Les métastases sont une cause majeure de décès dans le cas du cancer. En effet, ces tumeurs secondaires peuvent se développer dans divers organes, distants de la tumeur primaire, et surviennent à des temps différents au cours de la croissance de la tumeur primaire. De nombreuses techniques d’imagerie biomédicale peuvent être utilisées pour les détecter. Parmi celles-ci, l’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) a l’avantage de ne pas utiliser de rayonnements ionisants et permet de forts contrastes entre des tissus mous différents. Toutefois il est encore nécessaire de développer de nouvelles techniques IRM pour mieux caractériser les tumeurs, obtenir des données quantitatives, et réduire drastiquement les durées d’examen. Parmi les caractéristiques biophysiques mesurables par IRM, le temps de relaxation T1 semble être un bio-marqueur de l’efficacité d’une thérapie anti-cancéreuse. Cependant, sa mesure est généralement trop chronophage pour être utilisée en imagerie préclinique sur des cohortes d’animaux, ou pour une utilisation en routine clinique. Cette thèse a porté sur le développement d’une séquence de quantification T1 fiable et rapide. Elle a été appliquée pour détecter et caractériser des métastases chez la souris avec comme pré-requis de générer des images avec une résolution spatiale élevée, d’être insensible aux mouvements respiratoires et de permettre des mesures reproductibles du T1. La séquence Magnetization Prepared 2 Rapid Acquisition Gradient Echoes (MP2RAGE) à encodage cartésien a donc été choisie pour son fort potentiel de quantification T1, sa robustesse aux hétérogénéités de champ magnétique, et pour obtenir rapidement des cartes paramétriques en 3D. L’influence des paramètres de la séquence a d’abord été évaluée par simulations. Puis la séquence a été modifiée pour être compatible avec une méthode d’accélération appelée acquisition comprimée. Cette méthode a alors été utilisée soit pour réduire le temps d’acquisition des cartes T1, soit pour en améliorer la résolution spatiale. Cette nouvelle séquence MP2RAGE a alors été utilisée à 7T pour détecter et caractériser des métastases cérébrales disséminées dans le cerveau de souris. Pour détecter des métastases hépatiques, l’encodage cartésien initial s’est avéré trop sensible aux mouvements respiratoires. Il a donc été remplacé par un encodage radial, nécessitant une adaptation du schéma de reconstruction des cartes T1. Ainsi, des cartes T1 3D de l’abdomen entier de souris ont été obtenues en 9 minutes. Un suivi longitudinal de métastases hépatiques a montré des hétérogénéités de T1 inter- et intra-métastatiques. Pour une accélération supplémentaire, la séquence a été développée avec un encodage multi-coupe 2D, permettant ainsi d’utiliser les nombreux temps-morts présents dans le chronogramme. Des optimisations des paramètres de la séquence ont permis d’obtenir 6 cartes T1 en 9 s in vivo sur le cerveau et l’abdomen de souris. De plus, une étude préliminaire a montré qu’elle permettait de réaliser de la thermométrie. Une première perspective de ces travaux consiste à transférer cette séquence sur un aimant de recherche clinique. Une autre perspective serait de développer une séquence multi-coupe 3D radiale, accélérée par acquisition comprimée, applicable sur le petit-animal comme chez l’humain. Celapermettrait d’allier efficacité de la séquence, forte résolution spatiale et robustesse aux mouvements pour un large éventail d’applications. / Metastases are a leading cause of death in the case of cancer. Indeed, these secondary tumors can develop in various organs, distant from the primary tumor, and occur at different times during the growth of the primary tumor. Many biomedical imaging techniques can be used to detect them. Among these, Magnetic Resonance Imaging (MRI) has the advantage of not using ionizing radiation and allows strong contrasts between different soft tissues. However, it remains necessary to develop new MRI techniques to better characterize tumors, obtain quantitative data and to drastically reduce exam times. Among the biophysical characteristics measurable by MRI, the T1 relaxation time seems to be a biomarker of the efficiency of an anti-cancer therapy. However, its measurement is generally too time consuming to be used in preclinical imaging on cohorts of animals, or for routine clinical use. This thesis therefore had the challenge of developing a reliable and rapid T1 quantification sequence. It has been applied to detect anc characterize metastases in mice with the prerequisites of generating images with high spatial resolution, being insensitive to respiratory movements and allowing reproducible T1 measurements. The Magnetization Prepared 2 Rapid Acquisition Gradient Echoes sequence (MP2RAGE) with Cartesian encoding was therefore chosen for its high T1 quantitation potential, its robustness to magnetic field heterogeneities, and its ability to quickly obtain 3D parametric maps. First, simulations were performed to evaluate the influence of sequence parameters. Then the sequence was modified to be compatible with an acceleration method called Compressed Sensing. This method was then used either to reduce the acquisition time of the T1 maps, or to improve the spatial resolution. This new MP2RAGE sequence was then applied at 7T to detect and characterize disseminated brain metastases in the mouse. The initial Cartesian encoding proved to be too sensitive to respiratory movements to detect liver metastases. It was therefore replaced by a radial encoding, which required an adaptation of the reconstruction scheme of the T1 maps. Thus, 3D T1 maps of the entire abdomen of mice were obtained in 9 minutes. Longitudinal follow-up of hepatic metastases showed inter and intra-metastatic T1 heterogeneities. For an additional acceleration, the sequence was developed with a 2D multi-slice encoding, thus allowing to use the many dead times present in the chronogram. Optimizations of the parameters of the sequence made it possible to obtain 6 T1 maps in 9 s in vivo on the brain and the abdomen of mice. In addition, a preliminary study showed a possible application for thermometry. A first perspective of this work is to transfer this sequence to a clinical research MRI system. Another perspective would be to develop a 3D radial multi-slice sequence, accelerated by Compressed Sensing, applicable to small animals as in humans. This would combine sequence efficiency, high spatial resolution and robustness to movements for a wide range of applications.

Alors que le rôle dans la protection contre des pathogènes par le système immunitaire est bien compris, son rôle dans la progression tumoral est bien plus complexe avec certains mécanismes protecteurs tandis que d’autres sont néfastes. Le principal rôle physiologique du cerveau est lui de percevoir et intégrer les stimuli physiques et sociaux, d’intégrer ces signaux et de moduler l’activité des processus physiologiques de l’organisme pour s’adapter à ces conditions. Bien que les systèmes nerveux et immunitaires aient longtemps été considérés comme fonctionnant indépendamment, de multiples études cliniques et précliniques ont formellement démontré que ces deux systèmes pouvaient se réguler réciproquement. Bien que de nombreuses études visent à mieux comprendre les interactions entre les systèmes nerveux et immunitaire, de nombreuses questions restent sans réponses. Alors que les études cliniques ont prouvé un rôle positif dans la progression tumorale du bien-être, les mécanismes moléculaires ne sont pas encore compris. De plus, de nombreuses études ont essayé de trouver si les cytokines pouvaient être utilisées comme biomarqueurs diagnostic ou prédictif de la réponse au traitement dans les maladies psychiatriques, aucune cytokine étudiée à cette date n’a été démontrée comme suffisamment sensible ou spécifique pour être utilisée comme test diagnostique. Au cours de mes travaux de thèses, j’ai travaillé sur deux projets distincts étudiant les relations entre systèmes nerveux et immunitaires. Le but de mon premier projet a été d’identifier des mécanismes par lesquels un environnement enrichi (EE) associé à une meilleure activité sensorielle, cognitive et motrice pouvait impacter la progression métastatique chez la souris. Nous avons découvert que l’EE avait un effet protecteur dans la prise métastatique pulmonaire. Cette protection est associée à une diminution du niveau de corticostérone sérique, une augmentation de l’inflammation pulmonaire après extravasation de cellules tumorales circulantes. Cette protection est abolie en absence de signalisation sur récepteur aux glucocorticoïdes dans les monocytes inflammatoires. Alors que les monocytes inflammatoires sont généralement décrits comme favorisant la progression tumorale, ils peuvent aussi avoir une action antitumorale, suggérant que leur rôle est bien plus complexe qu’actuellement décrit. Nos résultats ont mis en avant un mécanisme antitumoral de reprogrammation dépendant des glucocorticoïdes des monocytes inflammatoires inhibant la progression métastatique. Mon second projet avait pour but d’identifier des biomarqueurs de la réponse aux traitements de patients ayant un premier épisode psychotique (FEP). Nous avons eu la possibilité d’accéder une cohorte de sérums et données cliniques de 325 patients FEP, tous les patients ont été traités avec le même antipsychotique. Nous avons d’abord utilisé une approche de clustering hiérarchique non supervisé pour stratifier les 325 patients dans 4 sous-groupes en utilisant uniquement leur symptomatologie. Un sous-groupe (C1A) après comparaison avec le reste de la cohorte, montre une symptomatologie plus sévère ainsi qu’un taux de réponse le plus faible après 4 semaines de traitement. Le groupe C1A montre aussi une augmentation du niveau de plusieurs biomarqueurs sériques pro-inflammatoire permettant une validation externe de cette stratification. L’utilisation de 6 variables biologiques (IL-15, protéine c-réactive, CXCL-12, niveaux d’IgG anti CMV et anti Toxoplasma gondii) et de 2 variables cliniques (Âge et utilisation de drogues récréationnelle) a permis de prédire la réponse après traitement. La précision de prédiction après validation croisée est très bonne avec une aire sous courbe moyenne de 81.0% (± 0.05). Une confirmation de ces résultats dans d’autres essais cliniques pourrait amener le développement d’une nouvelle approche basée sur le dosage de biomarqueurs sériques dans le choix du traitement chez les patients psychotiques. / While the immune system is well known for its protective role against infectious pathogens, its role in cancer progression is more complex with some immune mechanisms being protective while others are detrimental. The primary physiological role of the brain is to perceive external physical and social conditions, assess their implications for organismal well-being and modulate the activity of internal physiological processes to optimally adapt to those external conditions. Immune and the nervous systems have long been considered to operate independently from each other, many preclinical and clinical studies have clearly demonstrated that these two systems interact and regulate each other. Despite more and more studies aim at investigating the interactions between the nervous and the immune systems, important issues remain to be elucidated. For example, while human studies have demonstrated a positive impact of well-being on cancer progression, the underlying molecular mechanisms have not been elucidated. On another topic, and while many investigators have investigated whether cytokines could be used as diagnosis or prognosis biomarkers is psychiatric diseases, none of the cytokine studied to date have proven to possess the sensitivity and specificity expected for an accepted diagnostic test value. During my PhD, I have worked on two different projects both related to the interactions between the nervous and the immune system. The goal of my first project was to elucidate the mechanisms by which enriched environment conductive to enhanced sensory, cognitive and motor stimulation impact metastatic progression in mice. We have found that mice housed in enriched environment were protected from lung metastasis. Protection was associated with lower serum corticosterone levels, increased lung inflammation following extravasation of circulating tumour cells, and rapid killing of early infiltrating tumour cells. Protection was abolished when inflammatory monocytes were deficient in glucocorticoid receptor signalling. Thus, while inflammatory monocytes have been shown to promote cancer progression, our results disclosed a novel anti-tumour mechanism whereby glucocorticoid receptor-dependent reprogramming of inflammatory monocytes can inhibit cancer metastasis. The goal of my second project was to identify immune-related biomarkers of remission in first-episode psychotic (FEP) patients. To this aim, we have taken advantage of our privileged access to clinical data and serum samples from 325 FEP patients who have all been treated with an atypical antipsychotic. We have first used a hierarchical unsupervised clustering approach to stratify 325 FEP patients into four subtypes based on their clinical symptoms. Compared to the rest of the cohort, one subtype (C1A) exhibited more severe positive and negative symptoms and were the most at risk of being non-remitters following treatment for 4 weeks. C1A patients also exhibited higher levels of several pro-inflammatory biomarkers therefore providing an external validation to our clustering approach. Most importantly, six biological variables (serum levels of IL-15, C reactive protein, CXCL-12, anti- cytomegalovirus and anti-Toxoplasma immunoglobulins) and two clinical variables (age, recreational drug use), predicted early remission following treatment with Amisulpride in C1A patients. Prediction accuracy assessed by cross-validation calculated by 10,000 iterations of 4-fold cross-validation was very good with a mean area under the curve (AUC) of 81.0% ± 0.05. Further validation of our results in future clinical trials would pave the way for the development of a blood-based assisted clinical decision support system for the choice of treatment in psychotic patients.

Le mélanome uvéal (MU) est une tumeur rare, affectant 500 à 600 nouveaux cas par an en France, mais il s’agit de la tumeur intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Cette tumeur est due à la transformation des mélanocytes dérivés de la crête neurale et localisés dans l’uvée (choroïde, corps ciliaire et iris). C’est une tumeur très agressive puisque, malgré le traitement de la tumeur primaire, jusqu’à 50% des patients développeront des métastases hépatiques. En effet, malgré les nombreux efforts fournis pour le développement de nouvelles thérapies, celles-ci se sont révélées jusqu’à présent peu efficaces. Ainsi, une meilleure compréhension du processus métastatique et l’identification des gènes impliqués dans celui-ci sont des enjeux importants pour permettre le développement de nouvelles thérapies. Une analyse transcriptomique réalisé dans le laboratoire a permis d’identifier la phosphatase PRL-3 dont la surexpression est en corrélation avec le développement métastatique et le mauvais pronostic de survie des patients. Des études fonctionnelles ont montré que les cellules de MU exprimant PRL-3 avaient une capacité de migration et d’invasion accrue par rapport aux cellules exprimant une forme mutante catalytiquement inactive de la phosphatase. L’implication de PRL-3 dans le développement tumoral et le processus métastatique a été très largement décrite dans de nombreux cancers et son mécanisme d’action et ses cibles sont en cours d’investigation. De façon intéressante, certaines cibles de PRL-3 sont des protéines liées au cytosquelette. Dans le but d’identifier de nouvelles cibles de PRL-3 dans le MU, nous avons réalisé une analyse phosphoprotéomique qui nous a permis de mettre en évidence la protéine CRMP2. CRMP2 est une protéine liée au cytosquelette dont le rôle a majoritairement été décrit dans le système nerveux. CRMP2 joue un rôle dans le guidage axonal, l’extensition des neurites, la dynamique des microtubules et le trafic vésiculaire. Au cours de ma thèse, j’ai pu confirmer que dans les cellules de MU, PRL-3 modifie l’état de phosphorylation de CRMP2 en particulier sur les résidus T514 et S522. De plus, CRMP2 et PRL-3 interagisse et cette interaction aboutit à une diminution de la phosphorylation de CRMP2 sur le T514, ce qui suggère que CRMP2 est une cible directe de PRL-3. Des études fonctionnelles ont montré que l’extinction de CRMP2 par ARN interférent augmente la vitesse de migration et l’invasion des cellules de MU qui expriment PRL-3. CRMP2 est donc un frein à la migration et l’invasion des cellules de MU. La migration et l’invasion accrue dans ces cellules sont corrélées à un réarrangement du réseau d’actine avec une diminution des fibres de stress. L’étude des propriétés micro-rhéologiques des cellules de MU montre également que l’expression de PRL-3 et/ou l’extinction de CRMP2 augmente la viscosité, l’élasticité et la dureté du cytoplasme. L’extinction de CRMP2 ne modifie pas ces propriétés dans les cellules exprimant déjà PRL-3 ce qui montre que l’effet de l’extinction de CRMP2 est équivalent à celui de déphosphorylation. Enfin, dans les tumeurs l’expression de CRMP2 est associée à un bon pronostic de survie. Au cours de ma thèse, j’ai également participé à la création d’une carte du réseau d’interaction des molécules et des voies de signalisation impliquant PRL-3 dans le développement du cancer dans le cadre du projet NaviCell. Cette carte a été intégrée à la base de donnée ACSN. / Uveal melanoma (UM) is a rare tumor (500 to 600 new cases by year in France) but this is the most common intraocular cancer in adult. This tumor is due to melanocytes transformation derived from neural crest and localized in uvea (choroid, ciliary body and iris). Despite the primary tumor treatment, up to 50% of patients will develop metastases mostly localized in liver within the years following diagnosis. The median survival rate of metastasis formation is only six months. Indeed, there are currently no effective treatments against metastasis. Therefore, a better comprehension of UM metastatic process and identification of the genes involved are major issues for the development of new therapies. A transcriptomic analysis done in our laboratory allows to identify the phosphatase PRL-3 whose overexpression is correlated with metastatic development and patients poor prognosis. Besides being a bad prognosis marker, functional studies showed that UM cells expressing PRL-3 migrate faster and are more invasive than cells expressing the catalytic dead mutant of the phosphatase. The role of PRL-3 in tumorigenesis and metastatic development is well described, and numerous studies investigate his mechanism of action and his intracellular substrates. Interestingly, some of the identified PRL-3’s targets are cytoskeletal proteins. In order to identify new PRL-3’s targets in UM, we realized a phosphoproteomic analysis that allows us to identify CRMP2. CRMP2 is a cytoskeletal protein that has been mostly described in the nervous system. CRMP2 plays a role in axonal guidance, neuritis extension, microtubules dynamics and vesicular trafficking. During my PhD, I confirmed that in UM cells, PRL-3 expression modify the phosphorylation state of CRMP2 in particular on T514 and S522 residues. Moreover, CRMP2 and PRL-3 interact together and CRMP2 is less phosphorylated on the T514 following the interaction, which suggests that CRMP2 is a target of PRL-3. Furthermore, we showed that CRMP2 KO by shRNA increases UM cells velocity and invasion in cells expressing PRL-3. So CRMP2 is a brake to the migration and invasion process in UM cells. These observations are correlated with a reorganization of actin cytoskeleton with a reduction of stress fibers. The study of the microrheological properties of UM cells showed that PRL-3 expression and/or CRMP2 KO increases the viscosity, elasticity and stiffness of the cytoplasm. CRMP2 KO changes these properties only when PRL-3 is not functional which suggests that concerning the micro-rheology, CRMP2 KO is equivalent the its dephosphorylation by PRL-3. Finally, in UM tumors, CRMP2 expression are correlated with good survival prognosis. My PhD also gave me the opportunity to participate to the creation of a map about interactions and signaling pathways involving PRL-3 in cancers as part of the NaviCell project. This map was integrated in ASCN database.

L’hétérogénéité tumorale (HT) est un trait caractéristique du cancer. Elle peut être rencontrée chez la majorité des tumeurs malignes solides, au travers de la clinique, la biologie, l’histologie, et la génétique. Au-delà de l’hétérogénéité inter-patient, on distingue l’hétérogénéité spatiale, qui regroupe l’hétérogénéité au sein de la tumeur primitive, entre tumeur primitive et métastases, entre métastases, au sein d’une métastase et l’hétérogénéité temporelle, qui fait référence à l’évolution de la tumeur au cours du temps de manière spontanée ou sous l’effet des traitements. L’HT explique la survenue inéluctable de la résistance aux thérapies anticancéreuses actuelles. L’objectif général de cette thèse était d’explorer l’hétérogénéité tumorale au plan clinique, histologique et génétique en utilisant le modèle d’hépatectomies pour métastases d’origine colo-rectales. Dans l’article 1, nous avons étudié la réponse histologique à la chimiothérapie chez des patients opérés de métastases hépatiques colo-rectales après chimiothérapie systémique ou intra-artérielle. Ainsi, nous avons montré que la réponse histologique complète était plus souvent observée après administration d’oxaliplatine par voie intra-artérielle et était associée à un meilleur pronostic. Cependant la réponse histologique complète n’est observée que chez une minorité de patients. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse histologique incomplète représentent un groupe hétérogène de patients, ayant des pronostics différents. Ceci nous a conduit à proposer dans l’article 2 une méthode reproductible pour évaluer la réponse histologique, incorporant taille et nombre de nodules. La relecture des lames de pièces d’hépatectomie nous a conduit à observer une hétérogénéité de la réponse histologique au sein d’un même patient (hétérogénéité intermétastatique) et de l’aspect histologique (nécrose, fibrose). Nous avons ensuite exploré la valeur pronostique de cette hétérogénéité et chercher à identifier les facteurs prédictifs de cette hétérogénéité. Une réponse dissociée (une différence de réponse histologique > 50% entre deux nodules chez un même patient) a été observée chez 20% des patients et ne modifiait pas le pronostic. Chez les patients ayant une hétérogénéité pathologique, une discordance (mutation et absence de mutation pour les gènes KRAS, BRAF, NRAS et PI3K) entre les métastases a été mis en évidence dans 28% des patients analysés (article 3). Afin d’étudier l’hétérogénéité génétique selon le site tumoral et le type de prélèvements, nous avons utilisé les données disponibles de la plateforme de biologie moléculaire (article 4). Nous avons ainsi mis en évidence que les métastases hépatiques étaient moins souvent mutées pour KRAS, NRAS, BRAF que les tumeurs primitives ou les lésions pulmonaires. Nous avons ensuite recherché une hétérogénéité génétique intra-métastatique pour KRAS, NRAS, BRAF et PI3K au sein d’une métastase hépatique colo-rectale (article 5). Parmi les 54 patients ayant une tumeur unique analysable (2 prélèvements par tumeur), une discordance pour KRAS (N=2) et BRAF (N=1) a été mise en évidence chez 3 patients (5%). L’ensemble de ces travaux confirment que l’HT est observée à travers de nombreux points de vue. L’élaboration de nouvelles stratégies de prise en charge du cancer devra prendre compte cet aspect. / Tumor heterogeneity is a typical feature of cancer. It is observed in the majority of solid malignancies regardless of the point of view: clinical, biological, pathological, and genetic. Different levels of heterogeneity have been described: interpatient, spatial heterogeneity (within the primary tumor, between primary and distant lesion) and temporal heterogeneity (tumor evolution under the influence of treatment). Tumor heterogeneity widely explains the emergence of resistant clones to anticancer drugs. The objective of the current thesis was to explore tumor heterogeneity at a clinical, pathological and genetic level, by using the model of hepatectomy for colorectal liver metastases (CLM).In the article 1, we studied pathological response to chemotherapy in patients operated on for CLM after either systemic or intra-arterial hepatic oxaliplatin-based chemotherapy. We showed that complete pathological response was more often observed after intra-arterial chemotherapy and yield far better outcomes. However, complete response was observed in a minority of patients. We hypothesized that uncomplete pathological response encompass a large group of patients with different oncological outcomes. This lead us to propose a reproducible method (article 2) to assess pathological response, including size and number of nodules. Pathological review found heterogeneity in the response among nodules within the same patients and in the type of pathological features (necrosis, fibrosis). We then explore the prognostic value of pathological heterogeneity and sought to identify predictors of heterogeneity. A dissociated response (difference in pathological response > 50% between two nodules) was observed in XX and did not impact long-term outcomes. IN patients with dissociated response, genetic heterogeneity (mutation and no mutation for KRAS, NRAS, BRAF and PI3K) between metastases was shown in 28% of patients (article 3). To study genetic heterogeneity according to tumor location and the tumor tissue analyzed (specimen, biopsy), we used data from the department of molecular biology (article 4). We found that liver metastases were more often wild type for KRAS, NRAS, BRAF compared to lung metastases or primary tumors. In the article 5, we then sought to evaluate intrametastatic heterogeneity (KRAS, BRAF, NRAS, PI3K) within a single liver metastasis (2 samples per tumor). Among the 54 patients with single lesion analyzed, a discrepancy for KRAS (n=2) and BRAF (n=1) were observed un 3 patients (5%). This work confirms that tumor heterogeneity can be observed at various levels. Elaboration of new therapeutical strategies will have to take this aspect into consideration.

Le mélanome uvéal représente la tumeur intraoculaire maligne la plus fréquente dans la population adulte. De plus, 40% des mélanomes uvéaux sont asymptomatiques et sont donc diagnostiqués tardivement durant un examen ophtalmologique de routine. Aucun traitement de la tumeur primaire n'a changé l'incidence des métastases hépatiques et le pronostic final : le mélanome uvéal métastatique demeure une maladie incurable associée à une espérance de vie variant de 2 à 14 mois. L'objectif principal de ce projet de doctorat consiste donc à identifier les gènes exprimés lors du développement de la tumeur primaire du mélanome uvéal ainsi que ceux impliqués dans la formation des métastases. Dans un premier temps, la construction de banques de soustraction lignée cancéreuse TP31 - mélanocytes uvéaux normaux a permis de comparer ces deux populations d'ARNm et d'amplifier les gènes qui sont exprimés spécifiquement ou réprimés par la lignée cancéreuse TP31. L'analyse des 2 banques de soustraction a révélé 72 gènes surexprimés et 36 gènes réprimés dans la lignée cancéreuse TP31 et cette expression a été confirmée dans la tumeur primaire fraîche. En second lieu, nous avons vérifié l'existence de cellules souches cancéreuses dans le mélanome uvéal à l'aide de marqueurs spécifiques aux cellules souches. Ainsi, pour la première fois, une sous-population de cellules démontrant un phénotype de cellules souches a été caractérisée dans le mélanome uvéal et la présence de ces cellules chimiorésistantes pourrait avoir un impact sur le traitement. Enfin, la construction d'une banque de soustraction tumeurs primaires fraîches - mélanocytes uvéaux normaux a permis de déterminer les gènes réprimés par les tumeurs primaires. À la suite de l'analyse de la banque de soustraction, 136 gènes réprimés ont été identifiés et plusieurs d'entre eux sont impliqués dans l'apoptose, le développement et la pigmentation. Par ailleurs, nous avons voulu caractériser le transcriptome spécifique aux métastases hépatiques par la construction d'une banque de soustraction métastases hépatiques - tumeurs primaires épithélioïdes mais TARN des métastases était dégradé. Nous avons donc suggéré des solutions pour éviter la dégradation des futurs prélèvements de métastases. Finalement, le profil d'expression des sous-unités d'intégrines a été déterminé par cytométrie de flux dans les mélanocytes uvéaux normaux et les lignées cancéreuses dérivées de mélanomes uvéaux. Ces données ont permis de cibler la sous-unité d'intégrine a4 pour des études de régulation du promoteur puisque son expression était spécifique à la lignée métastatique H79.

Plusieurs modèles animaux de perte osseuse ont été développés : le modèle du rat orchidectomisé (ORX) et paralysé par la toxine botulique (BTX), le modèle du rat injecté avec des cellules Walker induisant des métastases ostéolytiques, le modèle du rat injecté avec des cellules MAT-Ly-Lu induisant des métastases ostéocondensantes. Nous avons montré que la combinaison ORX-BTX avait des effets cumulatifs ; elle induit des changements microarchitecturaux et une perte osseuse massive et rapide due à une hausse rapide et transitoire du remodelage osseux. Le modèle ORX-BTX a été utilisé pour l'implantation d'un biomatériau injectable qui a été transitoirement remplacé par de l'os non mature résorbé ensuite sans être substitué par de l'os lamellaire mature. Des mesures densitométrique, histomorphométrique et microtomographique chez le rat ORX-BTX ont montré que le risédronate a un effet protecteur contre la perte osseuse trabéculaire et la modification de la microarchitecture et un effet plus modéré sur la perte osseuse corticale. La testostérone ne prévient pas la perte osseuse mais préserve la masse maigre corporelle. L'analyse de texture et la microtomographie ont permis de détecter et de différencier les altérations osseuses induites par métastases ostéolytiques ou ostéocondensantes. Nous avons également montré par études histologique et immunohistochimique que les interactions cellules cancéreuses-cellules stromales provoquent une production stromale de cytokines aboutissant à l'ostéoclastogénèse uniquement dans le microenvironnement osseux. Le microenvironnement osseux peut donc avoir un rôle important dans l'établissement et la prolifération métastatique.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C'est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j'ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d'inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d'Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j'ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J'ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2.

L'étude des interactions non-covalentes et des relations structure-fonction est à la base de la compréhension des systèmes biologiques. La MS supramoléculaire est une technique de choix pour l’étude des interactions protéine/protéine ou protéine/ligand. Dans le cadre d'études qualitatives ou quantitatives, pour chaque système étudié, les conditions expérimentales et les paramètres instrumentaux ont été optimisés pour conserver le complexe en phase gazeuse (1). L'objectif principal de ce travail est de caractériser le site nucléotidique de hPEBP1 et de contribuer à la découverte de molécules anti-métastases. Sur le plan fonctionnel, une activité enzymatique de hPEBP1 n'a pas pu être mise en évidence. Pour ce projet, une méthode MS de détermination de KD de complexes à faible affinité, plus précise et ne nécessitant par l'utilisation d'un ligand de référence a été développée (2). Une recherche des déterminants structuraux d'un ligand optimal de hPEBP1 a été réalisée par criblage de composés issus d’une synthèse raisonnée basée sur la structure des nucléotides FMN et GTP et par la détermination de leur KD (3). Les criblages ont montré que les critères structuraux indispensables pour la liaison sont la présence d’un groupement chargé ou donneur d’électrons, d’une structure apparentée à une base azotée et d’un cycle additionnel. Une part importante de l’affinité est liée au caractère hydrophobe du ligand. Certains ligands de synthèse ont montré une activité inhibitrice de l’invasion des lignées tumorales. / The study of noncovalent interactions and structure-function relationships provides the basis for the understanding of biological systems. Supramolecular MS is a favored technique to dissect protein/protein or protein/ligand interactions. In the context of qualitative or quantitative studies, experimental conditions and instrumental parameters have been optimized for each system to preserve the noncovalent complex in the gas-phase (1). The main objective of this work is to characterize the nucleotide site of hPEBP1 and to contribute to the discovery of antimetastatic molecules. Functionally, a catalytic activity for hPEBP1 could not be detected. For this project, an original MS method to more accurately determine KD for low-affinity complexes without a reference ligand was developed (2). Structural features of an optimal hPEBP1 ligand were determined by screening compounds based on FMN and GTP nucleotides in the context of a rational design approach, using KD determination to rank affinities (3). Screening highlighted that the essential structural requirements for binding hPEBP1 consist in a charged group or an electron donor, a structure related to a cyclic nitrogenous base and an additional cycle. A significant part of the affinity depends on the hydrophobic nature of the ligand. Some of the synthesized nucleotide analogs are active as inhibitors of invasion in tumor cell lines.

Les métastases osseuses sont des complications fréquentes de nombreuses tumeurs solides et sontresponsables, sur le plan clinique, de fractures osseuses, d’hypercalcémie et de douleurs. A l’heure actuelle,il n’existe aucun traitement curatif ; la compréhension des mécanismes impliqués dans la formation et ledéveloppement des métastases osseuses est donc nécessaire afin d’envisager de nouvelles approchesthérapeutiques.Une analyse transcriptomique comparative entre une lignée humaine de cancer du sein, les MDA-MB-231, et leur sous-population ostéotropique, les B02, a montré une surexpression de composants de la voie designalisation Slit/Robo.Les récepteurs Robo et leurs ligands Slits, initialement identifiés comme facteurs clés du guidage axonal lorsdu développement, sont également impliqués dans la migration des cellules cancéreuses.Afin d’étudier le rôle de ces récepteurs Robo1 et 4 dans la dissémination métastatique à l’os, nousavons inhibé l’expression de ces gènes dans les cellules B02. Des expériences in vitro et in vivo montrentalors un rôle antagoniste de Robo1/4. En effet, l’inhibition de Robo1 augmente la croissance des tumeursprimaires, tandis que celle de Robo4 la diminue. Ces récepteurs régulent également différemment laformation de lésions ostéolytiques ainsi que la croissance tumorale de ces métastases. In vitro, l’absence deRobo1 augmente l’invasion, tandis que celle de Robo4 la diminue. Nous avons également montré quel’inhibition de Robo4 ralentit la colonisation de la moelle osseuse par les cellules B02 à des temps précoces.Enfin, l’étude d’une cohorte de patientes atteintes d’un cancer du sein montre une corrélation entrel’expression de Robo4 et la rechute métastatique osseuse.Cette étude montre l’implication de la voie Slit/Robo dans la dissémination métastatique à l’os, etsemble par conséquent constituer une approche thérapeutique judicieuse pour traiter ces métastases. / Bone metastases are a common complication of many solid tumors and are clinically responsible ofbone fractures, hypercalcemia, and pain. Currently, there is no curative treatment; understanding themechanisms involved in the formation and development of bone metastases is therefore necessary toconsider new therapeutic approaches.A comparative transcriptomic analysis between the human breast cancer cell line MDA-MB-231, andits osteotropic subpopulation, B02, has shown an up-regulation of Slit/Robo signaling pathway.Robo receptors and their ligands Slits were initially identified as key factors in axon guidance duringdevelopment. However, these proteins are also involved in the migration of cancer cells.To investigate the role of these receptors Robo1 and 4 in breast cancer bone metastasis, theexpression of these genes was inhibited in B02 cells. In vitro and in vivo experiments point out antagonisticrole of Robo1/4. Indeed, inhibition of Robo1 expression increases primary tumors growth, while Robo4invalidation reduces it. These receptors also differently regulate the formation of osteolytic lesions and extentof skeletal tumor burden. In vitro, Robo1 depletion induces an increased invasion, whereas Robo4 depletiondecreases it. We also showed that inhibition of Robo4 reduces survival and growth of B02 cells in the bonemarrow at early times of invasion. Finally, a cohort study of breast cancer patients shows a strong correlationbetween Robo4 expression and metastatic relapse in bone.This study shows the involvement of the Slit/Robo pathway in bone metastasis, and therefore seemsto be a judicious therapeutic approach to treat these metastases.

Hsp27 appartient à la famille des protéines dites de survie comme Bcl2 ou la survivine. C’est une protéine anti-apoptotique qui subit une dérégulation de son expression dans de nombreux types tumoraux. Elle est caractérisée comme étant une cible thérapeutique majeure. Au cours de ma thèse, j’ai isolé des peptides stabilisés, dit aptamères, capables d’inhiber fonctionnellement les activités anti-apoptotiques et tumorigènes d’Hsp27. Ces aptamères perturbent la biochimie structurale de Hsp27 et induisent le blocage du cycle cellulaire in vivo. Parallèlement à cette étude, j’ai caractérisé les effets de la déplétion de Hsp27 sur la formation de métastases et de tumeurs osseuses. J’ai aussi montré que la modification du taux de Hsp27 induisait la dégradation de différentes protéines, dites clientes, comme la caspase3, HDAC6 et STAT2. / Hsp27 belongs to the class of survival proteins like Bcl2 or survivin. This protein was well categorized as a major anti apoptotic protein as displaying a high level of expression in lot of tumor types. Moreover, Hsp27 is referenced as a major therapeutic target in cancer. During my PhD, I characterized stable peptides called aptamers, which functionally blocked Hsp27 antiapoptotic and tumorigenic properties. These aptamers disrupted biochemical and structural states of Hsp27 and promoted cell cycle arrest in xenografts. In the same time, I have characterized the effect of Hsp27 depletion in metastasis establishment and bone marrow tumor growth. I have shown that targeting level of Hsp27 induced degradation of several of its client proteins like caspase3, HDAC6 and STAT2