A histoplasmose é uma micose causada pelo fungo dimórfico Histoplasma capsulatum, está distribuido em áreas tropicais ou subtropicais e acomete mamíferos, principalmente os morcegos. Os propágulos infectantes do fungo são encontrados nas excretas dos quirópteros e a transmissão ocorre pela inalação dos mesmos, podendo causar infecção primária assintomática, uma infecção pulmonar aguda ou crônica, ou uma forma disseminada tanto em humanos quanto em animais. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de Histoplasma capsulatum em amostras pulmonares de espécies de morcegos provenientes do Estado de Mato Grosso. Foram capturados 75 morcegos entre 2007-2009 em cavernas, florestas e áreas urbanas do Estado de Mato Grosso (MT). Os morcegos foram capturados pelo INDEA/MT, órgão Oficial responsável pelo controle da Raiva dos Herbívoros. O H. capsulatum foi detectado pelo nested PCR que amplificou o gene 100kDA. A amplificação dos produtos da PCR foram sequenciados para confirmação da presença do fungo nos pulmões dos morcegos. H. capsulatum foi observado em 16,0% (12) das 75 amostras dos pulmões de morcegos e com maior ocorrência nas espécies Desmodus rotundus (25%), Artibeus lituratus, Molossus molossus (16,7%) e nas espécies: Artibeus sp., Eumops glaucinus, Glossophaga soricina, Nyctinomops laticaudatus, Nyctinomops macrotis 8,3%. O presente estudo detecta o primeiro estudo sobre H. capsulatum em regiões do Estado de Mato Grosso tanto em área urbana como silvestre. Estes resultados revelaram uma positividade alta de H. capsulatum nos morcegos nesta região, comparando com a literatura descrita em amostras também provenientes de áreas urbanas do Estado de São Paulo, além de resultados similares aos achados nas espécies Eumops glaucinus e N. macrotis. A maior ocorrência nas amostras analisadas no presente estudo podem terem ocorrido devido a técnica (nested PCR) processada e o órgão utilizado (pulmão). O nested PCR é um método mais sensível para avaliar colonização do agente. Tal colonização nos permite inferir que os quirópteros do Estado de Mato Grosso são reservatórios do H. capsulatum e enfatizam o potencial dos morcegos na transmissão do fungo. / Histoplasmosis is a mycosis caused by the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, which is distributed in tropical or subtropical areas affecting mammals especially bats. The infectious propagules are found in the bat guano and transmission occurs by inhalation of the same, allowing either an asymptomatic primary infection, acute or chronic pulmonary infection, or disseminated form in humans or animals. The aim of the present research was to detect the presence of the Histoplasma capsulatum in lung samples of bat species from state of Mato Grosso/Brazil. For this purpose, a highly sensitive nested PCR was used with specific molecular markers for pathogen. Seventy-five bats were captured between 2007and 2009 in caves, florests, and urban areas of Mato Grosso (MT), located in the Mid-Western region. The bats were captured by the official agency responsible for rabies control of herbivores (INDEA / MT) following the guidelines of rabies control manual, standardized by the Ministry of the Agriculture. Detection of H. capsulatum DNA was amplified the HCp 100 locus. Amplification products were sequenced to confirm fungal presence in bat lungs. The amplifications results for H. capsulatum were positive in 12 (16.0%) samples. The greatest occurrence of Histoplasma capsulatum was observed in Desmodus rotundus (25%), Artibeus lituratus, Molossus molossus (16.7%) and in the spicies: Artibeus sp., Eumops glaucinus, Glossophaga soricina, Nyctinomops laticaudatus, Nyctinomops macrotis 8,3%. This study detects the first survey of Histoplasma capsulatum in regions of Mato Grosso in both urban and wild. These results revealed a high positivity of H. capsulatum in bats in this region, compared with the literature described in samples also from urban areas of São Paulo, and results similar to those found in species Eumops glaucinus and N. macrotis. The highest occurrence in the samples analyzed in this study may have occurred due to technical (nested PCR) processed and used organ (lung). The nested PCR is a more sensitive method for assessing agent colonization. Such colonization allows us to infer that the bats in the State of Mato Grosso are reservoirs of H. capsulatum and emphasize the potential of bats in the transmission of the fungus.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

A dermatofitose é a zoonose micótica mais difundida mundialmente e os animais domésticos são os principais reservatórios dos dermatófitos zoofílicos que, em alguns países, são causadores mais frequentes da doença em humanos do que as espécies antropofílicas. Especificamente em relação ao Microsporum canis, principal espécie zoofílica nas zonas urbanas, pouco sucesso foi obtido com a produção de vacinas para seu controle. Os objetivos dessa pesquisa foram verificar a ocorrência gatos clinicamente sadios portadores de dermatófitos na região metropolitana de Porto Alegre e, também, analisar estatisticamente a influência de fatores como idade, sexo, raça e acesso à rua. Amostras foram obtidas do pelame de 191 gatos sem sinais clínicos de dermatoses após fricção dos pelos (face, região pré-auricular, dorso, cauda e membros) que foram semeadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ciclohexamida e incubadas a 27°C por até 21 dias. A possibilidade da associação entre as variáveis preditoras e a variável resposta foi avaliada através de um modelo de regressão logística univariado. Somente espécies de Microsporum (8,4%) foram isoladas de amostras positivas: M. canis (5,8%) e M. gypseum (2,6%). Em 15 (7,8%) das amostras não ocorreu crescimento fúngico. Nos restantes 160 (83,8%) cultivos foram isolados diversos fungos saprotróficos: filamentosos hialinos (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.); filamentosos dematiáceos ( Cladosporium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp.); zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.) e leveduras (Malassezia sp. e Candida sp.). Foi observado um maior risco relativo para o isolamento de dermatófito quando o animal era do sexo masculino e teve acesso à rua em uma magnitude de 3,43 e 3,52, respectivamente. Não foi identificado nenhum fator protetivo na análise multivariada. O modelo final teve poder discriminatório de 72%. Ainda são poucas as informações sobre o complexo mecanismo de infecção e a susceptibilidade dos animais, mas o isolamento fúngico de gatos sadios aliado a dados epidemiológicos são importantes ferramentas para o diagnóstico e tratamento desta micose. Os resultados obtidos corroboram estudos similares realizados em regiões metropolitanas de outros países. É enfatizada a possibilidade de contágio humano a partir de gatos assintomáticos e a necessidade da adoção de medidas profiláticas para reduzir a disseminação dos dermatófitos. / Dermatophytoses are in the list of the most frequent skin diseases of pets and livestock all over the world. Contagiousness among animal communities, difficulty in implementing control measures, and the eventual transmition of animal ringworm to people explain its great importance. A wide variety of dermatophytes have been isolated from animals, but a few zoophilic species are responsible for the majority of the cases. Microsporum canis is one of these and in some countries seems to cause a high proportion of human infections, outnumbering classical ringworm anthropophilic dermatophytes. So far, a safe and efficient vaccine is not available for protecting cats and dogs exposed to M. canis. The objective of this study is to survey dermatophytes in clinically normal cats in the metropolitan area of Porto Alegre, south of Brazil, and weight the possible influence of age, sex, breed and living conditions in the presence of these fungi. Samples were obtained from 191 cats with no skin disease after brushing the body (head, neck, dorsum, limbs and tail) and incubated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol and cyclohexamide at 27°C for up to 21 days. The possibility of association between predictors variables and a variable answer was evaluated by an univariate logistic regression model. Only Microsporum species, (8,4%) were isolated from positive specimens: M. canis (5,8%) and M. gypseum (2,6%). On 15 samples (7,8%) there was no fungal growth. Of the remaining 160 samples (83,8%), several saprotrophic fungi were isolated: hyaline filamentous fungi (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. and Scopulariopsis sp.); dematiaceous filamentous fungi (Cladosporium sp., Alternaria sp. and Curvularia sp.); Zygomycetes (Rhizopus sp. and Mucor sp.) and yeasts (Malassezia sp. and Candida sp.). It was observed an higher relative risk for the isolation of dermatophyte when the cat was male and was allowed to walk outdoors in a magnitude of 3.43 and 3.52, respectively. The multivariate analysis did not identify any protective factor against dermatophytosis. The final model had a discriminatory power of 72%. There are few informations about the complex mechanisms of infection and susceptibility of the animals, but fungal isolation from healthy cats associated with epidemiological features are important tools in the diagnosis and management of the problem. Results of this research are similar to others conducted around urban areas of different countries across the world. It is emphasized that human beings can be contaminated from apparently healthy cats and the author stresses the necessity of prophylactic measures in order to reduce the spread of dermatophytosis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

Investigações foram realizadas com fermentação submersa de Rhizopus arrhizus para produção de biomassa e dos co-polímeros quitina e quitosana, através do cultivo em meio sintético para Mucorales e milhocina, como substrato alternativo. Neste sentido, foram realizadas fermentações em frascos de Erlenmyers de 250 mL de capacidade, contendo 50 mL dos meios, foram inoculados em duplicatas com 1% de uma suspensão de 107/esporos por mL, incubados sob agitação orbital de 150rpm. A cada 24 h foram realizados conteúdo em biomassa, consumo de glicose, além da estimação e caracterização de quitina e quitosana e o pH foi monitorado no decorrer dos estudos (96h). Os dados obtidos foram validados utilizando uma análise por regressão não linear, visando explorar o potencial e versatilidade dos mucorales na produção dos co-polímeros. Os resultados obtidos com o meio sintético para Mucorales demonstraram um aumento máximo de biomassa com 72 h de cultivo submerso. A glicose foi totalmente consumida pelo metabolismo do fungo com 96h, com pH 3,2 e conseqüente estágio de declínio celular. A produção máxima de quitina e de quitosana por R. arrhizus foi de 73,5 mg e 158 mg, respectivamente, por grama de biomassa em 48 h de cultivo, com velocidade máxima de crescimento de Max 0,036(h-1)e tempo de geração de 4,6 h. Por outro lado, o cultivo submerso de R. arrhizus em milhocina, nas concentrações de 4,8 e 16%, como meio alternativo e de baixo custo, demonstrou crescimento máximo de 16,8 g/L, na concentração de 8% de milhocina, observando-se Max 0,064(h-1. Altos rendimentos de quitina (575mg/g de biomassa) e quitosana (416 mg/g de biomassa) foram obtidos com milhocina a 8%, com 72 h de cultivo, respectivamente, e pH variando de 6,5 para 8,2. Todos os copolímeros isolados foram caracterizados pelo índice de cristalinidade e espectro de absorção ao raio infravermelho, confirmando um alto grau de pureza quando comparados aos padrões de quitina e quitosana. Os dados obtidos experimentalmente de produção de quitina e quitosana foram validados pela estimativa de regressão não linear, demonstrando um bom ajuste das equações e reprodutibilidade. Os resultados com a fermentação submersa de R. arrhizus comparando milhocina a 8% com o meio sintético para Mucorales observou-se um aumento considerável de 782% e 263%, respectivamente, para a produção de quitina e quitosana. Assim, os resultados obtidos sugerem R. arrhizus como fonte de produção dos co-polímeros, como também a milhocina, considerando o potencial nutritivo e o baixo custo / Inquiries had been carried out with submerged fermentation of Rhizopus arrhizus for production of biomass and copolymers chitin and chitosan, using the culture in synthetic medium for Mucoralean and corn steep liquor, as alternative substratum. In this direction, fermentations in Erlenmyers flasks of 250mL had been carried out, contend 50 mL of the media had been inoculated in duplicates with 1% of a suspension of 107/spores/mL, incubated under orbital shaker of 150rpm. To each 24 h had been carried out the content in biomass, glucose consumption, production and characterization of chitin and chitosan, and pH was monitored in elapsing of the studies (96h). The dates had been validated using an analysis for not linear regression, aiming at to explore the potential and versatility of Mucoralean in the production of copolymers. The results obtained with the synthetic medium for Mucoralean had demonstrated a maximum increase of biomass at 72 h of submerged culture. The total of glucose total was consumed by the metabolism of fungus at 96h, with pH 3,2 and consequence period of behavior of cellular decline. The maximum production of chitin and chitosan was 73.5mg and 158 mg, respectively, for gram of biomass with 48 h of cultivation, and maximum speed of growth of Max 0.036 (h-1) and generation time of 4.6h. On the other hand, the submerged culture of R. arrhizus in corn steep liquor, concentrations of 4, 8 and 16%, as alternative medium and of low cost showed maximum growth of 16.8 g/L, in the concentration of 8% of corn steep liquor, observing a Max 0.064h-1. High yields of chitin (575 mg/g biomass) and chitosan (416mg/g biomass) could be achieved using the medium containing corn steep liquor at 8%, with 72 h of cultivation, respectively, and pH varying of 6.5 to 8.2. All the isolated copolym rs in both culture media were characterized by index of crystallinity and absorption to the infra-red ray peaks, and were confirmed using the chitin and chitosan standards. The experimental data obtained with chitin and chitosan were validated by the estimation of not linear regression, demonstrating to a good adjustment of the equations and reproducibility. The results with the submerged fermentation of R. arrhizus were compared corn steep liquor at 8% with synthetic medium for Mucoralean fungi, and was observed an increase of 782% and 263% respectively, for chitin and chitosan production. The results obtained suggest R. arrhizus as source of production of the copolymers and as well as the corn steep liquor, considering the nutritional potential and the low cost

As doenças respiratórias constituem um sério problema em sistemas intensivos de criação de suínos, causando enormes prejuízos à industria suína no Brasil e no mundo. Estes prejuízos estão freqüentemente relacionados à redução de peso, mortalidade, maior predisposição a doenças entéricas, gastos com vacinas e medicamentos. Os distúrbios respiratórios em suínos são manifestados através de um complexo de doenças, com envolvimento de agentes virais, bacterianos e fúngicos. Dentre estes, a presença do circovírus (PCV2) e o Pneumocystis sp. começa a ser gradativamente caracterizada como uma associação entre um agente causador de imunossupressão e um organismo de ação oportunista. O trabalho objetivou diagnosticar Pneumocystis sp. através das técnicas de imunohistoquímica, Grocott e nested-PCR, em suínos abatidos nos Estados do Rio Grande do Sul (RS) e Mato Grosso (MT), diagnosticar a ocorrência de PCV2 na mesma população de suínos, verificar a associação entre Pneumocystis sp. e PCV2, e determinar as relações filogenéticas entre as amostras de Pneumocystis sp. O estudo avaliou um total de 591 pulmões, 297 com alterações macroscópicas (pneumonia) e 294 normais obtidos em frigoríficos. Foram analisados 292 pulmões procedentes do RS e 299 pulmões do MT Para diagnóstico do Pneumocystis sp. as amostras foram analisadas através das técnicas de Grocott, Imunohistoquímica e nested-PCR (mtLSU e mtSSU rRNA). Do total das amostras, 36,9% foram positivas para Pneumocystis. O índice de positividade para o vírus PCV2 foi de 32,7% na amostra total. Os resultados revelaram uma alta prevalência do vírus (PCV2) em pulmões sem lesões macroscópicas. A co-infecção (PCV2 e Pneumocystis sp.), foi detectada em 28,0% em 564 pulmões examinados. As análises das seqüências dos nucleotídeos dos produtos de PCR dos genes mtLSU e mtSSU do rRNA do Pneumocystis sp. nos pulmões analisados, sugerem a presença até o presente momento de 2 espécies diferentes de Pneumocystis no Brasil. Este estudo evidencia a ocorrência da co-infecção de dois agentes (Pneumocystis sp. e PCV2) em animais hígidos, fato que, indica a necessidade de planejamento e implementação de medidas de controle para melhorar a produtividade na suinocultura. / Respiratory diseases are a major problem in intensive systems of swine husbandry. They are a cause for high losses in the swine industry in Brazil and in the world. These losses are often related to weight reduction, mortality, higher vulnerability to enteric diseases, and expenses with vaccines and drugs. Respiratory diseases in swine appear through a complex of diseases, caused by virus, bacteria and fungi; among these, the porcine circovirus 2 (PCV2) and Pneumocystis sp., the former an agent which causes immunosupression and the latter an oportunistic microorganism. Both are being recognized as capable of being associated. The objectives of this study were to: identify Pneumocystis sp. through immunohystochemistry techniques, Grocott and nested-PCR in swine slaughtered in the States of Rio Grande do Sul and Mato Grosso (MT); investigate PCV2 in the same swine population; investigate the association between Pneumocystis sp. and PCV2, and establish a filogenetic relationship between isolated of Pneumocystis sp. The study was carried out with a total of 591 lungs, 297 with macroscopic alterations characteristic of pneumonia, and 294 normal lungs from the industry. 292 lungs came from RS and 299 lungs came from MT. In order, to diagnose Pneumocystis infection, samples were analysed through Grocott technique, immunohystochemistry and nested-PCR (mtLSU and mtSSU rRNA). Among all samples 36,9% were positive for Pneumocystis sp.. PCV2 virus was found in 37,2% of the samples. Results revealed a high prevalence of the PCV2 virus in lungs without macroscopic lesions. Co-infection (PCV2 and Pneumocystis sp.) was found in 28,0% of 564 lungs examined. So far, the analyses of the sequences of nucleotides from the products of PCR from the genes mtlSU rRNA and mtSSU rRNA from Pneumocystis obtained from the examined lungs suggest that, it is possible the existence of two different species of Pneumocystis in Brazil. This study shows co-infection by two agents (Pneumocysts sp. and PCV2) in apparently healthy animals. This fact points out the necessity planning and implementation of control measures in order to improve productiviy in swine husbandry and industry.

O oomiceto aquático Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila, é o agente etiológico da pitiose, uma doença crônica, piogranulomatosa, que acomete eqüinos, caninos, felinos, bovinos, ovinos e humanos que habitam regiões tropicais e subtropicais. Diversos protocolos para o tratamento da enfermidade têm sido utilizados, incluindo terapia com antifúngicos, cirurgia e imunoterapia. O presente estudo objetivou avaliar a suscetibilidade in vitro de 27 isolados clínicos de Pythium insidiosum ao acetato de caspofungina, bem como correlacionar os resultados obtidos in vitro com a resposta da terapêutica in vivo e comparar a eficácia de dois tratamentos, acetato de caspofungina e imunoterapia, utilizando coelhos como modelo experimental. Vinte e seis isolados de Pythium insidiosum provenientes de casos clínicos de pitiose em animais no Brasil (24 eqüinos, 01 canino e 01 ovino) e um isolado ATCC (58637) foram avaliados neste estudo. Os testes in vitro foram desenvolvidos utilizando-se a macrotécnica em caldo seguindo o protocolo internacional M38-A do CLSI. O inóculo consistiu de uma suspensão de 2-3x103 zoósporos de Pythium insidiosum diluído 1:10 em caldo RPMI. As concentrações finais do acetato de caspofungina variaram de 0,25 – 128 μg/mL. A leitura dos CIMs foi visual, considerando-se o crescimento ou não de hifas em 24 horas de incubação a 370C, sendo adotados 3 critérios de leitura: CIM0; CIM1 e CIM2 (100%, 90% e 50% de inibição de crescimento, respectivamente), assim como também foi determinada a concentração fungicida mínima. No ensaio in vivo, 15 coelhos inoculados subcutaneamente com 20.000 zoósporos de Pythium insidiosum foram divididos em 3 grupos de 5 animais (grupo 1, controle; grupo 2, tratado com imunoterápico Pitium Vac® e grupo 3, tratado com acetato de caspofungina). Os tratamentos iniciaram-se 25 dias após a inoculação e consitiram de: 1) 8 doses de imunoterápico administradas em intervalos de 14 dias; 2) 1 mg/kg/dia de acetato de caspofungina durante 20 dias consecutivos. Dezoito semanas após o início do experimento, os animais foram necropsiados e fragmentos de lesões foram coletados para análise histopatológica e morfométrica. Quatorze isolados (51,8%) evidenciaram CIM0 de 64 μg/mL e 24 (88,8%) CIM1 com variação de ≥ 8μg/mL a 64 μg/mL. Na determinação da concentração fungicida mínima, 17 (62,9%) amostras requereram 64 μg/mL. Os animais de ambos os tratamentos apresentaram redução da área de lesões, quando comparados aos animais do grupo controle (P<0.05). As áreas de lesões dos coelhos tratados com acetato de caspofungina evidenciaram redução durante o tratamento, porém rapidamente retornaram a progredir quando a administração do fármaco foi suspensa. O aspecto histológico das lesões foi similar entre os grupos estudados e a avaliação morfométrica evidenciou que os animais dos grupos 2 e 3 apresentaram menor quantidade de hifas nas áreas de necrose (P<0.05). Os resultados obtidos evidenciam que, embora não tenha havido diferença entre os tratamentos avaliados, a imunoterapia, em função de seu custo, continua sendo a melhor alternativa para o tratamento da pitiose. A ocorrência de altas CIMs associada a falta de atividade fungicida do acetato de caspofungina observados neste estudo, sugerem que Pythium insidiosum é pouco suscetível a este antifúngico. / For the in vivo assay, fifteen rabbits were subcutaneously inoculated with 20,000 Pythium insidiosum zoospores and were divided into 3 groups of 5 animals (group 1, control; group 2, treated with Pitium Vac® immunotherapic; and group 3, treated with caspofungin acetate). The treatments were started 25 days after the inoculation, and consisted of: 1) 8 doses of the immunotherapic administered at 14-day intervals; and 2) 1mg/kg/day of caspofungin acetate during 20 consecutive days. The animals were necropsied eighteen weeks after the start of the experiment, and lesion fragments were collected for histopathologic and morphometric analyses. Fourteen isolates (51.8%) had an MIC0 of 64 μg/mL, and 24 (88.8%) had an MIC1 that varied between ≥ 8μg/mL and 64 μg/mL. When subjected to the minimum fungicidal concentration assay, 17 (62.9%) samples required 64 μg/mL. The animals in both treatment groups displayed smaller lesion sizes compared to the animals of group control (P<0.05). The subcutaneous lesion areas of rabbits treated with caspofungin acetate exhibited a reduction in their progression during the treatment. However, lesions quickly resumed growth when the administration of the drug was suspended. The histological aspect of the lesions was similar between the groups under study, and the morphometric evaluation showed that the animals in groups 2 and 3 had lower amounts of hyphae in necrotic areas (P<0.05). The results obtained indicate that, even though the treatments did not differ significantly, the immunotherapic treatment is still the best alternative to treat pythiosis. In addition, the high MICs and lack of fungicidality of caspofungin acetate suggest that Pythium insidiosum is poorly susceptible to this antifungal drug.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4648060 bytes, checksum: 02f10a0cc1d0bf768aa16e7168f46ef9 (MD5) Previous issue date: 2010-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nowadays, Brazil is the largest producer of papaya and the third largest exporter of fruit in the world. Papaya can be affected by various diseases that prevent them from being marketed and, consequently, the exportation of the fruit. Among the fungal diseases, smallpox, or blight, caused by Asperisporium caricae, is one of the diseases that affect the orchards in all regions. This disease interferes directly in the profitability and viability of the production. Beyond its incidence on leaves, it can also cause lesions on the fruit surface, making them unsuitable for marketing. It s almost impossible to find publications related to the biology of the fungus and to the phylogenetic position of the species. A. caricae is considered by many authors as a biotrophic pathogen, based on the difficulty of cultivation and sporulation in vitro. Some aspects of the taxonomic genus Asperisporium are controversial, such as proving Mycosphaerella as a teleomorph organism, the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal and the separation of the genus Asperisporium from Passalora. Other authors relate M. caricae to the anamorph Phoma caricae-papaya (= Ascochyta caricapapaya), causal agent of stalk rot. However, through the manual identification the genera Phoma and Ascochyta are related to the teleomorph Didymella. The differences between the genders Didymella and Mycosphaerella is the presence of pseudo paraphyses in the last one. This feature is difficult to visualize in histological sections under a light microscope, thus being liable to misunderstand at the time of identification. The aims of the study were the isolation of A. caricae in pure culture, examining the growth and sporulation of the isolates in seven different media and make a morphological characterization of isolates. Beyond these, other aim was to verify the relationship between Asperisporium caricae and Mycosphaerella caricae by comparing nucleotides of three DNA regions (ITS rDNA, LSU and mtSSU) and the phylogenetic relationships with other genera of the complex cercosporoidal, by comparing the sequences obtained to sequences published in databases. It was possible to cultivate A. caricae in all tested media. The culture medium potato dextrose agar, supplemented or not with amino acids, were those who presented the best source to the fungus. Moreover, the species produced spores in vitro in all tested media, except in the medium consisting of papaya leaves. Through the molecular data and clusters obtained, it can be concluded that A. caricae belongs to the family Mycosphaerellaceae grouping it with species of true Passalora and Mycosphaerella. M. caricae was grouped with species of the genus Phoma, Ascochyta and Didymella, representatives of the order Pleosporales. Thus, it is possible that M. caricae is a species of Didymella and teleomorph of Phoma carica-papaya. / O Brasil é o maior produtor mundial de mamão e o terceiro maior exportador da fruta. O mamoeiro pode ser afetado por diversas doenças que inviabilizam a sua comercialização e, consequentemente, a exportações de frutos. Dentre as doenças fúngicas, a varíola, ou pinta preta, causada por Asperisporium caricae, é uma das doenças que afetam os pomares em todas as regiões produtoras. Interfere diretamente na rentabilidade e viabilidade da produção, pois, além de incidir em folhas, pode também causar lesões na superfície dos frutos, tornando-os inadequados para a comercialização. Trabalhos referentes à biologia do fungo são quase inexistentes, bem como sobre o posicionamento filogenético da espécie. A. caricae é considerado por muitos autores como biotrófico, baseado na dificuldade de cultivo e esporulação in vitro. Alguns aspectos taxonômicos do gênero Asperisporium são controversos, como a comprovação de Mycosphaerella como teleomorfo, o relacionamento filogenético com os demais gêneros do complexo cercosporóide e a separação de Asperisporium do gênero Passalora. Outros autores relacionam M. caricae ao anamorfo Phoma caricae-papaya (=Ascochyta caricae-papayae), agente etiológico da podridão peduncular. Contudo, por meio dos manuais de identificação os gêneros Phoma e Ascochyta estão relacionados ao teleomorfo Didymella. A distinção entre os gêneros Didymella e Mycosphaerella está na presença de pseudoparáfises neste último, sendo esta característica dificilmente visualizada em cortes histológicos em microscópio de luz, deste modo, sendo passível o equívoco no momento da identificação. Os objetivos do trabalho foram: realizar o isolamento de A. caricae em cultura pura, analisar o crescimento e a capacidade de esporulação dos isolados em sete diferentes meios de cultura e proceder a caracterização morfológica dos isolados; verificar a relação entre Asperisporium caricae e Mycosphaerella caricae por meio da comparação de nucleotídeos de três regiões do DNA (ITS do rDNA, LSU e mtSSU), assim como o relacionamento filogenético com os demais gêneros pertencentes ao complexo cercosporóide, por meio da comparação das sequências obtidas com as sequências publicadas em bancos de dados. Foi possível o cultivo de A. caricae em todos os meios de cultura testados, sendo que os meios de cultura batata-dextrose-ágar, suplementado ou não com aminoácidos, foram os que proporcionaram melhor desenvolvimento ao fungo. Além disso, a espécie produziu esporos in vitro em todos os meios de cultura testados, exceto no meio composto por folhas de mamão. Por meio dos dados moleculares e dos agrupamentos obtidos, pode-se concluir que A. caricae pertence à família Mycosphaerellaceae, agrupando com espécies de Passalora verdadeiras e de Mycosphaerella. M. caricae agrupou-se com espécies pertencentes ao gênero Phoma, Didymella e Ascochyta, representantes da ordem Pleosporales. Com isso, é possível que M. caricae seja uma espécie de Didymella, e teleomorfo de Phoma caricae-papayae.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo. / Sporotrichosis is a chronic and infectious disease that involves the cutaneous and subcutaneous tissue, which can affect humans and animals. This mycosis has always been attributed to a single pathogen, the Sporothrix schenckii, a dimorphic fungus, that grows as yeast at 37 C and as mycelia at room temperature. However, in recent years, some isolates identified as S. schenckii showed considerable genetic variability, suggesting that this taxon consists of a complex of species. This disease is caused by the traumatic inoculation of the fungal pathogen, however, the molecules involved in the invasion and dissemination of this microorganism are still poorly understood. The aim of this study is to identify surface molecules involved in the interaction of this fungus with extracellular matrix proteins and to examine phenotypic differences between species in the Sporothrix complex. Five isolates were used throughout this study, three clinical isolates, an environmental and one cat isolate. The virulence of each isolate was compared to the adhesive capacity to fibronectin. We observed that the most virulent isolates exhibited the higher capacity to interact with fibronectin. The expression of adhesins for fibronectin on the surface of each isolate was verified by Western blot. This analysis showed that the most virulent isolates expressed more fibronectin adhesins than the avirulent ones. Positive bands for the monoclonal antibody raised against gp70 adhesin (mAb P6E7) were revealed in cell wall extracts of the isolates studied. Confocal microscopy confirmed the colocalization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. Molecular analysis showed genotypic differences between isolates used in this study, that can cluster than them into two species, S. schenckii and S. brasiliensis. This phylogenetic analysis revealed that the avirulent isolate was S. brasiliensis and not S. schenckii as previously thought. This new data led us to determine whether the virulence and phenotypic characteristics were related to genotype. The virulence analysis showed that another S. brasiliensis isolate was as virulent as the S. schenckii isolates. Moreover, morphological characteristics, such as, size, shape and growth profile of mycelial and yeast were also evaluated. However, no connection was observed between cell morphology with the speciation of the genus Sporothrix. The cell wall expression of gp70 was evaluated in the twou species. We observed that the virulent isolate of S. brasiliensis almost do not express gp70 in contrast with the avirulent isolate of the same specie. This study shows that there is a direct correlation between virulence and adhesins expression, however, no relationship between genotype and phenotypic characteristics was observed.

A dermatofitose é a zoonose micótica mais difundida mundialmente e os animais domésticos são os principais reservatórios dos dermatófitos zoofílicos que, em alguns países, são causadores mais frequentes da doença em humanos do que as espécies antropofílicas. Especificamente em relação ao Microsporum canis, principal espécie zoofílica nas zonas urbanas, pouco sucesso foi obtido com a produção de vacinas para seu controle. Os objetivos dessa pesquisa foram verificar a ocorrência gatos clinicamente sadios portadores de dermatófitos na região metropolitana de Porto Alegre e, também, analisar estatisticamente a influência de fatores como idade, sexo, raça e acesso à rua. Amostras foram obtidas do pelame de 191 gatos sem sinais clínicos de dermatoses após fricção dos pelos (face, região pré-auricular, dorso, cauda e membros) que foram semeadas em ágar Sabouraud acrescido de cloranfenicol e ciclohexamida e incubadas a 27°C por até 21 dias. A possibilidade da associação entre as variáveis preditoras e a variável resposta foi avaliada através de um modelo de regressão logística univariado. Somente espécies de Microsporum (8,4%) foram isoladas de amostras positivas: M. canis (5,8%) e M. gypseum (2,6%). Em 15 (7,8%) das amostras não ocorreu crescimento fúngico. Nos restantes 160 (83,8%) cultivos foram isolados diversos fungos saprotróficos: filamentosos hialinos (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. e Scopulariopsis sp.); filamentosos dematiáceos ( Cladosporium sp., Alternaria sp. e Curvularia sp.); zigomicetos (Rhizopus sp. e Mucor sp.) e leveduras (Malassezia sp. e Candida sp.). Foi observado um maior risco relativo para o isolamento de dermatófito quando o animal era do sexo masculino e teve acesso à rua em uma magnitude de 3,43 e 3,52, respectivamente. Não foi identificado nenhum fator protetivo na análise multivariada. O modelo final teve poder discriminatório de 72%. Ainda são poucas as informações sobre o complexo mecanismo de infecção e a susceptibilidade dos animais, mas o isolamento fúngico de gatos sadios aliado a dados epidemiológicos são importantes ferramentas para o diagnóstico e tratamento desta micose. Os resultados obtidos corroboram estudos similares realizados em regiões metropolitanas de outros países. É enfatizada a possibilidade de contágio humano a partir de gatos assintomáticos e a necessidade da adoção de medidas profiláticas para reduzir a disseminação dos dermatófitos. / Dermatophytoses are in the list of the most frequent skin diseases of pets and livestock all over the world. Contagiousness among animal communities, difficulty in implementing control measures, and the eventual transmition of animal ringworm to people explain its great importance. A wide variety of dermatophytes have been isolated from animals, but a few zoophilic species are responsible for the majority of the cases. Microsporum canis is one of these and in some countries seems to cause a high proportion of human infections, outnumbering classical ringworm anthropophilic dermatophytes. So far, a safe and efficient vaccine is not available for protecting cats and dogs exposed to M. canis. The objective of this study is to survey dermatophytes in clinically normal cats in the metropolitan area of Porto Alegre, south of Brazil, and weight the possible influence of age, sex, breed and living conditions in the presence of these fungi. Samples were obtained from 191 cats with no skin disease after brushing the body (head, neck, dorsum, limbs and tail) and incubated on Sabouraud dextrose agar with chloramphenicol and cyclohexamide at 27°C for up to 21 days. The possibility of association between predictors variables and a variable answer was evaluated by an univariate logistic regression model. Only Microsporum species, (8,4%) were isolated from positive specimens: M. canis (5,8%) and M. gypseum (2,6%). On 15 samples (7,8%) there was no fungal growth. Of the remaining 160 samples (83,8%), several saprotrophic fungi were isolated: hyaline filamentous fungi (Penicillium sp., Aspergillus sp., Acremonium sp., Chrysosporium sp., Paecilomyces sp., Fusarium sp. and Scopulariopsis sp.); dematiaceous filamentous fungi (Cladosporium sp., Alternaria sp. and Curvularia sp.); Zygomycetes (Rhizopus sp. and Mucor sp.) and yeasts (Malassezia sp. and Candida sp.). It was observed an higher relative risk for the isolation of dermatophyte when the cat was male and was allowed to walk outdoors in a magnitude of 3.43 and 3.52, respectively. The multivariate analysis did not identify any protective factor against dermatophytosis. The final model had a discriminatory power of 72%. There are few informations about the complex mechanisms of infection and susceptibility of the animals, but fungal isolation from healthy cats associated with epidemiological features are important tools in the diagnosis and management of the problem. Results of this research are similar to others conducted around urban areas of different countries across the world. It is emphasized that human beings can be contaminated from apparently healthy cats and the author stresses the necessity of prophylactic measures in order to reduce the spread of dermatophytosis.