et activité enzymatique) et la sensibilité/résistance des génotypes évaluée au niveau de la plante entière. Parmi les génotypes les plus résistants au champignon, le génotype I2 résiste mieux à l'application d'extraits fongiques que le génotype K3. Ainsi, la résistance partielle de la carotte face à A. dauci semble inclure des résistances aux toxines. Dans le dernier chapitre, nous avons recherché un lien entre la résistance partielle et les mécanismes de défense de la plante, en particulier ceux liés à la voie des jasmonates. Nos premiers résultats montrent la surexpression du gène PR4 chez le génotype résistant K3, comparativement aux autres génotypes, y compris I2. Nous avons par ailleurs recherché des sites polymorphes (SNP) dans les séquences de quatre gènes de défense. Deux gènes (PAL, GLP) présentent un polymorphisme de séquence entre génotypes. Dans le cas de GLP, les SNPs mis en évidence permettent de différencier un génotype sensible (H1) du génotype K3. L'ensemble de ces résultats semble indiquer la présence d'une diversité des modalités de la résistance partielle de la carotte face à A. dauci. Ainsi, la résistance aux toxines semble jouer un rôle plus important chez I2 que chez K3. Inversement, la résistance de K3, et non celle de I2, semble impliquer la voie des jasmonates. Audelà de leur application en amélioration, ces travaux jettent une lueur sur les mécanismes de la résistance partielle, mécanismes encore très peu connus, même parmi les interactions modèles.

Introduction : La présence des moisissures et de leurs mycotoxines dans les matrices complexes de papiers est peu étudiée. Notre travail a porté sur la recherche de mycotoxines sur les papiers patrimoniaux altérés par le foxing et les papiers peints moisis issus de logements dont les habitants ont été diagnostiqués comme porteurs de symptômes allergiques et du syndrome des bâtiments malsains. Objectifs : Identifier les espèces fongiques de ces deux types de supports papiers et y déterminer la production de métabolites fongiques. Matériels et Méthodes : Le foxing a été caractérisé par des techniques pluridisciplinaires (physiques, biologiques, bioanalytiques, tests de cytotoxicité). Les métabolites fongiques dans les extraits hydro-organiques de ces papiers ont été recherchés et identifiés par spectrométrie de masse afin d'évaluer s'ils pouvaient être reliés aux espèces fongiques détectées par microbiologie. Puis le risque toxique de ces extraits de papiers a été évalué sur un modèle cellulaire in vitro. Résultats : Pour le foxing, nous avons pu en exclure une origine métallique et montrer que les micro-organismes présents dans celui-ci sont essentiellement des espèces fongiques. Pour les papiers peints, des pics relatifs à des métabolites fongiques ont été retrouvés. Grâce à l'ensemencement individuel d'espèces fongiques sur papier peint et à l'aide de la MS2, nous avons pu relier les composés de m/z 401 et 487 à S. chartarum. Les tests de cytoxicité ont montré une augmentation significative de la cytotoxicité des cellules A549 avec certains papiers peints moisis par rapport au papier peint témoin. Les cellules A549 ont montré une surexpression du TNF-α, de l'IL-8 et du CYP 1A1, après contact avec ces mêmes papiers peints. Discussion-Conclusion : Nous n'avons détecté aucune mycotoxine dans le foxing excluant ainsi d'éventuels liens entre inhalation de mycotoxines émanant de vieux manuscrits et symptomatologie respiratoire. Pour les habitants des logements et leurs symptômes respiratoires, il est difficile de les relier à une espèce fongique donnée ou à un métabolite donné, bien que S. chartarum ait pu être mis en cause. Ces premiers résultats doivent être confirmés par des études ultérieures