Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus son microorganismos patógenos pertenecientes a la familia Vibrionaceae y al género Vibrio. Son microorganismos con morfología ligeramente curvada, gram negativos y oxidasa positivos. En cuanto a sus aspectos ecológicos son halófilos, por tanto suelen estar presentes en aguas marinas costeras y en el interior de moluscos, crustáceos y peces, y tienden a encontrarse en aguas cálidas. La patología que producen está asociada al consumo de mariscos, moluscos y pescado crudo o poco cocinado y a la exposición a aguas contaminadas. Ambas especies son consideradas patógenos emergentes debido al aumento en su incidencia y a la mayor distribución geográfica de los casos de intoxicación alimentaria, sobre todo en países asiáticos. La detección e identificación de ambas especies en alimentos de origen marino y agua, presenta gran dificultad, ya que los procedimientos convencionales son largos y tediosos, y pueden proporcionar falsos negativos. Los métodos de detección molecular pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Objetivos: Debido a esto, en este trabajo se han desarrollado métodos de detección y cuantificación de Vibrio spp., Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus mediante PCR tradicional, PCR a tiempo real e hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) para su aplicación en matrices alimentarias y en agua. En este estudio se han aplicado los distintos métodos a matrices ambientales (agua de playa y agua residual) y a alimentos de origen marino. Resultados: Los resultados muestran que la PCR a tiempo real es el método más rápido y sensible para la detección de las diferentes especies estudiadas, además de permitir la cuantificación del microorganismo en las muestras de forma fiable. En este trabajo hemos demostrado la presencia de bacterias del género Vibrio en ambos tipos de matrices y el potencial de aguas y alimentos de origen marino para actuar como vehículos de transmisión de V. parahaemolyticus y V. vulnificus / Cañigral Cárcel, I. (2011). Desarrollo de métodos moleculares para la detección y caracterización de bacterias patógenas emergentes del género Vibrio en aguas y alimentos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/11799

No sentido de colaborar com o estudo da redução de microrganismos em Endodontia, foi realizada uma análise crítica dos modelos metodológicos in vivo sobre as técnicas moleculares utilizadas na avaliação da microbiota endodôntica e na capacidade de medir a antissepsia que o tratamento endodôntico proporciona. Desta maneira, os trabalhos foram agrupados de acordo com a proposta do presente estudo. Na análise critica e comparativa, pode-se observar uma grande variedade de métodos moleculares aplicados nos estudos, sendo que o mais utilizado nos ensaios para avaliação da microbiota foi o PCR. Havia estudos que utilizavam uma combinação de vários métodos onde foi possível identificar microrganismos ainda não conhecidos. Nos ensaios que utilizam iniciadores universais e que se valem da identificação de microrganismos através do DNA, foram listados de maneira a poder observar que o iniciador universal formado pela seguinte cadeia de oligonucleotídeos: F: 5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/R: 5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3 foi o mais descrito pela literatura. / In order to collaborate with the study of disinfection in Endodontics, was performed a study of critical methodological models in vivo on the molecular techniques used in the evaluation of endodontic microbiota and the ability to measure the disinfection capacity of endodontic treatment. Thus, the studies were grouped according to the purpose of this study. Under in critical and comparative analysis its can be seen a wide variety of molecular techniques used in the studies, and as used in the tests was to evaluate the microbial PCR studies using a combination of various methods which could be identified microorganisms has not known. In assays using universal primers which rely on the identification of microorganisms using the DNA, were listed as to be able to observe that the universal primer chain formed by the following primers: F: 5\'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 \'/ R: 5\'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3\' was as described in the literature.

No sentido de colaborar com o estudo da redução de microrganismos em Endodontia, foi realizada uma análise crítica dos modelos metodológicos in vivo sobre as técnicas moleculares utilizadas na avaliação da microbiota endodôntica e na capacidade de medir a antissepsia que o tratamento endodôntico proporciona. Desta maneira, os trabalhos foram agrupados de acordo com a proposta do presente estudo. Na análise critica e comparativa, pode-se observar uma grande variedade de métodos moleculares aplicados nos estudos, sendo que o mais utilizado nos ensaios para avaliação da microbiota foi o PCR. Havia estudos que utilizavam uma combinação de vários métodos onde foi possível identificar microrganismos ainda não conhecidos. Nos ensaios que utilizam iniciadores universais e que se valem da identificação de microrganismos através do DNA, foram listados de maneira a poder observar que o iniciador universal formado pela seguinte cadeia de oligonucleotídeos: F: 5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/R: 5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3 foi o mais descrito pela literatura. / In order to collaborate with the study of disinfection in Endodontics, was performed a study of critical methodological models in vivo on the molecular techniques used in the evaluation of endodontic microbiota and the ability to measure the disinfection capacity of endodontic treatment. Thus, the studies were grouped according to the purpose of this study. Under in critical and comparative analysis its can be seen a wide variety of molecular techniques used in the studies, and as used in the tests was to evaluate the microbial PCR studies using a combination of various methods which could be identified microorganisms has not known. In assays using universal primers which rely on the identification of microorganisms using the DNA, were listed as to be able to observe that the universal primer chain formed by the following primers: F: 5\'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 \'/ R: 5\'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3\' was as described in the literature.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-07-07T15:56:33Z No. of bitstreams: 1 jaquelineflavianaoliveiradesa.pdf: 742000 bytes, checksum: 7f38a8b27c7484dba168398f10261b03 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-08T13:24:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jaquelineflavianaoliveiradesa.pdf: 742000 bytes, checksum: 7f38a8b27c7484dba168398f10261b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T13:24:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jaquelineflavianaoliveiradesa.pdf: 742000 bytes, checksum: 7f38a8b27c7484dba168398f10261b03 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Os derivados lácteos são alimentos com excepcional valor nutritivo e amplamente consumido pela população de vários países. Entretanto, são também excelentes meios de cultura para muitos micro-organismos, sendo, portanto, passíveis de contaminação por diferentes agentes microbiológicos, podendo levar a doenças manifestadas por ação de patógenos ou por suas toxinas. A obtenção de alimentos seguros depende, dentre outros fatores, dos métodos de análises utilizados, os quais devem fornecer resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, pela indústria e pelos órgãos de fiscalização e para isto, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para detecção e quantificação de patógenos. O primeiro objetivo do presente estudo foi caracterizar microbiologicamente, por metodologia clássica, amostras de doce de leite, leite condensado e queijo Minas Padrão, produzidos em vários estados do Brasil. Foram feitas análises de contagem padrão em placas de mesófilos, bolores e leveduras, coliformes a 30ºC e a 45ºC, Staphylococcus spp. coagulase positiva e negativa, além da pesquisa de Salmonella sp. e Listeria monocytogenes. Altas contagens padrão em placas de mesófilos, leveduras e Staphylococcus spp. coagulase negativa foram encontradas nos três produtos. O segundo objetivo foi desenvolver uma metodologia alternativa à clássica, que apresentasse resultados mais rápidos e de alta especificidade para a detecção dos principais patógenos contaminantes de produtos lácteos e transmissores de doenças de origem alimentar, utilizando a técnica de PCR em tempo real. Foi padronizada uma reação multiplex para detecção de Salmonella enterica var Thyphimurium e Staphylococcus aureus. O presente trabalho contribuirá com a rara literatura mundial sobre a microbiota contaminante do doce de leite, leite condensado e queijo Minas Padrão, fornecendo dados científicos à academia, às autoridades regulamentadoras e indústria, vislumbrando a possibilidade da utilização de métodos de diagnóstico microbiológico alternativos aos clássicos, que forneçam resultados cada vez mais rápidos e sensíveis. / Dairy products are food with exceptional nutritional value and are widely consumed by the population of various countries. However, they are also excellent culture medium for many micro-organisms, and is therefore liable to contamination by different microbiological agents which may lead to diseases manifested by the action of pathogens or their toxins. The attainment of safe food depends, among other factors, of the analysis methods used, which should provide fast and reliable results that allow the monitoring of microbiological safety of food, by the industry and the supervisory bodies and for this, alternative methods have been developed for detection and quantification of pathogens. The first objective of this study was to characterize microbiologically, by conventional method, samples of doce de leite, condensed milk and standard Minas cheese, produced in several states in Brazil. Standard count analysis were made in standard plate for mesophyll, yeasts and molds, coliforms at 30ºC and 45°C, Staphylococcus spp. coagulase positive and negative, as well as Salmonella sp. and Listeria monocytogenes. High standard counts on plates of mesophyll, yeasts and Staphylococcus spp. coagulase-negative were found in three products. The second objective was develop an alternative methodology to the classical, to produce faster and of high specificity results for detection of main pathogen contaminants of dairy products and transmitting of food diseases, using real-time PCR technique. A multiplex reaction was standardized for detection of Salmonella enterica var Thyphimurium and Staphylococcus aureus. This work will contribute to the rare literature on microbial contaminants of doce de leite, condensed milk and standard Minas cheese, providing scientific data to the academy, regulatory authorities and industry, envisioning the possibility of using alternative microbiological diagnosis methods instead of classic that provides faster and more sensitive results.

Bacteria of the Arcobacter genus are microorganisms belonging to the Campylobacteraceae family. Currently, the Arcobacter genus comprises 23 species, isolated from a variety of hosts and ecological niches. Although most of the pathogenic species are from fecal origin, seawater is considered to be the habitat for most of them. The transmission to humans seems to be associated to the consumption of raw food or not entirely-cooked. In this regard, the presence of pathogenic Arcobacter species in food of marine origin and vegetables has not been deeply studied. When the detection and identification of Arcobacter is performed exclusively using conventional culture-based methods, the process is slow, tedious and rarely effective many times, originating frequently false negatives. Molecular biology-based methods analyzing nucleic acids with the use of the Polymerase Chain Reaction (PCR), are alternative procedure characterized by being reliable, faster, more sensitive. In this thesis we have analysed the presence of Arcobacter spp in 100 samples from shellfish and another 100 samples from vegetables using both approaches, on one side through the isolation and characterization by plate culture in and on the other side by PCR. The results obtained by both methods confirm the presence of Arcobacter spp. in the samples. An enrichment period followed by PCR has proved to be more sensitive than culture for the detection of the microorganism in the samples. In this study, Arcobacter contamination has been detected in 71 % of the shellfish samples and 20 % of vegetable samples. The obtained Arcobacter isolates have been identified to the species level analyzing the 16 rRNA gene by PCR-RFLP. This technique has allowed the identification of the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. defluvii in the shellfish isolates, being the first time that A. defluvii is identified in clams. Additionally, it is also the first time that Arcobacter spp. is detected in cockles. A. butzleri and A. cryaerophilus have been isolated in vegetables being the last one the first time in this type of samples. The sensitivity of the obtained isolates to ciprofloxacin and levofloxacin has also been studied. 2 % in analysed shellfish and 1 % in vegetables were contaminated with resistant strains. Three isolates from shellfish and 2 from vegetables, previously identified as A. butzleri, have shown resistance to both fluoroquinolones. In all of them, a mutation in the 254 position (C normal to T mutant) in the Quinolone Resistance-Determining Region (QRDR) of the gyrA gene has been detected. Our results regarding the presence of the pathogen in both types of samples are sufficiently relevant as to consider that the consumption of these contaminated foods with Arcobacter, especially A. butzleri, could suppose a risk for human health. In addition, in this thesis the analisys of Helicobacter spp. and H. pylori by conventional PCR and real-time PCR has been carried out. The Helicobacter genus comprises a large number of species considered pathogenic. The most studied specie is H. pylori, one of the most common pathogens in humans and responsible of 90 % of peptic ulcers and closely related to the development of gastric cancer. Although it seems clear that H. pylori is transmited by fecal-oral route through the water, its presence in food is poorly known. Therefore, another objective of the present study has been to study the presence of these organisms in shellfish and vegetable samples. Helicobacter spp. or H. pylori could not be detected by conventional PCR. However, the real-time PCR technique allowed the detection of H. pylori in a sample from vegetables (lettuce). / Las bacterias del género Arcobacter son microorganismos pertenecientes a la familia Campylobacteraceae. Actualmente, el género Arcobacter comprende 23 especies, aisladas de una gran diversidad de hospedadores y nichos ecológicos. Las aguas de mar son consideradas el hábitat natural para muchas de ellas, aunque la mayor parte de las especies patógenas son de origen fecal. La transmisión al hombre parece estar asociada al consumo de alimentos crudos o poco cocidos. Sin embargo, la presencia de especies patógenas de Arcobacter en alimentos de origen marino y vegetales ha sido muy poco estudiada. Cuando la detección e identificación de Arcobacter, se establece exclusivamente en función de métodos convencionales de cultivo, el proceso resulta lento, tedioso y poco efectivo en muchas ocasiones, originando frecuentes falsos negativos. Los métodos de detección molecular basados en el análisis de ácidos nucleicos, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Por todo ello, en este trabajo se ha realizado la detección de Arcobacter spp. mediante aislamiento por cultivo en placa y PCR, a partir de 100 muestras de moluscos y 100 de verduras. Los resultados obtenidos por ambos métodos confirman la existencia de Arcobacter en las muestras. La PCR, realizada tras un periodo de enriquecimiento, ha resultado ser más sensible que el cultivo para la detección del microorganismo en las muestras. En este trabajo se ha detectado contaminación por Arcobacter en el 71 % de las muestras de moluscos y el 20 % de las muestras de verduras. Los aislados de Arcobacter obtenidos han sido identificados a nivel de especie mediante un análisis PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Esta técnica ha permitido identificar las especies A. butzleri, A. cryaerophilus y A. defluvii de los aislados de moluscos, siendo la primera vez que es identificada A. defluvii de muestras de almejas. También es la primera vez que se detecta Arcobacter spp. en berberechos. En el caso de las verduras, se han aislado A. butzleri y A. cryaerophilus. Esta última especie ha sido identificada por primera vez en este tipo de muestras. También se ha estudiado la sensibilidad de los aislados obtenidos a ciprofloxacino y levofloxacino. El porcentaje de muestras contaminadas con cepas resistentes fue del 2 % en moluscos y del 1 % en verduras. Tres aislados procedentes de moluscos y 2 de verduras, identificados previamente como A. butzleri, han mostrado resistencia a ambas fluoroquinolonas. En todos ellos se ha detectado la existencia de una mutación en la posición 254 (C normal por T mutante) en la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR) del gen gyrA. Nuestros resultados sobre la presencia del patógeno en ambos tipos de muestras son lo suficientemente relevantes como para considerar que el consumo de estos alimentos contaminados con Arcobacter, especialmente A. butzleri, podría suponer un riesgo para la salud humana. Adicionalmente, en este trabajo se ha realizado un análisis de detección de Helicobacter spp. y H. pylori mediante PCR convencional y PCR a tiempo real. El género Helicobacter comprende un gran número de especies consideradas patógenas. La especie más estudiada es H. pylori, uno de los patógenos más comunes en humanos, responsable del 90 % de las úlceras pépticas y relacionado estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Aunque parece claro que H. pylori se transmite por la vía fecal-oral a través del agua, su presencia en los alimentos es poco conocida. Por lo tanto, en este estudio se tomó como objetivo estudiar la presencia de estos microorganismos en las muestras de moluscos y verduras. El análisis mediante PCR convencional no mostró resultados positivos para la detección de Helicobacter spp. ni H. pylori. La técnica PCR a tiempo real, sin embargo, ha permitido la detección de H. pylori en una muestra procedente de verduras (lechuga). / Els bacteris del gènere Arcobacter són microorganismes pertanyents a la família Campylobacteraceae. Actualment, el gènere Arcobacter comprèn 23 espècies, aïllades d'una gran diversitat d'hostes i nínxols ecològics. Les aigües de la mar són considerades l'hàbitat natural per a moltes d'aquestes espècies, encara que la major part de les patògenes són d'origen fecal. La transmissió a l'home sembla estar associada al consum d'aliments crus o poc cuits. No obstant això, la presència d'espècies patògenes d'Arcobacter en aliments d'origen marí i vegetals ha sigut molt poc estudiada. Quan la detecció i identificació d'Arcobacter s'estableix exclusivament en funció de mètodes convencionals de cultiu, el procés resulta lent, tediós i sovint poc efectiu, i origina amb freqüència falsos negatius. Els mètodes de detecció molecular basats en l'anàlisi d'àcids nucleics, com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), poden suposar una alternativa més ràpida, sensible i fiable. Per tot això, en aquest treball s'ha realitzat la detecció d'Arcobacter spp. mitjançant aïllament per cultiu en placa i PCR, a partir de 100 mostres de mol·luscos i 100 de verdures. Els resultats obtinguts pels dos mètodes confirmen l'existència d'Arcobacter en les mostres. La PCR, després d'un període d'enriquiment, ha resultat ser més sensible que el cultiu per a la detecció del microorganisme en mostres de mol·luscos. En aquest treball, s'ha detectat contaminació per Arcobacter en el 71 % de les mostres de mol·luscos i el 20 % de les mostres de verdures. Els aïllats d'Arcobacter obtinguts han sigut identificats a nivell d'espècie mitjançant una anàlisi PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Aquesta tècnica ha permès identificar les espècies A. butzleri, A. cryaerophilus i A. defluvii en els aïllats de mol·luscos. Aquesta és la primera vegada que A. defluvii és identificada en mostres de cloïsses. També és la primera vegada que es detecta Arcobacter spp. en catxels. En el cas de les verdures, s'han aïllat A. butzleri i A. cryaerophilus. Aquesta última espècie ha sigut identificada per primera vegada en aquest tipus de mostres. També s'ha estudiat la sensibilitat dels aïllats obtinguts a la ciprofloxacina i la levofloxacina. El percentatge de mostres contaminades amb soques resistents va ser del 2 % en mol·luscos i de l'1 % en verdures. 3 aïllats procedents de mol·luscos i 2 de verdures, identificats prèviament com A. butzleri, han mostrat resistència a ambdues fluoroquinolones. En tots aquests s'ha detectat l'existència d'una mutació en la posició 254 (C normal per T mutant) en la regió determinant de resistència a quinolones (QRDR) del gen gyrA. Els nostres resultats sobre la presència del patogen en els dos tipus de mostres són prou rellevants per a considerar que el consum d'aquests aliments contaminats amb Arcobacter, especialment A. butzleri, podria suposar un risc per a la salut humana. Addicionalment, en aquest treball s'ha fet una anàlisi de detecció d'Helicobacter spp. i H. pylori mitjançant PCR convencional i PCR a temps real. El gènere Helicobacter comprèn un gran nombre d'espècies considerades patògenes. L'espècie més estudiada és H. pylori, un dels patògens més comuns en humans, responsable del 90% de les úlceres pèptiques i relacionada estretament amb el desenvolupament de càncer gàstric. Encara que sembla clar que H. pylori es transmet per la via fecal-oral a través de l'aigua, la presència d'aquest bacteri en els aliments és poc coneguda. Per tant, en aquest estudi es va definir com a objectiu estudiar la presència d'aquests microorganismes en les mostres de mol·luscos i verdures. L'anàlisi mitjançant PCR convencional no va mostrar resultats positius per a la detecció d'Helicobacter spp. ni d'H. pylori. La tècnica PCR a temps real, en canvi, ha permès la detecció d'H. pylori en una mostra procedent de verdures (encisam). / Bayas Morejón, IF. (2016). Aportaciones a la epidemiología de Arcobacter y Helicobacter spp.: Aplicación de métodos moleculares a su detección e identificación en alimentos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75087

A amebíase é uma infecção causada pela Entamoeba histolytica. Entretanto, a diferenciação entre a E. histolytica e a Entamoeba dispar, espécies morfologicamente semelhantes, é fundamental para a conduta terapêutica, prevenção da doença invasiva e para a saúde pública. O propósito desde trabalho foi avaliar a Multiplex-PCR na detecção e diferenciação entre a E. histolytica e a E. dispar. Foi feita uma comparação entre os métodos de exame microscópico das fezes usando o conjunto diagnóstico Coprotest, a detecção de antígenos nas fezes usando um ensaio imunoenzimático comercial e o Multiplex-PCR padronizado no laboratório, para o diagnóstico da amebíase. A Multiplex-PCR foi padronizada usando amostras com parasitos obtidos de culturas padrões. Posteriormente, 127 amostras de fezes provenientes de duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro, foram testadas e os resultados comparados. A análise de 127 amostras de fezes pelo exame parasitológico de fezes demonstrou que 27 (21%) amostras foram positivas para o complexo E. histolytica/E. dispar. Dessas amostras, 12 foram positivas pelo Multiplex-PCR, sendo que nove apresentaram o padrão de E. dispar (96 bp) e três o padrão E. histolytica (132 bp). Entre as amostras negativas detectadas pelo exame microscópico, três foram positivas para E. dispar e uma foi positiva para E. histolytica pelo Multiplex-PCR. Esse fato mostrou que a PCR foi mais eficiente do que o exame parasitológico realizado com uma amostra de fezes. Os resultados obtidos pelo ensaio de detecção de antígeno de E. histolytica foram concordantes com o do Multiplex-PCR. A análise estatística comparando os resultados do ELISA coproantígeno com o Multiplex-PCR, não pode ser feita devido ao baixo número de casos de E. histolytica. Os resultados acima indicam a necessidade do uso de métodos mais sensíveis para o diagnóstico da amebíase e a importância de se usar técnicas específicas na diferenciação entre E. histolytica e E. dispar. / Amebiasis is defined as an infection caused by Entamoeba histolytica. However, precise differentiation between E. histolytica and Entamoeba dispar, which are morphologically identical species, is essential for treatment decision, prevention of the invasive disease and public health. The purpose of the present study was to evaluate a Multiplex-PCR for detection and differentiation of E. histolytica from E. dispar. Microscopic examination of stools using the coprotest kit, detection of stool antigen using a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit and a home made Multiplex-PCR, were compared for the diagnosis of amebiasis infection. The Multiplex-PCR was standardized using stool samples with parasites obtained from standard cultures. Afterwards, 127 stool samples obtained from individuals living in two villages of the state of Rio de Janeiro were tested and the results were compared. Analysis of the 127 stools samples by microscopy examination demonstrated that only 27 (21%) samples were positive for E. histolytica /E. dispar complex. Among these stool samples, 12 were positive by Multiplex-PCR, with nine presenting the diagnostic fragment characteristic of E. dispar (96 bp) and three presenting diagnostic fragment of E. histolytica (132 bp). Among the negative samples detected by microscopic examination, three were positive for E. dispar and one was positive for E. histolytica by Multiplex-PCR. This denotes that Multiplex-PCR was more efficient than microscopic examination when single stool samples were analyzed. The results obtained by detection of E. histolytica antigen were in agreement with those obtained by the multiplex-PCR. Statistical analyses comparing coproantigen ELISA with Multiplex-PCR results were not done because of the low number of E. histolytica cases. The overall results indicate the need to use more sensitive methods for the diagnosis of amebiasis infection and the importance of using specific techniques for the differentiation between E. histolytica and E. dispar.

A tuberculose é uma das principais preocupações da Organização Mundial da Saúde, principalmente após o surgimento da AIDS que alavancou os índices da doença, sendo considerada a principal causa de morte por um único agente. Além do M. tuberculosis, agente responsável pela doença em humanos, outra manifestação importante é a tuberculose em bovinos causada pelo M. bovis, que também apresenta importância epidemiológica, devido à transmissão para o homem pela ingestão de alimentos contaminados, e a escassez de dados com relação à sua prevalência na população. Programas de controle da doença nos rebanhos bovinos existem em todo o mundo, e os maiores índices da doença encontram-se nos países em desenvolvimento. Estes programas estão baseados na identificação dos animais positivos, por meio de testes de tuberculina e sacrifício dos mesmos. Lesões encontradas em exames post-mortem podem ser submetidas a estudos bacteriológicos para o isolamento e identificação do agente e histopatológicos para a caracterização da lesão, os quais demandam meses para a sua conclusão. Com o advento da biologia molecular, novos métodos são propostos para a diminuir o tempo do diagnóstico de meses para poucos dias. Com o intuito de proporcionar um panorama das novas metodologias moleculares, como a técnica de PCR, empregadas no diagnóstico da tuberculose bovina, realizou-se uma revisão bibliográfica, apresentando as vantagens e dificuldades das mesmas. Apesar dos avanços alcançados com estas técnicas, a padronização de métodos viáveis para a rotina de diagnóstico laboratorial ainda não foi obtida, sendo essencial o investimento em pesquisas com o objetivo de solucionar estas barreiras. / Tuberculosis is one of the main concern of World Health Organization, especially after the appearance of the AIDS that increased the rate of this disease that is the principal cause of death by one unique agent. Besides the tuberculosis caused by M. tuberculosis in human being, the disease caused by M. bovis in man shows epidemiological importance by its transmission trough contaminated food and the requirement of datas about its prevalence in human being. Control programs of bovine tuberculosis are present worldwide and the major rates of the disease are found in developing countries. This programs are based on test-and-slaughter, defined by the application of tuberculin test to cattle and slaughter of positive animals. Tuberculous lesions founded at post mortem inspection can be analyzed by bacteriological methods for isolation and identifying of the agent and histopathological examination that both require several days to conclusion. After the advent of molecular biology, new methods have been proposed to reduce the time of diagnostic from moths to few days. With the meaning to provide an overview of the new molecular methods applied to the bovine tuberculosis diagnosis, as PCR method, a review as carried out showing those advantages and difficulties. Although the advances reached by these techniques, the standardization of viable methods to the routine laboratory diagnosis couldn?t be reached and the investment in researches is essential to solve these barriers.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2016-01-21T10:48:19Z No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-01-21T11:27:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-21T11:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Vanessa de Sousa Cruz Pimenta - 2015.pdf: 2458021 bytes, checksum: 1c3e073ac4b90d92b9cf962f0d6d5d4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Osteosarcoma is the most diagnosed primary bone cell tumor in dogs and humans. The need for more effective drugs with less intense collateral effect has triggered the development of plant-derived, natural-source chemotherapeutics. This study aimed to verify β lapachone intracellular effects on canine osteosarcoma cultured cells, as well as identify action mechanisms related to its antiproliferative properties. Cells were obtained from a cell line bank, sub cultivated and subjected to treatment with different β lapachone concentrations, followed by tetrazolium reduction, Tripan Blue dye exclusion assay, clongenic survival assay, Annexin V-FITC and propidium iodine double-labeling, JC-1 dye labeling and cell cycle kinetics analysis. The group treated with β lapachone for 72 hours showed the lowest cell viability, 27,74%, and the most conspicuous citotoxic effect, 64,81%, at 0,3 μM concentration; lower IC50, 0,180 μM and also the lowest cell growth - 0,50%- following treatment with 1,0 μM concentration. No statistical difference for cell proliferation was verified between concentrations after β lapachone exposure.Early apoptosis was the most frequent type of cell death considering all groups. It was less frequent in the 24-hour group treated with 0,1 μM (4,26 %) and more frequent in the 72-hour group treated with 1,0 μM (85,89 %). Mitochondrial depolarization was dose-dependent. Cell growth inhibition was carried out through cycle block at G0/G1 phase, according to exposure time. β lapachone was shown to have antiproliferative and cytotoxic effects, to induce apoptosis and to block cell cycle at G0/G1 phase on canine osteosarcoma cells. / O osteossarcoma é o tumor maligno das células ósseas primitivas mais diagnosticado em cães e humanos. A necessidade de medicamentos mais efetivos, com menor consequência adversa, tem gerado esforços para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos compostos por plantas e outras fontes naturais. O objetivo deste estudo foi verificar os efeitos intracelulares da β lapachona sobre células do osteossarcoma canino de cultura estabelecida, bem como identificar mecanismos de ação que possam explicar suas propriedades citotóxicas. Células de osteossarcoma canino foram obtidas do banco de linhagens celulares, subcultivadas e submetidas ao tratamento com a β lapachona, de acordo com as diferentes concentrações. Os resultados foram obtidos por meio do método de exclusão do corante azul de tripan, pelo método deredução do tetrazólio, pelo ensaio de sobrevivência clonogênica, pelo ensaio de dupla marcação com Anexina V-FITC e Iodeto de Propídio, pelo ensaio de marcação com o corante JC-1 e pela análise da cinética do ciclo celular. O grupo tratado com 0,3 μM de β lapachona apresentou melhor regressão da viabilidade celular (80,27% / 24h; 47,41% / 48h e 35,19% / 72h) e maior progressão da citotoxicidade (19,73% / 24h; 52,59% / 48h e 64,81% / 72h). O menor IC50 (0,180 μM) ocorreu no grupo tratado por 72 horas. O crescimento celular após o tratamento foi menor de acordo com o aumento da concentração e tempo de exposição, apresentando 0,50% de fração de sobrevivência na concentração de 1,0 μM. Não houve diferença estatística entre as concentrações, para a proliferação celular após o tempo de exposição à β lapachona.A apoptoseinicial foi o tipo de morte celular mais frequente em todos os grupos. Foi menor no grupo de 24 horas tratado com 0,1 μM (4,26 %) e maior no grupo de 72 horas tratado com 1,0 μM (85,89 %). A despolarização mitocondrial ocorreu de maneira dose dependente, caracterizando a apoptose intrínseca. A inibição do crescimento das células ocorreu pelo bloqueio do ciclo na fase G0/G1 conforme o tempo de exposição. Nas células de osteossarcoma canino, a β lapachona possui efeitos citotóxicos, induz apoptose intrínsecae promove o bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1.

A tuberculose é uma das principais preocupações da Organização Mundial da Saúde, principalmente após o surgimento da AIDS que alavancou os índices da doença, sendo considerada a principal causa de morte por um único agente. Além do M. tuberculosis, agente responsável pela doença em humanos, outra manifestação importante é a tuberculose em bovinos causada pelo M. bovis, que também apresenta importância epidemiológica, devido à transmissão para o homem pela ingestão de alimentos contaminados, e a escassez de dados com relação à sua prevalência na população. Programas de controle da doença nos rebanhos bovinos existem em todo o mundo, e os maiores índices da doença encontram-se nos países em desenvolvimento. Estes programas estão baseados na identificação dos animais positivos, por meio de testes de tuberculina e sacrifício dos mesmos. Lesões encontradas em exames post-mortem podem ser submetidas a estudos bacteriológicos para o isolamento e identificação do agente e histopatológicos para a caracterização da lesão, os quais demandam meses para a sua conclusão. Com o advento da biologia molecular, novos métodos são propostos para a diminuir o tempo do diagnóstico de meses para poucos dias. Com o intuito de proporcionar um panorama das novas metodologias moleculares, como a técnica de PCR, empregadas no diagnóstico da tuberculose bovina, realizou-se uma revisão bibliográfica, apresentando as vantagens e dificuldades das mesmas. Apesar dos avanços alcançados com estas técnicas, a padronização de métodos viáveis para a rotina de diagnóstico laboratorial ainda não foi obtida, sendo essencial o investimento em pesquisas com o objetivo de solucionar estas barreiras. / Tuberculosis is one of the main concern of World Health Organization, especially after the appearance of the AIDS that increased the rate of this disease that is the principal cause of death by one unique agent. Besides the tuberculosis caused by M. tuberculosis in human being, the disease caused by M. bovis in man shows epidemiological importance by its transmission trough contaminated food and the requirement of datas about its prevalence in human being. Control programs of bovine tuberculosis are present worldwide and the major rates of the disease are found in developing countries. This programs are based on test-and-slaughter, defined by the application of tuberculin test to cattle and slaughter of positive animals. Tuberculous lesions founded at post mortem inspection can be analyzed by bacteriological methods for isolation and identifying of the agent and histopathological examination that both require several days to conclusion. After the advent of molecular biology, new methods have been proposed to reduce the time of diagnostic from moths to few days. With the meaning to provide an overview of the new molecular methods applied to the bovine tuberculosis diagnosis, as PCR method, a review as carried out showing those advantages and difficulties. Although the advances reached by these techniques, the standardization of viable methods to the routine laboratory diagnosis couldn?t be reached and the investment in researches is essential to solve these barriers.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Marilia Cristina Sola.pdf: 489950 bytes, checksum: 4d267a18376c43b47c56d28c43d655a5 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Brucellosis is a chronic infectious disease caused by bacterium of the genus Brucella, which affects humans and different species of animals. Despite the implementation of programs aimed at the disease controlling and eradicating, brucelosis is endemic in many countries, especially in developing ones, resulting in significant economic losses and serious implications for animal and public health, due to its zoonotic character. The disease can be transmitted by direct or indirect contact with infected animals, fetal membranes, and also transmitted to humans by contaminated animal products, especially milk and dairy products that have not undergone thermal processing, by raw meat and the handling of carcasses and visceras at the slaughterhouse. The National Programme for Control and Eradication of Brucellosis (PNCEBT), established in the country in 2001, determines the diagnosis of animals in order to establish both the distribution and characterization of the agent. In this context and seeking for a rapid, safe and precise diagnosis of this disease in cattle, we aimed to detect Brucella spp by real time PCR in suspect lesions detected during routine inspection in slaughterhouses under Federal Inspection in the state of Goias, Brazil. Such lesions were related to cervical bursitis, testicular, lung and liver lesions and also in mandibular, retropharyngeal, esophageal, intercostal, apical, mediastinal, tracheobronchial, inguinal, ischiatic, popliteal and mesenteric lymphnodes. In the sampling procedure, cellulose cards were used for storage of biological material (card FTA ® Elute) by impregnating the material in the fibrous matrix of the card. Laboratory analyses were performed on 47 samples from animal tissue and fluids, collected from carcasses and visceras at 40 bovines suspected of brucellosis. Samples were processed at the Laboratório de Biologia Molecular from the Centro de Pesquisa em Alimentos, Escola de Veterinária e Zootecnia from Universidade Federal de Goiás (LBM / CPA / EVZ / UFG). Brucella spp was detected in 42.5% of the bovines with suspect lesions and in 38.3% of samples. It was verified that the use of real-time PCR associated with the FTA® Elute method is an important diagnostic tool in the process of trial and disposition of carcasses and visceras of slaughtered animals and it gives flexibility and efficiency for the diagnosis of diseases, helping the Federal Inspection Service in fulfilling its mission of providing safe food to consumers / A brucelose é uma enfermidade infectocontagiosa de caráter crônico, causada por bactérias do gênero Brucella, que acomete o homem e diferentes espécies animais. Apesar da implementação de programas que visam o controle e a erradicação da enfermidade, apresenta-se endêmica em muitos países, principalmente aqueles em desenvolvimento, resultando em prejuízos econômicos significativos aos sistemas de produção e sérias implicações em saúde animal e pública, visto seu caráter zoonótico. A doença pode ser transmitida pelo contato direto ou indireto com animais infectados e anexos fetais e, ainda, veiculada ao homem pela ingestão de produtos de origem animal contaminados, principalmente leite e seus derivados que não passaram por processamento térmico. Pode ser veiculada também por meio de carnes cruas e pela própria manipulação de carcaças e vísceras durante o abate sanitário. O Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) instituído no país em 2001 determina como uma das medidas sanitárias, o diagnóstico dos animais, a fim de estabelecer a ocorrência, distribuição e caracterização do agente. Neste contexto, visando um diagnóstico rápido, seguro e preciso desta enfermidade em bovinos, objetivou-se detectar o DNA de Brucella spp por meio da técnica de PCR em Tempo Real em lesões sugestivas identificadas durante a inspeção sanitária de rotina em matadouros-frigoríficos sob Inspeção Federal no estado de Goiás. Tais lesões abrangeram a bursite cervical, lesões testiculares, pulmonares, hepáticas e de linfonodos mandibular, retrofaríngeo, esofageano, intercostal, apical, mediastínico, traqueobrônquico, inguinal, isquiático, poplíteo e mesentérico. Para tanto, no procedimento de colheita de amostras, foram utilizados cartões de celulose destinados ao armazenamento de material biológico (cartão FTA® Elute), por impregnação do material na matriz fibrosa do cartão. As análises laboratoriais foram efetuadas em 47 amostras provenientes de fluidos e tecido animal, colhidas em carcaças e vísceras de 40 bovinos com suspeita de brucelose e desenvolvidas no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás (LBM/CPA/EVZ/UFG). Detectou-se o DNA de Brucella spp em 42,5% dos bovinos que apresentaram lesões sugestivas e em 38,3% das amostras totais. Verificou-se que o emprego da técnica de PCR em Tempo Real associada ao método FTA® Elute, é uma ferramenta de diagnóstico importante no processo de julgamento e destino de carcaças e vísceras dos animais de abate, tendo em vista que confere agilidade e eficiência no diagnóstico das enfermidades, auxiliando o Serviço de Inspeção Federal no cumprimento de sua missão, ou seja, de colocar à disposição do consumidor, alimentos seguros.