Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-20T15:41:58Z No. of bitstreams: 1 2017_DouglasCardosoBrandão.pdf: 4146484 bytes, checksum: 6a31b9a3476632a59df2a04d1f4fb814 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-11-23T17:40:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DouglasCardosoBrandão.pdf: 4146484 bytes, checksum: 6a31b9a3476632a59df2a04d1f4fb814 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T17:40:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DouglasCardosoBrandão.pdf: 4146484 bytes, checksum: 6a31b9a3476632a59df2a04d1f4fb814 (MD5) Previous issue date: 2017-11-23 / A marcação celular específica vem sendo continuamente aprimorada visando sua aplicação como ferramenta para a pesquisa científica e o diagnóstico. O estudo de compartimentos celulares baseado em fluorescência tem auxiliado grandemente na investigação de processos químicos e biológicos essenciais a manutenção da vida das células. Moléculas como o benzotiadiazol, possibilitam a síntese de diversos derivados fluorescentes a partir do seu forte núcleo aceptor de elétrons. A simples confirmação da atividade fluorescente intracelular já habilita estas moléculas como potenciais compostos repórteres que poderão ser acoplados a outras moléculas que apresentem avidez e estabeleçam ligações estáveis específicas com biomoléculas. Atualmente, existem diversos marcadores comerciais para marcação celular, porém estes agentes apresentam diversas desvantagens que tornam o seu uso limitado. Nosso grupo vem buscando desenvolver novas moléculas fluorescentes para aplicação em bioimageamento, visando suprir as limitações dos agentes fluorescentes comerciais de referência. Além disso, seu desenvolvimento se enquadra nos preceitos da química verde. Deste modo, trabalhamos com o núcleo 2,1,3 benzotiadiazol (BTD) que possui diversas características ideias para sondas fluorescentes. Esta pesquisa apresenta três moléculas derivadas deste núcleo BTD (BJD#UnB1, BJD#UnB2 e BJD#UnB3) e visa relacionar a estrutura química, solubilidade e o alvo celular em que são seletivas nos experimentos in vitro e in vivo. Os resultados demonstraram que os compostos BJD#UnB1 e BJD#UnB2 apresentam afinidade pela membrana plasmática, possivelmente se associando aos glicerofosfolipídeos de membrana. Sendo que o composto BJD#UnB1 apresenta o seu pico de fluorescência dentro da faixa do azul e o composto BJD#UnB2 apresenta seu pico de fluorescência dentro da faixa do verde, no espectro de luz visivel. A solubilidade destes dois compostos foi variada, onde o composto BJD#UnB2 apresentou melhor solubilidade. Apesar da marcação no citoplasma apresentada por ambos os compostos, o mesmo se repetiu com o marcador comercial de membrana plasmática CellMask®. O composto BJD#UnB3 apresentou especificidade por corpúsculos lipídicos, emitindo intenso sinal de fluorescência na faixa do verde no espectro de luz visível, esta molécula apresentou ainda solubilidade similar a do composto BJD#UnB1. Quando comparado ao Bodipy®, o composto aqui testado (BJD#UnB3) apresentou maior intensidade de fluorescência que o marcador comercial de referência. Além disso, este composto foi excelente para marcações em outros modelos como C. elegans, Zebrafish e microalgas. Além destas propriedades, todos os marcadores aqui testados apresentaram ausência de citotoxicidade, fotoestabilidade durante o uso e estabilidade em solução e no meio intracelular. / A specific cellular marking, which is continuously improved aiming its application as a tool for scientific research and diagnosis. Molecules, such as benzothiadiazole, enable the production of several fluorescent molecules derivatives, keeping its strongly electron acceptor nucleus. The simple determination of intracellular fluorescent activity has already enabled these molecules to work as potential reporters that can be coupled to other molecules that show avidity and establish specific stable bonds with other biomolecules. Currently, there are several markers used for fluorescent labeling, however, many of them show several disadivantages restricting their usage. Our group has been searching for new fluorescent molecules for bioimaging research, aiming to overcome the limitations of the commercial fluorescent agents. In addition, its development is based on processes that minimize environmental waste. Thus, we work with the 2,1,3-benzothiadiazole (BTD) nucleus that has several interesting features for fluorescent probes. This research presents three molecules derived from BTD nucleus (BJD#UnB1, BJD#UnB2 and BJD#UnB3) and aims to corelate their chemical structure, solubility and cellular target through in vitro and in vivo experiments. The results demonstrated that BJD#UnB1 and BJD#UnB2 compounds show affitinty to plasma membrane, possibly associating with membrane glycerophospholipids. Being that BJD#UnB1 compound shows higher fluorescence intensity in the blue channel and the BJD#UnB2 compound presents higher fluorescence intensity in the green channel. The solubility of these probes varied, and the compound BJD#UnB2 showed better solubility. Despite the inespecific and weaker cytoplasmic labeling compared to cell membrane staining exhibited by both compounds, this pattern was also observed for the commercial CellMask® plasma membrane marker. Compound BJD#UnB3 exhibited specificity for lipid vesicles, emitting intense fluorescence signal in the green channel and exhibiting similar solubility to compound BJD#UnB1. Compared to Bodipy®, the compound tested in this work (BJD # UnB3) showed higher fluorescence intensity than the commercial probe. Besides, this compound was excellent for stainging other models such as C. elegans, Zebrafish and microalgae. In addition, all markers showed photostability and no cytotoxicit during their use and they were stable in solution or in intracellular medium.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:37:23Z No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / A Lisofosfatidilcolina (LPC) é um lisofosfolipídio que constitui a membrana plasmática e possui um papel importante na sinalização celular, pois está diretamente associada à albumina e a lipopoliproteínas. A LPC tem um amplo espectro de atividades pró-inflamatórias e exerce um papel fundamental durante a aterosclerose, pois ela é o principal componente fosfolipídio de lipoproteínas de baixa densidade oxidada (oxLDL). Ela também é capaz de induzir a formação de células gordurosas, as quais são componentes celulares fundamentais para o estabelecimento da aterosclerose e recrutamento leucocitário para o sítio desta patologia, induzindo a progressão da doença. No entanto, o papel de LPC na ativação do inflamassoma e na modulação da biogênese de corpúsculos lipídicos (CLs) neste processo ainda é mal compreendido. Este estudo tem por objetivo investigar se LPC é capaz de ativar o inflamassoma NLRP3 e induzir a secreção de IL-1β relacionando com os mecanismos de formação de células gordurosas por meio da análise da biogênese de CLs. Nossos resultados mostraram que a LPC induz um efeito citotóxico em altas concentrações em monócitos e células endoteliais, além de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a ativação de caspase-1. A LPC induz a ativação do inflamassoma NLRP3 através da indução da secreção de IL-1β dependente de efluxo de potássio, dano lisossomal, reconhecimento via TLR-2, ativação de PPAR e estabilização das jangadas lipídicas em monócitos humanos e dependentes das caspases-1/11 e do inflamassoma NLRP3 em macrófagos peritoneais de camundongos. Além disso, a LPC induz a translocação do HMGB-1 do núcleo para o citoplasma tanto em células endoteliais quanto em monócitos. Outro resultado importante foi à indução da formação de células gordurosas, via LPC, em monócitos e células endoteliais in vitro, através do aumento da biogênese de CLs de maneira independente do inflamassoma NLRP3 e das caspases-1/11 in vivo. Além disso, as células endoteliais estimuladas com LPC ativam monócitos a se transformarem em células gordurosas, através da indução da biogênese de CL, por mecanismo ainda desconhecido. Portanto, o presente trabalho caracterizou diferentes mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação de células gordurosas, correlacionando-os com as vias de ativação dos inflamassomas e do metabolismo lipídico celular, e que corroboraram para a criação de um microambiente propício ao estabelecimento e manutenção da formação de placas ateroscleróticas. ______________________________________________________________________ ABSTRACT / Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has an important role in cell signaling because it is directly associated with albumin and lipoproteins. The LPC has a broad spectrum of pro-inflammatory activity and plays a key role in atherosclerosis, since it is a major phospholipid component of oxidized low density lipoprotein (oxLDL). Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam macrophages, which are the key cell component for the establishment of atherosclerosis and leukocyte recruitment on the site of the pathology. However, the role of LPC in modulating inflammasome activation and lipid droplet biogenesis in this process is poorly understood. This study is aimed to investigate if LPC is capable of inducing inflammasome activation and IL-1β secretion, verify the foam cell formation by analyzing lipid droplet biogenesis and characterize the signaling pathway involved in this process. Our results showed that LPC induces a cytotoxic effect in high concentrations in monocytes and endothelial cells, generation of reactive oxygen species (ROS) and activation of caspase-1. LPC induces activation of the inflammasome NLRP3 by induction of IL-1β secretion dependent of potassium efflux, and lysosomal damage via TLR-2 recognition, PPAR gamma activation and stabilization of lipid rafts in vitro, and caspase-1/11 and NLRP3 inflammasome in vivo assays. Furthermore, LPC induced translocation of HMGB1 from the nucleus towards the cytoplasm in endothelial cells and monocytes. Another important result was the induction of the formation of foam cells by LPC both in monocytes and endothelial cell in vitro assays, by increasing the biogenesis of lipid droplets in a manner independent of the NLRP3 inflammasome and caspase-1/11 in vivo. Additionally, endothelial cells stimulated with LPC activated monocytes to transform into foam cells through induction of lipid droplets biogenesis by unknown mechanism. Therefore, the present study characterized different cellular and molecular mechanisms involved in the formation of foam cells, correlating them with the activation pathways of inflammasomes and cellular lipid metabolism, and corroborated to create a favorable microenvironment for the establishment and maintenance of formation atherosclerotic plaques.

Made available in DSpace on 2014-06-12T16:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5421_1.pdf: 453041 bytes, checksum: 3fdf21fbfc2d1ccf84a25f5295e63dcd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2003 / INTRODUÇÃO: Entre suas diversas ações biológicas, o cálcio extracelular exerce um papel fundamental na manutenção da polaridade da membrana plasmática. Procurou-se avaliar o efeito da despolarização da membrana induzidas por baixa concentração extracelular de cálcio ou ouabaína na apoptose e expressão da Caspase-3 em neutrófilos (PMN). MÉTODOS: PMN foram isolados de sangue de voluntários por gradiente de densidade e cultivados por 18h em meios com concentração normal (1.8mM) ou baixa de cálcio (<10nM), ou com ouabaína (1mM), um inibidor da sódio/potássio ATPase. A apoptose foi quantificada por citometria de fluxo pela captação nuclear do iodeto de propídio. A expressão da proteína Caspase-3 foi avaliada por eletroforese de proteínas. RESULTADOS: Não foram observados efeitos na apoptose basal dos PMN com o uso isolado de estímulos despolarizantes. Entretanto, os efeitos inibitórios do lipopolissacarídeo (LPS - 1ug/ml) foram anulados quando os PMN foram cultivados em meio com baixa [Ca++], e restaurados pela adição de cátions divalentes (cálcio, estrôncio ou manganês); ouabaína, de forma similar, bloqueou o efeito do LPS. Tanto a depleção de cálcio extracelular quanto a utilização de ouabaína reduziram a expressão da forma precursora da Caspase-3. CONCLUSÃO: A cultura de PMN em meio com baixa [Ca++] ou ouabaína, dois estímulos distintos que induzem a despolarização de membrana, bloqueiam a inibição da apoptose mediada por LPS em PMN e alteram a expressão de caspases. Estas observações podem estabelecer um novo mecanismo de regulação da sobrevida dos PMN

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-01T14:05:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T14:05:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 916458 bytes, checksum: 3ba31258a09fab456ccb755153420074 (MD5) Previous issue date: 2015-12-07 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Esta tese compreende quatro capítulos. Todos os estudos aqui relatados foram executados na Colorado State University (CSU), em Fort Collins-CO/USA. Foram utilizados sêmen de seis garanhões com idade entre 15 e 21 anos, das raças Puro-Sangue Inglês, Quarto de Milha e Árabe; estabulados no Laboratório de Reprodução Equina da CSU. Capítulo 1: dividido em três experimentos. Experimento 1: objetivou-se avaliar efeito do tratamento com 2 mg de ciclodextrina carregada com colesterol e estigmastanol (CCC , CCE); 1, 2 e 3 mg de ciclodextrina carregada com óleo de salmão (S1, S2 e S3) e com óleo de semente de linho (L1, L2 e L3) nas motilidades total (MT) e progressiva (MP) dos espermatozóides após descongelamento. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos (p>0,05). Experimento 2: objetivou-se avaliar MT e MP do sêmen tratado com diferentes fontes de lipídeos sonicados em meio Whitten’s Modificado (MW), após congelamento convencional e congelamento precedido por choque pelo frio; e avaliar efeito do tratamento com 2 mg de CCC e CCE sobre motilidades após choque pelo frio. Os tratamentos usando lipídeos foram: 3 e 6 mg de óleo de salmão (S3 e S6), de óleo de semente de linho (L3 e L6), de gema de ovo de galinha (G3 e G6), de óleo fígado de bacalhau (B3 e B6) e de óleo de açafrão (A3 e A6). Nenhum dos tratamentos utilizando lipídeos melhorou motilidade após congelamento convencional (p>0,05). Para o sêmen submetido a 0 oC por 30 minutos, os tratamentos G6, CCC e CCE melhoraram MT e MP (p<0,05). Experimento 3: utilizou-se cromatografia gasosa para avaliar eficiência dos tratamentos em alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática. Os tratamentos foram: 6 μg de óleo de semente de linho diluído em etanol (L1); 2 mg de ciclodextrina carregada com óleo de semente de linho (L2) e 6 mg de óleo de semente de linho sonicado em MW (L3). Nenhum dos tratamentos foi capaz de alterar o perfil de ácidos graxos da membrana espermática (p>0,05). Capítulo 2: objetivou-se mensurar quantidade de colesterol e estabelecer a relação colesterol:fosfolipídeos na membrana plasmática de células espermáticas tratadas com diferentes quantidades de CCC (0, 2, 4, 6 e 8 mg). Foram utilizados kit comercial (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) para mensuração do colesterol e ensaio de ferrotiocianato de amônio para mensuração dos fosfolipídeos totais. A quantidade de colesterol encontrada nas células tratadas com 0, 2, 4, 6 e 8 mg de CCC foram respectivamente 0,22; 0,58; 0,77; 0,91 e 1,07 μg/10 6 de espermatozóides, e a relação colesterol:fosfolipídeos para os mesmos tratamentos foram 0,39; 0,72; 1,0; 1,16 e 1,36. A quantidade de colesterol na membrana foi maior a partir do uso de 2 mg de CCC (p<0,05), e a relação colesterol:fosfolipídeos a partir do tratamento com 4 mg de CCC (p<0,05). Capítulo 3: neste estudo o objetivo foi avaliar o comportamento do sêmen sem tratamento (CT) ou tratado com 20% de plasma seminal (PS) e 40 μM de PC-12 (PC) em eventos ligados à capacitação espermática durante incubação por 30 minutos (avaliações foram feitas no tempo 0 – T0, 5 – T5, 15 – T15 e 30 minutos – T30). Para isso cada um dos tratamentos foi submetido a quatro diferentes corantes: 1- CoroNa Green, que quantifica sódio intracelular (CG); 2- Fluo-3, que quantifica cálcio intracelular (Fluo); 3- FITC-PNA, que quantifica reação acrossômica (FP) e 4- Merocianina, que caracteriza fluidez/desorganização da membrana plasmática (Mero). Yo-Pro-1 ou iodeto de propídeo foram utilizados para avaliar integridade de membrana plasmática. As amostras foram lidas em citometria de fluxo. O tratamento com PC-12 aumentou o percentual de células com acrossoma reagido, detectada na avaliação aos 30 minutos. Este percentual, de 33%, foi maior que o dos demais tratamentos no mesmo tempo (CT: 13% e PS: 4%) e superior aos percentuais para o próprio PC-12 nos tempos 0 (7%), 5 (9%) e 15 minutos (16%). Com relação à fluidez da membrana plasmática não houve diferença no percentual de células com merocianina elevada entre os diferentes tratamentos, nem entre um mesmo tratamento ao longo do tempo (p>0,05). O estudo revelou efluxo de sódio das células espermáticas equinas viáveis após 15 minutos de incubação, sendo que nos tempos 15 e 30 minutos o percentual de celulas positivas para CG foram menores para tratamento com plasma seminal (8,8 e 4,8%) e maiores para tratamento com PC-12 (36 e 15,4%), em relação ao controle (23,6 e 11,8%, p<0,05). Após 15 minutos de incubação o sêmen dos três tratamentos apresentou percentual de células positivas para Fluo superior ao tempo 0, porém o plasma seminal retardou a entrada deste íon nas células, visto que, no T15 percentual de células Fluo+ foi menor que nos outros tratamentos (CT: 87%; PS: 59% e PC: 95%, p<0,05), voltando a se igualar no tempo 30 minutos (CT: 98%%; PS: 85% e PC: 97%, p>0,05). O meio MW utilizado foi capaz de induzir efluxo de sódio e influxo de cálcio, alterações que caracterizam capacitação espermática. Capítulo 4: os objetivos aqui foram avaliar eficiência de diluidores a base de gema de ovo (Lactose-EDTA) ou gema de ovo associada a leite em pó (FR5 modificado – FR5M) e eficiência do glicerol (GLI) ou da combinação deste com metilformamida (MF) em manter MT e MP dos espermatozóides após congelamento usando diferentes protocolos (0: congelamento sem resfriamento; 20: resfriamento em palhetas por 20 minutos a 5 oC antes do congelamento; 120T: resfriamento do sêmen em tubos por 120 minutos a 5 oC; 120P: resfriamento do sêmen em palhetas por 120 minutos a 5 oC). O FR5M preservou melhor a MP de células espermáticas em todos os protocolos de congelamento utilizados, mostrando benefício da combinação da gema de ovo com leite em pó no diluente de congelamento (15%, 21%, 26% e 25% para 0, 20, 120T e 120P, respectivamente, vs. 9%, 14%, 19% e 17%, para lactose-EDTA, p<0,05). A utilização de Lactose-EDTA 5%GLI apresentou resultados superiores para MT e MP se comparado ao mesmo diluidor com 3%MF + 2%GLI, o que mostra que o glicerol é um crioprotetor que pode ser utilizado em diferentes protocolos de congelamento (MT para Lactose-EDTA 5%GLI = 33%, 45%, 56% e 53% para 0, 20, 120T e 120P vs. 20%, 30% 35% e 36% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05; MP para Lactose-EDTA 5%GLI = 19% e 17% para 120T e 120P vs. 11% e 10% para Lactose-EDTA 3%MF+ 2%GLI, p<0,05). O resfriamento do sêmen antes do congelamento pode ser realizado tanto em tubos quanto em palhetas de 0,5 mL, sem prejuízos às motilidades total e progressiva do sêmen após congelamento. / This thesis is compounded by four chapters. All work reported here were performed at Colorado State University (CSU), located in Fort Collins, CO / USA. Six stallions between 15 and 21 years old (Thoroughbred, Quarter Horse and Arabian breeds) and stabled at Equine Reproduction Laboratory at CSU were used in all experiments. Chapter 1: comprised by three experiments. Experiment 1: aimed to evaluate the effects on total motility (TM) and progressive motility (PM) after semen thawing from treatments with 2 mg of cyclodextrin-loaded-cholesterol and 2 mg of cyclodextrin-loaded-stigmastanol (CLC, CLS); 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin-loaded-salmon oil (S1, S2 and S3); and 1, 2 and 3 mg of cyclodextrin- loaded-flax seed oil (F1, F2, and F3). No differences among treatments were detected (p>0.05). Experiment 2: aimed to evaluate TM and PM of semen treated with different sonicated lipids into Modified Whitten’s Medium (MW), after conventional freezing and freezing preceded by cold shock, and assess the effect of treatment with 2 mg of CLC and CLS on motility after cold shock. Treatments using lipids were: 3 and 6 mg of salmon oil (S3 and S6); 3 and 6 mg of flax seed oil (F3, F6); 3 and 6 mg of egg yolk (E3 and E6); 3 and 6 mg of cod liver oil (C3 and C6), 3 and 6 mg of safflower oil (SF3 and SF6). None of the lipid treatments improved motility after conventional freezing (p>0.05). For semen subjected to 0 °C for 30 minutes, TM and PM increased in semen treated with E6, CLC and CLS (p<0.05). Experiment 3: gas chromatography was used to evaluate effectiveness of treatments in altering the sperm membrane fatty acid profile. The treatments were: 6 μg of flax seed oil diluted with ethanol (F1); 2 mg of cyclodextrin-loaded- flax seed oil (F2) and 6 mg of flax seed oil sonicated in MW (F3). None of the treatments was able to change fatty acid profile in the sperm membrane (p>0.05). Chapter 2: aimed to measure the amount of cholesterol and to establish the cholesterol:phospholipids ratio in plasma membrane of fresh equine sperm cells treated with different amounts of CLC (0, 2, 4, 6 and 8 mg). A commercial kit was used to measure cholesterol (Cholesterol Liquicolor, Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA) and an ammonium ferrothiocyanate assay for total phospholipids measurement. Amount of cholesterol found for cells treated with 0, 2, 4, 6 and 8 mg CLC were, respectively, 0.22; 0.58; 0.77; 0.91 and 1.07 micrograms/10 6 sperm, and cholesterol:phospholipids ratios to the same treatments were 0.39; 0.72; 1.0; 1.16 and 1.36, respectively. Increase in cholesterol amount was observed when 2 mg of CLC was used (p<0.05), and cholesterol:phospholipids ratio was higher with 4 mg of CLC (p<0.05). Chapter 3: in this study the objective was to evaluate the response of fresh equine semen without treatment (CT) or treated with 20% of seminal plasma (SP) and 40 μM PC-12 (PC) in events related to sperm capacitation during incubation for 30 minutes (evaluations made at time 0 - T0, 5 - T5, 15 – T15 and 30 minutes - T30). Each treatment was subjected to four different dyes: 1- CoroNa Green, which measures intracellular sodium (CG); 2- Fluo-3, which measures intracellular calcium (Fluo); 3- FITC-PNA, which measures acrosome reaction (FP) and 4- Merocyanine, which characterizes plasma membrane fluidity/destabilization (Mero). Yo-Pro-1 or propidium iodide were used to assess cell membrane integrity. Samples were read in flow cytometry. An increased percentage of cells with reacted acrosome was observed in semen treated with PC-12 at T30. This proportion (33%) was higher than the other treatments at the same time (CT: 13% and SP: 4%) and higher than the proportion for PC-12 at T0 (7%), T5 (9%) and T15 (16%). There was no difference in the percentage of cells with high merocyanine between different treatments or between the same treatment over time (p>0.05). The study showed sodium efflux after 15 minutes incubation, and at times 15 and 30 minutes the percentage of positive cells for GC were lower in SP treatment (8.8 and 4.8%) and higher for PC-12 (36 and 15.4%) compared to the CT (23.6 and 11.8%, p <0.05). At T15 the semen of all treatments showed higher proportion of Fluo positive cells than T0, but seminal plasma delayed entry of the ion into the cells, since at T15 Fluo proportion of positive cells was lower than the other treatments (CT: 87%; SP: 59% and PC: 95%, p<0.05) and became similar at T30 (CT = 98%, SP= 85% and PC=97%, p> 0.05). The semen extender used was able to inducing sodium efflux and calcium influx, changes characterizing sperm capacitation. Chapter 4: the objectives were to evaluate efficiency of an egg yolk–based medium (lactose-EDTA) or egg yolk associated with powdered milk (modified FR5 - MFR5), and efficiency of glycerol (GLY) or a combination between GLY and dimethylformamide (MF) to maintain TM and PM sperm after freezing using different protocols (0: no cooling; 20: cooling straws for 20 minutes at 5 °C before freezing; 120T: cooling in tubes for 120 minutes at 5 °C; and 120P: cooling in straws for 120 minutes at 5 °C). MFR5 preserved PM in all freezing protocols, showing the benefit of the combination of egg yolk with powdered milk for freezing diluent (15%, 21%, 26% and 25% for 0, 20, 120T and 120P, respectively, vs. 9%, 14%, 19% and 17% for lactose-EDTA, p<0.05). The use of lactose-EDTA 5%GLY showed superior results for TM and PM if compared to the same medium with 3%MF + 2%GLY, indicating that glycerol is a cryoprotectant that can be used in several different freezing protocols (TM for Lactose-EDTA 5%GLY = 33%, 45%, 56% and 53% for 0, 20, 120T and 120P vs. 20% 30% 35% and 36% for LactoseEDTA 3%MF + 2%GLY, p <0.05; MP for Lactose-EDTA 5%GLY = 19% and 17% at 120T and 120P vs. 11% and 10% for Lactose-EDTA 3%MF + 2%GLY, p<0.05). The cooling before freezing can be performed either in tubes as in 0.5 mL straws for 120 minutes, without damage to total and progressive motility of thawed semen.

Submitted by Cássia Muniz (casmuniz@gmail.com) on 2018-09-27T14:04:12Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - CASSIA MUNIZ-27-09-2018-homologação.pdf: 2384230 bytes, checksum: 11fb335941c1a8010de17a3fad250071 (MD5) / Approved for entry into archive by NUBIA OLIVEIRA (nubia.marilia@ufba.br) on 2018-10-03T19:04:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - CASSIA MUNIZ-27-09-2018-homologação.pdf: 2384230 bytes, checksum: 11fb335941c1a8010de17a3fad250071 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-03T19:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - CASSIA MUNIZ-27-09-2018-homologação.pdf: 2384230 bytes, checksum: 11fb335941c1a8010de17a3fad250071 (MD5) / O aprendizado dos conceitos científicos está atrelado a aprender a falar ciência utilizando seu próprio repertório para dar o sentido ao mundo. Para tanto, os estudantes necessitam saber os significados dos termos e combiná-los de acordo com as normas semântica aceitas pela ciência escolar. Considerando a perspectiva sociocultural de aprendizagem, foi criada a ferramenta de avaliação da apropriação da linguagem da ciência escolar (FAALSCE) (SEPULVEDA et al.,2011), no contexto do grupo Colaboração em Pesquisa e Prática em Educação Científica, a fim de avaliar as respostas discursivas dos alunos para questões que tratavam sobre o conceito de adaptação numa visão darwiniana. Estes autores pretendem analisar os textos dos estudantes em Biologia funcional e, também, para tornar os dados produzidos pela ferramenta passíveis de serem analisados quantitativamente, então esta pesquisa surge no sentido de preencher estas lacunas. Foram analisados 78 textos produzidos sobre o tema sinalização e transporte de substâncias, em particular o transporte da glicose por estudantes do ensino médio de uma escola estadual do estado da Bahia, do município de Salvador em resposta a um questionamento presente no teste aplicado ao final da sequência didática de membrana plasmática com foco em modelos. O padrão temático foi construído com base nos livros didático, a literatura acadêmica e o discurso do professor. As relações semânticas entre os conceitos foram hierarquizadas em três níveis: básico (relações semânticas relacionadas a estrutura); intermediário (relações semânticas que estabeleciam o vínculo entre estrutura a função) e avançado (condensações semânticas que estabelecem a ligação entre diferentes processos). Os textos dos alunos foram analisados de acordo com 4 critérios: (1) relações semânticas; (2) ressignificação; (3) uso dos termos; (4) domínio da linguagem social da ciência escolar. A FAALSCE pode ser utilizada na análise de textos referentes a Biologia Funcional, uma vez que foi possível, utilizando os critérios, classificar os estudantes de acordo com seus escores. Os percentuais de congruência entre o padrão semântico apresentado no texto do estudante e o padrão da linguagem da ciência escolar foi no máximo de 16% para a relação proteína receptora agente do processo reconhecimento de substâncias. Com relação a ressignificação, 83% utilizaram suas próprias palavras para fala ciência. Os dados não permitem uma análise precisa sobre o domínio da linguagem, uma vez que a pergunta era especifica e os termos teóricos foram oferecidos na questão. Observou-se que 47% utilizaram as palavras como forma imprecisa com relação aos seus conceitos e que 38% de forma indicativa nomeando os objetos e processos, apenas 15% dos alunos conseguiram a apropriação conceitual dos termos. A FAALSCE permite, também, mapear as concepções alternativas acerca do conteúdo investigado. Nossos resultados apontam que apesar da necessidade de alguns ajustes metodológicos no sentido de solicitar que os alunos escrevam dois textos (sem e com palavraschave) e a questão precisar ser mais geral, a FAALSCE pode ser usada tanto para pesquisa quanto na prática educacional de Biologia, se a perspectiva de aprendizagem adotada for sociocultural. / The learning of scientific concepts is linked to learning to talk science using its own repertoire to give meaning to the world. Therefore, students need to know the meanings of terms and combine them according to the semantic rules accepted by the school science. Considering the sociocultural perspective of learning, was created the evaluation tool of appropriation of school science language (FAALSCE) (SEPULVEDA et al., 2011) in the context of the Collaboration Group Research and Practice in Science Education, in order to assess the discursive student responses to questions dealing on the concept of adaptation in a Darwinian view. The authors intend to analyze the texts of students in functional biology and also to make the data produced by the subject tool to be analyzed quantitatively, then this research arises in order to fill these gaps. They analyzed 78 texts produced on the subject signaling and transport of substances, in particular the transport of glucose by high school students from a public school of Bahia, in the city of Salvador in response to this question in the test applied to the end of didactic sequence of plasma membrane with a focus on models. The thematic pattern was built on the textbook, academic literature and the teacher's speech. The semantic relations between the concepts were prioritized into three levels: basic (semantic relationships related to structure); intermediate (semantic relations that established the link between structure function) and advanced (semantic condensations that establish the connection between different processes). The texts of the students were analyzed according to four criteria: (1) semantic relationships; (2) reframing; (3) use of terms; (4) the field of social language school science. The FAALSCE can be used in the analysis of texts related to Functional Biology, since it is possible, using criteria, classifying students according to their scores. The percentages of congruence between the semantic pattern presented in the student text and the pattern of school science language was a maximum of 16% for the ratio receptor protein agent process recognition substances. Regarding reframing, 83% used their own words to talk science. The data do not allow a precise analysis on the mastery of language, since the question was specific and theoretical terms have been offered in the issue. It was observed that 47% used the words as inaccurate with respect to its concepts and that 38% indicatively naming objects and processes, only 15% of students achieved the conceptual appropriation of the terms. The FAALSCE also allows mapping the misconceptions about the content investigated. Our results show that despite the need for some methodological adjustments in order to ask students to write two texts (with and without keywords) and the issue needs to be more general, FAALSCE can be used both for research and in educational practice Biology, the prospect of learning adopted for sociocultural

Submitted by Felipe Lapenda (felipe.lapenda@ufpe.br) on 2015-03-16T13:44:17Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DIssertação Isabeli corrigida pretext.pdf: 929080 bytes, checksum: 12855f890850670d671974b1c5f7a8f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-16T13:44:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DIssertação Isabeli corrigida pretext.pdf: 929080 bytes, checksum: 12855f890850670d671974b1c5f7a8f5 (MD5) Previous issue date: 2013 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico ; Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco / A serotonina atua na regulação de eventos biológicos envolvidos no desenvolvimento precoce do sistema nervoso. Neste período crítico o aumento dos níveis encefálicos deste neurotransmissor pode alterar componentes do sistema serotoninérgico, como o transportador de serotonina. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina bloqueiam o transportador e aumentam a quantidade de serotonina extracelular. O aumento farmacologicamente induzido neste período é capaz de gerar alterações funcionais e estruturais permanentes ao sistema nervoso. Este estudo teve como objetivo avaliar a expressão gênica do SERT e o conteúdo de 5-HT no hipotálamo de ratos manipulados com fluoxetina durante a lactação. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos, de acordo com a manipulação farmacológica realizada do 1º ao 21º dia de vida, Salina (n=9) e Fluoxetina (n=10), compostos por filhotes que receberam, respectivamente, solução de salina (NaCl 0.9%, 10μl/g, s.c.) e fluoxetina (10mg/kg, 10μl/g, s.c.). Foram analisados: a expressão gênica do SERT realizada no hipotálamo aos 21 e 40 dias e o peso corporal foi mensurado nos dias 1, 7, 14, 21 e 40. O presente trabalho demonstrou que a manipulação neonatal com fluoxetina promoveu menor ganho de peso corporal a partir do 14º dia até o final do experimento e aumento na expressão gênica do SERT aos 40 dias. Estes resultados indicam que a manipulação neonatal crônica do sistema serotoninérgico desencadeia alterações no principal componente de controle da neurotransmissão serotoninérgica, o SERT e consequentemente no neurotransmissor serotonina.

A epilepsia é a segunda causa mais freqüente de doenças neurológicas em adultos. A maioria dos pacientes epilépticos apresenta epilepsia do lobo temporal (ELT), cuja zona epileptogênica está localizada no lobo temporal. Altas taxas de psicopatologias são observadas em pacientes com epilepsia, principalmente ELT, quando comparados com a população geral. Uma vez que o neurotransmissor serotonina (5-HT) contribui com o neurodesenvolvimento, funcionalidade e plasticidade do cérebro adulto, alterações na neurotransmissão serotoninérgica poderiam contribuir para a etiologia da epilepsia. Além disso, a disfunção na atividade serotoninérgica no cérebro poderia aumentar a susceptibilidade a psicopatologias nos pacientes com epilepsia. Nesta linha, estudos de PET demonstraram uma diminuição no potencial de ligação dos receptores de serotonina (5-HT1A) em pacientes com epilepsia do lobo temporal, sendo que esta diminuição parece ser mais proeminente em pacientes epilépticos com depressão. Assim, genes relacionados com a neurotransmissão serotoninérgica são importantes candidatos para estudos de associação com a epilepsia. No presente trabalho, nós avaliamos o impacto de polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) e no gene do receptor 5-HT1A na ELT e em suas comorbidades psiquiátricas. O gene do transportador da serotonina apresenta dois polimorfismos com consequências funcionais na sua expressão: uma inserção/deleção de 44 pares de base na região flanqueadora 5’ (5-HTTLPR), e um número variável de repetições em tandem (VNTR) no intron 2 (5-HTTVNTR). O gene codificador do receptor 5-HT1A contém um polimorfismo de troca única de base (SNP) na região promotora (C-1019G) que altera a expressão gênica. Foram incluídos neste estudo 175 pacientes com ELT, dos quais 155 tinham avaliação neuropsiquiátrica, e 155 controles saudáveis. Primeiramente foi avaliado o impacto dos polimorfismos 5HTTLPR, 5HTTVNTR e C- 1019G na epilepsia do lobo temporal. Analisando os genótipos do 5-HTTVNTR e 5- HTTLPR combinados pela atividade transcricional, os genótipos de baixa expressão gênica foram mais freqüentes nos pacientes com ELT que nos controles saudáveis (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). Esta associação com genótipos de baixa atividade trascricional do 5-HTT poderia estar relacionada com alterações funcionais do sistema serotoninérgico, aumentando o risco para epilepsia. Entretanto, não foi encontrada associação entre o polimorfismo C-1019G e a ELT. Na segunda parte deste trabalho, nós avaliamos a influência destes polimorfismos nas comorbidades de doenças psiquiátricas, entre elas transtorno de humor e ansiedade, em pacientes com ELT. Não foi encontrada diferença significativa na frequência dos polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) entre pacientes com ou sem comorbidade psiquiátrica. Entretanto o polimorfismo C-1019G foi associado com transtorno de ansiedade nos pacientes com ELT. Baseado em nossos resultados, sugerimos que alterações em genes relacionados à serotonina, como 5-HTT e 5-HT1A, poderiam estar envolvidas na gênese da ELT e nas características clínicas desta doença. Além disso, nós acreditamos que estudos futuros realizados com essa metodologia serão importantes para o estabelecimento das bases genéticas envolvidas nas manifestações neuropsiquiátricas da epilepsia do lobo temporal. / Epilepsy is the second most frequent cause of neurological disorders in young adults. The majority of the patients suffer from temporal lobe epilepsy (TLE). Higher rates of psychopathology are observed in patients with epilepsy, especially in those with TLE. Since neurotransmitter serotonin (5-HT) contributes to neurodevelopment, functionality and plasticity of the adult brain, serotonin may contribute to the etiology of epilepsy. Moreover, the impairment of serotoninergic activity in the brain may enhance susceptibility to psychopathologies in patients with epilepsy. In this line, PET studies showed a decreased serotonin receptor 1A binding in TLE patients, and this alteration seems to be higher in epileptic patients with depression. In this study we evaluated the impact of serotonin transporter (5-HTT) gene and serotonin receptor 1A (5-HT1A) polymorphisms over TLE and its psychiatric comorbidities. The 5-HTT gene has two polymorphisms with functional consequences: a 44 base pairs insertion/deletion polymorphism in the 5’ flanking region of this gene (5-HTTLPR), and a variable number of tandem repeats in the intron 2 (5-HTTVNTR). The gene encoding serotonin receptor 1A contains a single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region (C-1019G) that regulates gene expression. In this study, were included 165 TLE patients, 155of these had been evaluated for neuropsychiatric disease, and 110 health controls. We first evaluated the impact of 5HTTLPR, 5HTTVNTR and C-1019G in temporal lobe epilepsy. When 5-HTTVNTR and 5-HTTLPR genotypes were combined by transcriptional efficiency, the low expressing genotypes were more frequent in TLE patients than in healthy controls (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). This could be related to functional alterations and outgrowth inhibition of the serotonin system, and subsequently enhance the risk to epilepsy in adulthood. However we did not find an association between C-1019G and TLE. In the second part of this work we evaluated the influence of these polymorphisms on the risk for psychiatric diseases in these patients, among them mood and anxiety disorder. There were no significant differences between genotypes frequencies of 5-HTT polymorphisms and presence of any psychiatry disease. However, the C-1019G polymorphism was associated with anxiety disorder in TLE patients. Based in our results, we suggest that alteration in serotonin related genes, such as 5-HTT and 5- HT1A, might be involved in the genesis of TLE and in clinical characteristics of this disease. Moreover we believe that further studies involving molecular methodologies will be important to establish the genetic bases involved in the neuropsychiatric manifestations of TLE.

Introdução: Inúmeros estudos têm associado alterações no sistema serotoninérgico com doenças psiquiátricas como a depressão e os atos suicidas. O polimorfismo funcional no gene transportador da serotonina (5-HTTLPR) é descrito como uma inserção/deleção de 44 pares de base na região polimórfica do gene 5-HTT (5- HTTLPR) tendo dois alelos: "longo"(l) e "curto"(s). Diversos estudos mostraram evidências da associação da variante alélica curta (alelo "s" ou short) com o comportamento suicida. Novas variantes alélicas foram descritas dentro do polimorfismo 5-HTTLPR na forma de um polimorfismo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polymorphism) que gera um funcionamento multialélico na região reguladora do gene (5-HTTLPR). A maioria dos trabalhos envolvendo este polimorfismo analisou os desfechos considerando apenas a forma bialélica. As novas variantes (forma multialélica) foram pouco estudadas associadas ao comportamento suicida. Dessa forma realizamos o estudo 1, que permitiu a análise da forma multialélica deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. A enzima catecol-orto-metil-transferase (COMT) aparece em alguns estudos como estando associada ao comportamento suicida. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. A avaliação diagnóstica foi feita através de entrevista psiquiátrica clínica e por entrevista diagnóstica padronizada breve Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) para adultos e nos pacientes foi aplicada a escala Suicide Intent Scale (SIS). A região promotora do gene 5-HTT contendo o polimorfismo 5-HTTLPR e a região do gene COMT contendo o polimorfismo Val158Met foram amplificadas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os produtos da PCR foram analisados por RFLP e a análise dos fragmentos resultantes foram visualizados por eletroforese em gel agarose 3%. Resultados: No primeiro estudo não foi encontrada associação entre as novas variantes do polimorfismo 5-HTTLPR com tentativas de suicídio em pacientes deprimidos. Em nossa análise também não encontramos uma associação entre o polimorfismo (rs165388) com comportamento suicida. Conclusão: Mesmo com resultados negativos, este trabalho permitiu avaliar pela primeira vez as novas variantes alélicas do polimorfismo do gene transportador da serotonina e analisar o polimorfismo Val158Met do gene da COMT em uma amostra brasileira de pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. Sugerimos que novos estudos sejam realizados no sentido compreender o papel destes polimorfismos no comportamento suicida. / Introduction: The serotonergic route has been intensively studied regarding the involvement in several psychiatric disorders including major depression and suicide behavior. The serotonin transporter gene (5-HTT) is one of the most studied candidate genes for suicide behavior. A polymorphism corresponding to an insertion/deletion of 44 base pairs in the promoter region of this gene (5 - HTTLPR), originates two alleles (l- long e s-short). Several studies have demonstrated an evidence for the association among this polymorphism (specially the s variant) and suicide behavior. New allelic variants within the 5-HTTLPR polymorphism were described which generates a multiallelic functioning in the regulatory region of the 5- HTT gene. The analysis of an imbedded SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was rarely studied in association with suicide behavior and the vast majority of publications involving this polymorphism analyzed only the biallelic form. Thus, we decided to perform study 1, which allowed a multiallelic analysis of this polymorphism in depressed patients who attempted suicide. The enzyme catechol - o - methyltransferase (COMT) has been shown in a few studies as being associated to such behavior. A polymorphism (rs165388) in the gene that codes for the enzyme produces a substitution of valine for methionine at codon 158 (COMT Val158Met) which results in the trimodal distribution ([AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] of the COMT activity. This is one of the most studied polymorphisms in psychotic and schizophrenic patients, although with few evidences of positive association. Because this polymorphism has been poorly studied in non psychotic patients with suicide behavior, we decided to investigate a possible participation of such polymorphism in our sample (study 2). Methods: These are case-control candidate gene studies for suicide behavior. Subjects were cautiously paired for sex and age and all were Caucasians. The sample of the first study consisted of 94 patients and the control group was a convenience sample comprising 94 employees of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) without psychiatric disorders. The second study comprised the same sample with 176 subjects also paired for sex and age (88 cases and 88 controls). Cases and controls were evaluated by a Psychiatric Interview and the Mini International Neuropsychiatry Interview (MINI). A semi-structured interview was used to access sociodemographic data and clinical history. The Beck’s Suicidal Intention Scale (SIS) was used for the patients interviewed by the psychiatrist. The region of the 5-HTT gene containing the biallelic polymorphism and the region of the COMT gene containing the Val/Met polymorphism were amplified under Polymerase Chain Reaction. The amplified products of 5-HTT polymorphism were determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. The digestion products were visualized by 3% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide under UV light. Results: In our first study, we did not find an association with the new allelic variants of 5-HTTLPR among depressed patients with suicide attempts. Also we did not find an association with the rs165388 polymorphism (COMT) with suicide attempts in depressed patients. Conclusion: Even with a negative result, this work allowed, for the first time, the new allelic variants of 5-HTT and analyze the COMT Val158Met polymorphism with suicide attempts in depressed patients. We suggest more studies in order to understand the role of these polymorphisms in suicide behavior.

Introdução: Inúmeros estudos têm associado alterações no sistema serotoninérgico com doenças psiquiátricas como a depressão e os atos suicidas. O polimorfismo funcional no gene transportador da serotonina (5-HTTLPR) é descrito como uma inserção/deleção de 44 pares de base na região polimórfica do gene 5-HTT (5- HTTLPR) tendo dois alelos: "longo"(l) e "curto"(s). Diversos estudos mostraram evidências da associação da variante alélica curta (alelo "s" ou short) com o comportamento suicida. Novas variantes alélicas foram descritas dentro do polimorfismo 5-HTTLPR na forma de um polimorfismo de nucleotídeo único (Single Nucleotide Polymorphism) que gera um funcionamento multialélico na região reguladora do gene (5-HTTLPR). A maioria dos trabalhos envolvendo este polimorfismo analisou os desfechos considerando apenas a forma bialélica. As novas variantes (forma multialélica) foram pouco estudadas associadas ao comportamento suicida. Dessa forma realizamos o estudo 1, que permitiu a análise da forma multialélica deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. A enzima catecol-orto-metil-transferase (COMT) aparece em alguns estudos como estando associada ao comportamento suicida. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. Um polimorfismo (rs165388) no gene que codifica a enzima produz uma substituição de uma valina por metionina no códon 158 (COMT Val158Met) que resulta na distribuição trimodal [AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] da atividade da COMT. A variante Val/Met da enzima COMT é um dos mais estudados polimorfismos analisados em pacientes psicóticos e esquizofrênicos embora com poucas evidências de associação com tais doenças. Devido à existência de poucos trabalhos envolvendo este polimorfismo com comportamento suicida decidimos investigar uma possível participação deste polimorfismo em pacientes deprimidos que tentaram o suicídio que está descrita no artigo 2. Métodos: Este foi um estudo caso-controle para de genes candidatos para o comportamento suicida. A amostra foi pareada para sexo e idade e composta por indivíduos caucasianos. No primeiro estudo a amostra foi composta de 94 pacientes deprimidos que tentaram suicídio e 94 controles sem diagnóstico psiquiátrico e no estudo 2 a amostra foi de 88 pacientes e 88 controles também pareados por sexo e idade. A avaliação diagnóstica foi feita através de entrevista psiquiátrica clínica e por entrevista diagnóstica padronizada breve Mini International Neuropsychiatric Interview (MINI) para adultos e nos pacientes foi aplicada a escala Suicide Intent Scale (SIS). A região promotora do gene 5-HTT contendo o polimorfismo 5-HTTLPR e a região do gene COMT contendo o polimorfismo Val158Met foram amplificadas através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Os produtos da PCR foram analisados por RFLP e a análise dos fragmentos resultantes foram visualizados por eletroforese em gel agarose 3%. Resultados: No primeiro estudo não foi encontrada associação entre as novas variantes do polimorfismo 5-HTTLPR com tentativas de suicídio em pacientes deprimidos. Em nossa análise também não encontramos uma associação entre o polimorfismo (rs165388) com comportamento suicida. Conclusão: Mesmo com resultados negativos, este trabalho permitiu avaliar pela primeira vez as novas variantes alélicas do polimorfismo do gene transportador da serotonina e analisar o polimorfismo Val158Met do gene da COMT em uma amostra brasileira de pacientes deprimidos que tentaram o suicídio. Sugerimos que novos estudos sejam realizados no sentido compreender o papel destes polimorfismos no comportamento suicida. / Introduction: The serotonergic route has been intensively studied regarding the involvement in several psychiatric disorders including major depression and suicide behavior. The serotonin transporter gene (5-HTT) is one of the most studied candidate genes for suicide behavior. A polymorphism corresponding to an insertion/deletion of 44 base pairs in the promoter region of this gene (5 - HTTLPR), originates two alleles (l- long e s-short). Several studies have demonstrated an evidence for the association among this polymorphism (specially the s variant) and suicide behavior. New allelic variants within the 5-HTTLPR polymorphism were described which generates a multiallelic functioning in the regulatory region of the 5- HTT gene. The analysis of an imbedded SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was rarely studied in association with suicide behavior and the vast majority of publications involving this polymorphism analyzed only the biallelic form. Thus, we decided to perform study 1, which allowed a multiallelic analysis of this polymorphism in depressed patients who attempted suicide. The enzyme catechol - o - methyltransferase (COMT) has been shown in a few studies as being associated to such behavior. A polymorphism (rs165388) in the gene that codes for the enzyme produces a substitution of valine for methionine at codon 158 (COMT Val158Met) which results in the trimodal distribution ([AA (Met/Met), AG (Val/Met) e GG (Val/Val)] of the COMT activity. This is one of the most studied polymorphisms in psychotic and schizophrenic patients, although with few evidences of positive association. Because this polymorphism has been poorly studied in non psychotic patients with suicide behavior, we decided to investigate a possible participation of such polymorphism in our sample (study 2). Methods: These are case-control candidate gene studies for suicide behavior. Subjects were cautiously paired for sex and age and all were Caucasians. The sample of the first study consisted of 94 patients and the control group was a convenience sample comprising 94 employees of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) without psychiatric disorders. The second study comprised the same sample with 176 subjects also paired for sex and age (88 cases and 88 controls). Cases and controls were evaluated by a Psychiatric Interview and the Mini International Neuropsychiatry Interview (MINI). A semi-structured interview was used to access sociodemographic data and clinical history. The Beck’s Suicidal Intention Scale (SIS) was used for the patients interviewed by the psychiatrist. The region of the 5-HTT gene containing the biallelic polymorphism and the region of the COMT gene containing the Val/Met polymorphism were amplified under Polymerase Chain Reaction. The amplified products of 5-HTT polymorphism were determined by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. The digestion products were visualized by 3% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide under UV light. Results: In our first study, we did not find an association with the new allelic variants of 5-HTTLPR among depressed patients with suicide attempts. Also we did not find an association with the rs165388 polymorphism (COMT) with suicide attempts in depressed patients. Conclusion: Even with a negative result, this work allowed, for the first time, the new allelic variants of 5-HTT and analyze the COMT Val158Met polymorphism with suicide attempts in depressed patients. We suggest more studies in order to understand the role of these polymorphisms in suicide behavior.

A epilepsia é a segunda causa mais freqüente de doenças neurológicas em adultos. A maioria dos pacientes epilépticos apresenta epilepsia do lobo temporal (ELT), cuja zona epileptogênica está localizada no lobo temporal. Altas taxas de psicopatologias são observadas em pacientes com epilepsia, principalmente ELT, quando comparados com a população geral. Uma vez que o neurotransmissor serotonina (5-HT) contribui com o neurodesenvolvimento, funcionalidade e plasticidade do cérebro adulto, alterações na neurotransmissão serotoninérgica poderiam contribuir para a etiologia da epilepsia. Além disso, a disfunção na atividade serotoninérgica no cérebro poderia aumentar a susceptibilidade a psicopatologias nos pacientes com epilepsia. Nesta linha, estudos de PET demonstraram uma diminuição no potencial de ligação dos receptores de serotonina (5-HT1A) em pacientes com epilepsia do lobo temporal, sendo que esta diminuição parece ser mais proeminente em pacientes epilépticos com depressão. Assim, genes relacionados com a neurotransmissão serotoninérgica são importantes candidatos para estudos de associação com a epilepsia. No presente trabalho, nós avaliamos o impacto de polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) e no gene do receptor 5-HT1A na ELT e em suas comorbidades psiquiátricas. O gene do transportador da serotonina apresenta dois polimorfismos com consequências funcionais na sua expressão: uma inserção/deleção de 44 pares de base na região flanqueadora 5’ (5-HTTLPR), e um número variável de repetições em tandem (VNTR) no intron 2 (5-HTTVNTR). O gene codificador do receptor 5-HT1A contém um polimorfismo de troca única de base (SNP) na região promotora (C-1019G) que altera a expressão gênica. Foram incluídos neste estudo 175 pacientes com ELT, dos quais 155 tinham avaliação neuropsiquiátrica, e 155 controles saudáveis. Primeiramente foi avaliado o impacto dos polimorfismos 5HTTLPR, 5HTTVNTR e C- 1019G na epilepsia do lobo temporal. Analisando os genótipos do 5-HTTVNTR e 5- HTTLPR combinados pela atividade transcricional, os genótipos de baixa expressão gênica foram mais freqüentes nos pacientes com ELT que nos controles saudáveis (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). Esta associação com genótipos de baixa atividade trascricional do 5-HTT poderia estar relacionada com alterações funcionais do sistema serotoninérgico, aumentando o risco para epilepsia. Entretanto, não foi encontrada associação entre o polimorfismo C-1019G e a ELT. Na segunda parte deste trabalho, nós avaliamos a influência destes polimorfismos nas comorbidades de doenças psiquiátricas, entre elas transtorno de humor e ansiedade, em pacientes com ELT. Não foi encontrada diferença significativa na frequência dos polimorfismos no gene do transportador da serotonina (5-HTT) entre pacientes com ou sem comorbidade psiquiátrica. Entretanto o polimorfismo C-1019G foi associado com transtorno de ansiedade nos pacientes com ELT. Baseado em nossos resultados, sugerimos que alterações em genes relacionados à serotonina, como 5-HTT e 5-HT1A, poderiam estar envolvidas na gênese da ELT e nas características clínicas desta doença. Além disso, nós acreditamos que estudos futuros realizados com essa metodologia serão importantes para o estabelecimento das bases genéticas envolvidas nas manifestações neuropsiquiátricas da epilepsia do lobo temporal. / Epilepsy is the second most frequent cause of neurological disorders in young adults. The majority of the patients suffer from temporal lobe epilepsy (TLE). Higher rates of psychopathology are observed in patients with epilepsy, especially in those with TLE. Since neurotransmitter serotonin (5-HT) contributes to neurodevelopment, functionality and plasticity of the adult brain, serotonin may contribute to the etiology of epilepsy. Moreover, the impairment of serotoninergic activity in the brain may enhance susceptibility to psychopathologies in patients with epilepsy. In this line, PET studies showed a decreased serotonin receptor 1A binding in TLE patients, and this alteration seems to be higher in epileptic patients with depression. In this study we evaluated the impact of serotonin transporter (5-HTT) gene and serotonin receptor 1A (5-HT1A) polymorphisms over TLE and its psychiatric comorbidities. The 5-HTT gene has two polymorphisms with functional consequences: a 44 base pairs insertion/deletion polymorphism in the 5’ flanking region of this gene (5-HTTLPR), and a variable number of tandem repeats in the intron 2 (5-HTTVNTR). The gene encoding serotonin receptor 1A contains a single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region (C-1019G) that regulates gene expression. In this study, were included 165 TLE patients, 155of these had been evaluated for neuropsychiatric disease, and 110 health controls. We first evaluated the impact of 5HTTLPR, 5HTTVNTR and C-1019G in temporal lobe epilepsy. When 5-HTTVNTR and 5-HTTLPR genotypes were combined by transcriptional efficiency, the low expressing genotypes were more frequent in TLE patients than in healthy controls (O.R.=3.24; 95% I.C.=1.08 a 9.73; p=0.036). This could be related to functional alterations and outgrowth inhibition of the serotonin system, and subsequently enhance the risk to epilepsy in adulthood. However we did not find an association between C-1019G and TLE. In the second part of this work we evaluated the influence of these polymorphisms on the risk for psychiatric diseases in these patients, among them mood and anxiety disorder. There were no significant differences between genotypes frequencies of 5-HTT polymorphisms and presence of any psychiatry disease. However, the C-1019G polymorphism was associated with anxiety disorder in TLE patients. Based in our results, we suggest that alteration in serotonin related genes, such as 5-HTT and 5- HT1A, might be involved in the genesis of TLE and in clinical characteristics of this disease. Moreover we believe that further studies involving molecular methodologies will be important to establish the genetic bases involved in the neuropsychiatric manifestations of TLE.