As infecções em cirurgia cardíaca ainda apresentam um cenário importante nas infecções associadas à assistência a saúde (IAAS), favorecendo ao paciente à aquisição de infecções por micro-organimos multirreristentes. Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil de resistência a antimicrobianos, verificar a presença de genes que codificam as enzimas dos tipos oxacilinases e metalo-beta-lactamases e descrever as características demográficas e clínicas dos pacientes colonziados/infectados por Acinetobacter spp. e P.aeruginosa internados no Centro de Terapia Intensiva Cardíaca do HUPE no período de 2005 a 2010. A maioria das 46 amostras de Acinetobacter spp e das 35 de P.aeruginosa foram de origem respiratória seguido de sangue. A maioria das amostras de A. baumannii apresentou altos percentuais de resistência a: ceftazidina, cefepime, piperacilina-sulbactam, ciprofloxacin, ceftriaxona e CIM &#8805;32 &#956;g/mL para os carbapenêmicos. Uma amostra foi resistente a Polimixina B. O gene blaOXA-23 foi detectado em 65% das amostras e uma amostra apresentou o gene blaOXA-24. Não foram detectados os genes blaOXA-58-like e blaOXA-143. Para P. aeruginosa os percentuais de resistência para todos os antimicrobianos foram inferiores a 32%. Quatro amostras apresentaram resistência intermediária a polimixina B e nenhum gene de resistência foi detectado. Os prontuários dos pacientes foram analisados a fim de associar as características clínicas com os processos infecciosos identificados e seu desfecho clínico. Na análise por tipo de micro-organismo associado ao processo infeccioso à idade acima de 70 anos, DM e uso da ventilação mecânica por tempo prolongado foi maior no grupo dos pacientes que apresentaram infecção por P.aeruginosa. O IAM, a ICC em internações anteriores e suas complicações (choque cardiogênico e arritmia) tiveram impacto na mortalidade na série de pacientes (p<0,05). A insuficiência renal entre todas as comorbidades foi à única que teve associação com a mortalidade (OR= 8,3). Não houve associação entre a mortalidade e o micro-organismo que causou a infecção (Acinetobacter spp. p=0,3 e P.aeruginosa p=0,2) ou a resistência a carbapenêmicos (p=0,5). Foram observados dois casos de mediastinte por Acinetobacter spp. e dois por P. aeruginosa sendo um achado inédito no Brasil até o momento. / Infections in cardiac surgery still have an important scenario infections associated with health assistance(IAHA), favoring acquisition of the patients to infection by microrganisms multiresistants. This work aimed to avaluate the profile of the resistance antimicrobial, to verify the presence of genes encoding enzymes of types oxacilinases and metallo-beta-lactamases and describe demographic and clinical caracteristics of inpatients colonized/infected by Acinetobacter spp. and P. aeruginosa in Cardiac Care Center the Pedro Ernesto University Hospital during the period 2005 to 2010. Most of 46 samples of Acinetobacter spp. and 35 the P. aeruginosa were the respiratory origen and and blood. Most sample A.baumannii showed higher percentages of resistance to: ceftazidime, piperacilin-sulbactam, ciprofloxacin, ceftriaxone and CIM &#8805;32 &#956;g/mL for carbapenems. A sample was resistant a polymyxin B. The gene blaOXA-23 was detected in 65% of the samples and a sample showed gene blaOXA-24.The genes blaOXA-58-like e blaOXA-143 not were detected. For P. aeruginosa the percentage of resistance to all antimicrobials was less than 32%. Four samples showed intermediate resistance to polymyxin B and no gene the resistance was detected.The charts of all patients were analyzed in order to associated the clinical caracteristics with infections processes identified and the clinical outcome. The analyses by type of microrganism associated with infections process over the age of 70 years, DM and use mechanical ventilation for prolonged was higer in the patients with infection by P. aeruginosa. The IAM and the ICC of previous hospitalizations and complications (cardiogenic shock and arrhythmia) had an impact on mortality in series of patients (p<0,05). The renal failure among all comorbitidies was the only one that was associated with mortality (OR=8,3). There was no association between mortality and the organism causing the infection (Acinetobacter spp. p=0,3 and P.aeruginosa p=0,2). Two cases of mediastinitis of Acinetobacter spp. and two cases of P. aeruginosa was observed. It was an umprecedented finding in Brazil at that moment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / ExoU, uma citotoxina produzida pelo patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citosol de células hospedeiras via sistema de secreção do tipo III, é associada à gravidade de infecções agudas. No presente trabalho, o efeito de ExoU na ativação do estresse oxidativo e da resposta antioxidante foi avaliado em culturas de células epiteliais respiratórias humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU), com a mutante deletada no gene exoU, PA103&#8710;exoU, ou com a mutante complementada com exoU sem atividade tipo fosfolipase A2, PA103&#8710;UT/S142A. Análises das dosagens de hidroperóxidos lipídicos e isoprostanos, considerados marcadores de estresse oxidativo, revelaram que ExoU promoveu um aumento em suas concentrações. Foi observado, também, que ExoU estimulou a produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e peroxinitrito nas células infectadas, assim como a expressão de iNOS e eNOS, mas não de nNOS. Além disso, ExoU foi responsável pelo aumento da atividade de SOD1 e pela redução dos níveis de GSH, mas não afetou a atividade da catalase ou de NQO1. No modelo in vivo, a dosagem de malondialdeído, um subproduto da lipoperoxidação de membranas, evidenciou uma maior produção deste composto no pulmão de camundongos infectados pela cepa produtora de ExoU, em comparação ao pulmão de camundongos infectados pela cepa mutante. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa a produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, levando à peroxidação lipídica e modulando o sistema de defesa antioxidante / ExoU, a cytotoxin produced by the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa and translocated into the cytosol of host cells via a type III secretion system, is associated with severity of acute infections. In the present work, the effect of ExoU in the activation of oxidative stress and antioxidant response was evaluated in cultures of human respiratory epithelial cells infected with P. aeruginosa PA103 strain (producer of ExoU), or with its isogenic mutants, the ExoU-deficient PA103&#8710;exoU or the exoU-depleted mutant complemented with an exoU gene with a site-specific mutation in the PLA2 catalytic site, PA103&#8710;UT/S142A. Analysis of dosages of lipid hydroperoxides and isoprostanes, considered markers of oxidative stress, revealed that ExoU promoted an increase in their concentrations. It was also observed that ExoU stimulated the production of reactive oxygen species, nitric oxide and peroxynitrite in infected cells, as well as the expression of iNOS and eNOS, but not nNOS. Furthermore, ExoU was responsible for the increased activity of SOD1 and the reduced levels of GSH, but did not affect the activity of catalase or NQO1. In the in vivo model, the analysis of malondialdehyde, a byproduct of lipid peroxidation of membranes, showed increased production of this compound in the lungs of mice infected with the ExoU-producing strain compared to the lungs of mice infected with the mutant strain. Together, these results show that ExoU activates the production of reactive oxygen and nitrogen species, leading to lipid peroxidation and modulating the antioxidant defense system.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1174662 bytes, checksum: b8d279c4ce9aa576070293eaf8594b88 (MD5) Previous issue date: 2010-03-24 / Sewage sludge is the major residue produced in Sewage Treatment Stations (STS). One of its possible applications, agricultural use of biosolids - a term which characterizes sewage sludge submitted to hygienization process - presents productive and reduced cost advantages. However, there is a concern of environmental contamination and risk of disease transmission through pathogenic microorganisms. This work aimed to evaluate the decay of pathogenic organisms in hygienized sewage sludge by solarization and lime addition, at field scale, and to estimate the time of permanence of microorganisms in soils fertilized by biosolids in experiments in laboratory conditions. Sewage sludge from a UASB reactor was fortnightly disposed in drying beds and three different lots were monitored, out of which samples were collected for analysis of microbiological parameters every seven days until class B biosolid characteristics were reached, following CONAMA 375/2006 specifications. The parameters monitored were: total solids, pH, humidity, total coliforms, Escherichia coli, Salmonella sp. and helminth eggs. Mixtures in the proportion of 75, 50 and 25% of biosolid with soil were prepared in the laboratory experiments, besides a biosolid treatment. The treatments were placed in 2 kg vases, with 3 repetitions, and submitted to 100 mL irrigation, weekly. The results indicated that hygienization was faster when the lime addition process was applied. Besides, the laboratory experiments confirmed that the biosolid+limed soil mixtures presented a drastic reduction of the remaining pathogenic microorganisms, even after hygienization. The concentrations found at 90 days of treatment with 75% of biosolid were 1.85x102 NMP/g of S.T. (?) for total coliforms, absence of E. coli since the start of monitoring and 0.07 helminth eggs per g of S.T. (?) In the treatment with 75% of solarized biosolid, total coliform concentrations of 5.15x104 NMP/g of S.T. (?) were found at 90 days of experiment; absence of E. coli, at the end of the experiment and between 0.48 and 0.12 helminth eggs per g of S.T. The results obtained in this work indicate the efficiency of both hygienization processes and continuity in pathogen reduction even after their application in the soil, confirming their viability for agricultural use. / O lodo de esgoto é o principal resíduo produzido nas Estações de Tratamento de Esgotos (ETEs). Entre os destinos possíveis, o uso agrícola de biossólidos, nome este que caracteriza o lodo de esgoto submetido a processo de higienização, apresenta vantagens produtivas e de redução de custos; contudo, há preocupação com a possibilidade de contaminação ambiental e risco de transmissão de doenças por microrganismos patogênicos. Este trabalho teve como objetivos avaliar o decaimento de organismos patogênicos em lodo de esgoto higienizado por solarização e caleação, em escala real, e estimar o tempo de permanência dos microorganismos em solos adubados com biossólido em experimentos de bancada. O lodo de um reator UASB era descartado quinzenalmente em leitos de secagem. Foram acompanhados três lotes diferentes, dos quais amostras foram coletadas para análise de parâmetros microbiológicos, a cada sete dias, até alcançar características de biossólido classe B, conforme especificação da CONAMA 375/2006. Os parâmetros monitorados foram: sólidos totais, pH, umidade, coliformes totais, Escherichia coli, Salmonella sp. e ovos de helmintos. Nos experimentos de bancada, foram realizadas misturas na proporção de 75, 50 e 25% de biossólido com solo, além de um tratamento sem biossólido. Os tratamentos foram colocados em vasos com capacidade de 2 kg, com três repetições, e submetidos à irrigação semanal de 100 mL. Os resultados indicaram que a higienização foi mais rápida, quando foi aplicado o processo de caleação. Além disso, constatou-se, nos experimentos de bancada, que as misturas biossólido + solo caleado apresentaram drástica redução dos microrganismos patogênicos remanescentes, mesmo após o processo de higienização. As concentrações encontradas aos 90 dias do tratamento, com 75% de biossólido, foram de 1,85x102 NMP/g de S.T para coliformes totais; ausência de E. coli, desde o princípio do monitoramento; e 0,07 ovos de helmintos por g de S.T. No tratamento com 75% de biossólido solarizado, foram encontradas, aos 90 dias, concentrações de coliformes totais de 5,15x104 NMP/g de S.T.; ausência de E. coli no final do experimento; e ovos de helmintos entre 0,48 e 0,12 ovos por g S.T. Os resultados obtidos indicam que há eficiência em ambos os processos de higienização e continuidade na redução de patógenos, mesmo após a sua aplicação no solo, o que ratifica a sua viabilidade para o uso agrícola.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 700292 bytes, checksum: f54866bb9d53611e8feef9c8d9a5b216 (MD5) Previous issue date: 2009-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The sulphate reducing bacteria (SRB) are considered the principal group of microorganisms involved in the formation of biofilms and biocorrosion of pipelines. The prevention and the control of the growth of that bacterial group have been accomplished mainly by the use of biocide or bacteriostatic agents, as well as for the use of metabolic inhibitors. In this work the effect of mixtures was evaluated containing the biosurfactant rhamnolipid, the inhibitor metabolic molybdate of sodium and the biocide tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium sulfate (THPS) about the metabolic activity of Desulfotomaculum nigrificans as well as about your adhesion to coupons of stainless steel AISI 304. The effect of the mixtures about the metabolic activity was evaluated by the estimate of viable cells and for the determination of residual sulphate in the medium of culture. The evaluation of the adhesion to coupons of stainless steel was accomplished by the direct count to the epifluorescence microscope. The experimental planning was accomplished according to Central Design Compost Rotational (DCCR) and the Methodology of Surface of Answer (MSR) was used to analyze the experimental design. There was not significant difference among the effects caused by the three compounds in the cellular viability in 6 and 18 hours after the addition of the compounds to the culture of D. nigrificans. All the appraised compounds were capable to inhibit the growth of D. nigrificans in anaerobic medium Baars to 55 ºC. The data of concentration of residual sulphate confirmed the effect of inhibition of the compounds also tested about the metabolic activity of that bacterium. Among the appraised compounds, the biosurfactant rhamnolipid was what presented larger effect of inhibitation in the adhesion of D. nigrificans to coupons of stainless steel, when cultivated in medium Baars to 55 ºC. It was the only compounds with effect significant statistics appeared in the times of 24, 48 and 96 hours of treatment evaluated. The Methodology of Surface of Answer revealed that the largest inhibition of the adhesion happens when the biosurfactant is added in concentrations from 1,0 to 1,6 times the value of your concentration critical micelar. The results suggest the potential of application of the biosurfactant rhamnolipid in the control of the adhesion and, eventually, of the biocorrosion caused by D. nigrificans. / As bactérias redutoras de sulfato (BRS) são consideradas o principal grupo de microrganismos envolvidos na formação de biofilmes e biocorrosão de oleodutos. A prevenção e o controle do crescimento desse grupo bacteriano têm sido realizados principalmente pela utilização de agentes biocidas ou bacteriostáticos, bem como pelo uso de inibidores metabólicos. Neste trabalho foi avaliado o efeito de misturas contendo o biossurfactante ramnolipídeo, o inibidor metabólico molibdato de sódio e o biocida sulfato de tetrakis (hidroximetil)fosfônio (THPS) sobre a atividade metabólica de Desulfotomaculum nigrificans, bem como sobre a sua adesão a cupons de aço inoxidável AISI 304. O efeito das misturas sobre a atividade metabólica foi avaliado pela estimativa de células viáveis e pela determinação de sulfato residual no meio de cultura. A avaliação da adesão a cupons de aço inoxidável foi realizada pela contagem direta em microscópio de epifluorescência. O planejamento experimental foi realizado segundo o Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) e a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) foi utilizada para se analisar o delineamento experimental. Não houve diferença significativa entre os efeitos causados pelos três compostos na viabilidade celular em 6 e 18 horas após a adição dos compostos à cultura de D. nigrificans. Todos os compostos avaliados foram capazes de inibir o crescimento de D. nigrificans em meio Baars anaeróbio a 55 ºC. Os dados de concentração de sulfato residual confirmaram o efeito inibitório dos compostos testados também sobre a atividade metabólica dessa bactéria. Dentre os compostos avaliados, o biossurfactante ramnolipídeo foi o que apresentou maior efeito inibitório na adesão de D. nigrificans a cupons de aço inoxidável, quando cultivada em meio Baars a 55 ºC. Ele foi o único composto com efeito estatisticamente significativo nos tempos de 24, 48 e 96 horas de tratamento avaliados. A Metodologia de Superfície de Resposta revelou que a maior inibição da adesão ocorre quando o biossurfactante é adicionado em concentrações de 1,0 a 1,6 vezes o valor da sua concentração micelar crítica. Os resultados sugerem o potencial de aplicação do biossurfactante ramnolipídeo no controle da adesão e, eventualmente, da biocorrosão causada por D. nigrificans.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 528396 bytes, checksum: 2b516aa2ea3ea48bfb173971c8b65f4c (MD5) Previous issue date: 2010-08-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The low germination percentages of P. microcarpus basidiospores represents a major drawback for obtaining monokaryotic strains for quantitative genetic studies on the mycorrhizal associations, the use of spores in mutagenesis experiments aiming at the identification of genes important to the symbiosis, and the use of these propagules as inoculants in forest nurseries. The characterization of the mRNA present within the fungal basidiospores may provide information on the level of preparedness of the spores to germinate and sustain initial hyphal growth. The aim of this work was to characterize the mRNA present in the basidiospores of the ectomycorrhizal fungus P. microcarpus after basidiosporogenesis. Total RNA was extracted from the mature basidiospores and mycelium and mRNA was used for cDNA synthesis. An analysis of the presence of 14 gene transcripts involved in lipid metabolism, glycogen mobilization, trehalose mobilization, nitrogen assimilation, glycolysis, pentose phosphate pathway and glucan degradation using cDNA from the fungal basidiospores and dikaryotic mycelium was done. qPCR analysis was performed to compare the amount of transcripts of the genes d15fa, ntrh, and ag13 which code respectively, for &#916;15 fatty acid desaturase, neutral &#945;-trehalase, and &#945;-1,3-glucosidase in the dikaryotic mycelium and basidiospores. The 14 transcripts studied were present both in the dikaryotic mycelium and in the basidiospores, indicating a preparedness of these propagules to initiate and sustain germination. qPCR analysis indicated a higher amount of transcripts of genes the d15fa, ntrh, and ag13 inside the basidiospores when compared to the dikaryotic mycelium. These results suggest a higher need for enzymes involved in the synthesis of unsaturated fatty acids, trehalose mobilization, and glucan degradation during basidiospore germination. A cDNA library was constructed from basidiospore mRNAs and 288 clones were sequenced. One hundred and nineteen sequences were obtained, resulting in a total of 12 ESTs (expressed sequence tags). The amino acid sequence deduced from the EST corresponding to clone 277 showed significant similarity to a protein involved in respiratory metabolism and may be important during the germination process. Other ESTs showed significant identity to unknown ESTs deposited in the NCBI database. These ESTs may code for proteins that are specific of the basidiospores of P. microcarpus. However, to confirm this hypothesis, other clones must be sequenced to better characterize the cDNA library. / As baixas percentagens de germinação dos basidiósporos do fungo ectomicorrízico Pisolithus microcarpus dificultam a obtenção de estirpes monocarióticas, material para estudos de genética quantitativa da associação micorrízica, inviabilizam a utilização de esporos em experimentos de mutagênese visando à identificação de genes importantes para a simbiose, além de dificultar a utilização desses propágulos como inoculantes em viveiros florestais. A caracterização do mRNA presente no interior desses basidiósporos poderá fornecer informações sobre o nível de preparação que têm para iniciar o processo de germinação e sustentar o crescimento inicial das hifas. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar os mRNA presentes nos basidiósporos do fungo ectomicorrízico P. microcarpus após a basidiosporogênese. O RNA total foi extraído de basidiósporos maduros e micélio, procedendo posteriormente a obtenção mRNA para a síntese de cDNA. Determinou-se a presença de transcritos de 14 genes envolvidos no metabolismo de lipídeos, na mobilização de glicogênio, na mobilização de trealose, na assimilação de nitrogênio, na via glicolítica, na via das pentoses fosfato e na degradação de glicanas. A análise por qPCR foi realizada visando comparar a quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 que codificam respectivamente as enzimas ácido graxo-&#916;15 desaturase, &#945;- trealase neutra e 1,3-&#945;-glicosidase, nos basidiósporos e no micélio dicariótico. Os 14 x transcritos avaliados foram encontrados tanto no micélio dicariótico quanto nos basidiósporos, sugerindo a preparação desses propágulos para iniciar e sustentar o processo de germinação. A análise por qPCR indicou maior quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 no interior dos basidiósporos quando comparado ao micélio dicariótico. Esse resultado sugere a participação de enzimas responsáveis pela síntese de ácidos graxos insaturados, mobilização de trealose e degradação de glicanas durante o processo de germinação. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir dos fragmentos de cDNA dos basidiósporos, sendo caracterizada por meio do sequenciamento de 288 clones. Foram obtidas 119 sequências que, ao serem agrupadas, resultaram em 12 ESTs (expressed sequence tags). A sequência de aminoácidos deduzida da EST referente ao clone 277 apresentou similaridade significativa com proteína envolvida no metabolismo respiratório, podendo ser importante durante o processo de germinação. Outras ESTs apresentaram identidade significativa com ESTs depositadas no banco de dados do NCBI ainda não identificadas. Alternativamente, sugere-se que essas ESTs possam ser codificadoras de proteínas específicas dos basidiósporos de P. microcarpus, importantes para a etapa de germinação desses propágulos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6286736 bytes, checksum: e354da66e718cf4d321aafb79e0de30c (MD5) Previous issue date: 2011-09-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bacteria belonging to the genus Bacillus have physiological plasticity regarding to the conditions of temperature, pH and salinity of the environments in where they are found, such as: water, soil, polluted environments, among others. Under the environmental aspect, these bacteria have the capacity to produce biosurfactants which put them as potential microorganisms for the application of Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR).Technologies economically viable and of growing acceptance, like MEOR, can receive additional informations from the molecular tools about the microbial behavior. In this context, the fluorescence in situ hybridization technique (FISH) is an important tool for detection of microorganisms present in different samples. This technique allows the detection of microorganisms without the need of cultivation. Oligonucleotide probes complementary to the rRNA can be designed with specificities that range from the species level to the domains level. The aims of this work was to apply the FISH technique to detect bacteria of the genus Bacillus and establish the best combination of parameters which combines specificity and good fluorescence signal intensity of the probes utilized. In this way, it was utilized a specific probe for the genus Bacillus (BAC07) and a universal probe for the Domain Bacteria (EUB338). The in silico analysis revealed that the target sequence of probe BAC07 is found predominantly in bacteria of the genus Bacillus, however the possibility of hybridization of probe BAC07 with another member of class Bacilli was not discarded. The parameters analyzed for the application of the FISH technique and evaluation of the specificity of probe BAC07 were: cell fixation method, formamide concentration added to the hybridization buffer and pretreatment of cells with lysozyme. The combination of parameters that ensured the best signal for the probe EUB338 was: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 35% formamide, without pretreatment with lysozyme; the best conditions for the probe BAC07 were: cells fixed in paraformaldehyde solution 4%, hybridization buffer containing 40% formamide, without pretreatment with lysozyme. A specific detection of bacteria of the genus Bacillus was achieved by probe BAC07. However, the fluorescence signal intensity was very weak when in comparison to the signal of probe EUB338, thereby, for the utilization of probe BAC07 for detection of Bacillus in environmental samples, an enhanced signal is required. / Bactérias pertencentes ao gênero Bacillus possuem grande plasticidade fisiológica no que se refere às condições de temperatura, pH e salinidade dos ambientes nos quais são encontradas, como: água, solo, ambientes poluídos, entre outros. Sob o aspecto ambiental, possuem a capacidade de produção de biossurfactantes que as colocam como micro-organismos potenciais para aplicação na Recuperação Avançada de Petróleo Melhorada por Micro-organismos (MEOR). Tecnologias economicamente viáveis e de crescente aceitação, como a MEOR, podem receber informações adicionais das ferramentas moleculares acerca do comportamento microbiano. Neste contexto, a técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH) apresenta-se como uma importante ferramenta para detecção de microorganismos presentes em diferentes amostras. Trata-se de uma técnica que permite a detecção de micro-organismos sem a necessidade prévia de cultivo. Sondas de oligonucleotídeos complementares ao RNAr podem ser elaboradas com especificidade que varia desde o nível de espécie até o nível de Domínio. Este trabalho teve como objetivos aplicar a técnica de FISH para detectar bactérias do gênero Bacillus e estabelecer a melhor combinação de parâmetros que aliassem especificidade à emissão de um adequado sinal de fluorescência das sondas utilizadas. Desta forma, foram utilizadas uma sonda específica para o gênero Bacillus (BAC07) e uma sonda universal para o Domínio Bacteria (EUB338). A análise in silico revelou que a sequência-alvo da sonda BAC07 é encontrada predominantemente em bactérias do gênero Bacillus, porém não foi descartada a possibilidade de hibridização da sonda BAC07 com outros membros da classe Bacilli. Para aplicação da técnica de FISH e avaliação experimental da especificidade da sonda BAC07, os parâmetros avaliados foram: o método de fixação das células, a concentração de formamida adicionada ao tampão de xi hibridização e o pré-tratamento das células com lisozima. A combinação de parâmetros que garantiu o melhor sinal para a sonda EUB338 foi: células fixadas em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 35% de formamida, sem pré-tratamento com lisozima; as melhores condições para a sonda BAC07 foram: a fixação das células em solução de paraformaldeído 4%, tampão de hibridização com 40% de formamida e sem pré-tratamento com lisozima. Conseguiu-se uma detecção específica de bactérias do gênero Bacillus pela sonda BAC07. No entanto, o sinal de fluorescência foi muito fraco quando comparado ao sinal da sonda EUB338, de modo que, para utilização da sonda BAC07 para detecção específica de Bacillus em amostras ambientais, o estabelecimento de condições que promovam a intensificação do sinal é requerido.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 822133 bytes, checksum: e079e0bf0b7042a8b0741f41174d4120 (MD5) Previous issue date: 2006-05-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The physiological and technological parameters important to the development of Direct Vat Set culture of Lactobacillus delbrueckii UFV H2b20 cultivated in Minas Frescal cheese whey were studied. Greater fermentative activity on cheese whey was observed at 40ºC and therefore all bacterial growth experiments were performed at this temperature. Heat shock, 50ºC for 30 minutes, or acid stress, cheese whey with pH 3.5 for 30 minutes, did not affect growth of L. delbrueckii UFV H2b20 on cheese whey. The survival of heat or acid pre-treated cells was assessed after dehydration by lyophilization and spray-drying. Cell survival to either dehydration processes was not affected by acid pre-treatment, whereas heat shock had a deleterious effect on survival. The addition of protective substances (6% mannitol, 1,25% sorbitol, 1,25% monosodium glutamate and mixture of 6% sucrose and 4% trehalose) to cheese whey in which the cells were submitted to lyophilization did not improve cell survival to dehydratation and storage at -80ºC for two months. Cell survival was greater when lyophilization was performed on cheese whey alone. Acid pre-treated cells on cheese whey, pH 3.5 adjusted with HCl, without any further addition, retained higher viable counts after lyophilization and subsequent -80ºC storage. Cell activity recovery in 10% reconstituted skimmed milk was not affected by either heat shock or acid pre-treatment when cells were lyophilized in cheese whey with no additional substances. Spray-dried cultures submitted to acid stress demonstrate recovery comparable to active cells which were not subjected to any condition that could result in cell injury. Those cultures exhibit a high activity even after two months storage at - 20ºC. The hereby presented results demonstrate that the probiotic culture produced in stabilized Minas Frescal cheese whey, pre-treated at pH 3.5, and spray-dried have desirable viability and activity characteristics, and its use can be recommended for the elaboration of milk fermented products containing L. delbrueckii UFV H2b20 cells. / Os parâmetros fisiológicos e tecnológicos de importância para o desenvolvimento de sistema DVS para Lactobacillus delbrueckii UFVH2b20 em soro de queijo Minas Frescal estabilizado foram estudados. A maior atividade fermentativa das células do L. delbrueckii UFV H2b20 em soro de queijo ocorreu a 40ºC. Por essa razão, essa temperatura de incubação foi adotada para a condução dos experimentos. Foi observado que a aplicação de choque térmico, 50ºC por 30 minutos, ou choque ácido, pH 3,5 por 30 minutos, a 40ºC, às células de L. delbrueckii UFV H2b20 não afetaram seu crescimento. Foi avaliado ainda se a aplicação de tais pré-tratamentos afetava a sobrevivência aos processos de desidratação das células por liofilização e spray-drying. Foi observado que o choque ácido não afetou a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 aos dois processos de desidratação avaliados. Por outro lado, o choque térmico teve efeito deletério sobre a sobrevivência das células submetidas aos mesmos processos de desidratação. Para as culturas liofilizadas, foi avaliado se a adição de diferentes soluções protetoras (manitol 6%, sorbitol 1,25%, glutamato monossódico 1,25% e mistura das soluções de sacarose 6% e trealose 4%) exercia efeito sobre a sobrevivência de L. delbrueckii UFV H2b20 à liofilização, bem como durante o período de estocagem das células desidratadas a -80ºC por 2 meses. A sobrevivência das células ao processo de liofilização foi maior quando não se adicionaram substâncias crioprotetoras ao soro de queijo. Maior viabilidade durante o armazenamento a -80ºC foi observada quando as células foram pré-tratadas em soro de queijo pH 3,5, ajustado com HCl e sem a adição de outras substâncias antes da liofilização. Observou-se que os choques térmico ou ácido não afetaram a recuperação imediata em leite desnatado reconstituído a 10% das culturas liofilizadas que não sofreram adição de substâncias protetoras. Nas culturas desidratadas por spray-drying, observou-se que as células de L. delbrueckii UFV H2b20, previamente submetidas ao choque ácido, lograram crescimento comparável ao obtido pelas células ativas que não foram submetidas a qualquer condição que possa causar injúria. Essas culturas permaneceram com elevado número de células, mesmo após 2 meses de estocagem a -20°C. Os resultados obtidos levam à conclusão de que a cultura starter probiótica produzida em soro de queijo Minas Frescal estabilizado, desidratada por spray-drying e previamente submetida ao choque ácido, demonstrou características de viabilidade e atividade mais promissoras, e seu uso pode ser recomendado para a elaboração de produtos lácteos fermentados contendo células do L. delbrueckii UFV H2b20.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 609136 bytes, checksum: bfac4beb809c8b3d58b49895dc0cc2d1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The high affinity interaction streptavidin-biotin provides an excellent system for industrial enzyme separation or immobilization involving a fused streptavidin-enzyme and a biotinylated support. In order to produce proteins with affinity to biotin, we have modified the commercial K. lactis system, pKLAC1 (New England Biolabs), a LAC4 promoter-driven integration vector for protein expression, with the gene coding streptavidin. The codifying sequence for biotin binding domain of streptavidin (cStp) was amplified by PCR from pSTP4, purified and subcloned to the pCR2.1TOPO (Invitrogen). The fragment has revealed 100% identity with streptavidin gene according to Gene Bank and it was inserted into Xho I / Bgl II pKLAC1 in frame with mating-&#945;-factor signal peptide. The pKLAC1/cStp cut by Ahd I enzyme was used to transform the strains K. lactis MW 98.8C and CB S2359. The transformants selected in Yeast Carbon Base (YCB) containing 5 mM acetamide and confirmed by PCR were mitotically stable. A high cell biomass (OD 600 = 18), obtained in shake-flask 50 mL YPD medium, was centrifuged and transferred to an induction medium, containing 2% of lactose. The cell free medium was qualitatively analyzed for streptavidin and proteins by SDS PAGE. The samples were collected in each 24 hours during 6 days of bath culture. The biotin binding activity of streptavidin in the culture supernatant was determined by HABA test. The medium YPL and YNB with 0,5% of yeast extract have exhibited the best yields for streptavidin extracellular protein production. / A forte interação da proteína estreptavidina pela molécula de biotina constitui um excelente sistema para a separação e/ou imobilização de proteínas e de enzimas de interesse industrial. Com a intenção de produzir proteínas com propriedades de adsorção biosseletiva, nós temos modificado a seqüência do plasmídeo pKLAC1 pela inserção do domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina. Utilizando a técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR), a seqüência de cerca de 355pb foi amplificada a partir do vetor pSTP4 que contém toda seqüência de nucleotídeos referente à proteína estreptavidina. O Fragmento amplificado apresentou 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos da proteína estreptavidina depositada no Gene Bank. O fragmento foi inserido no vetor pKLAC1 nos sítios Xho I e Bgl II em fase com a seqüência do peptídeo sinal do mating-&#945;-factor. O plasmídeo pKLAC1/cStp foi linearizado com enzima Ahd I e foi utilizado para a transformação das linhagens de K. lactis MW 98.8C e CBS 2359. Os transformantes selecionados em meio YCB (Yeast Carbon Base) contendo 5 mM de acetamida como única fonte de nitrogênio e confirmados por PCR foram mitoticamente estáveis. A alta biomassa celular (DO600 = 18) obtida em erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio YPD foi centrifugada e transferida para meio de indução contendo 2% (p/v) de lactose. O sobrenadante das culturas foi analisado qualitativamente para estreptavidina pela técnica de SDS PAGE. As proteínas totais foram determinadas pelo método de BRADFORD utilizando BSA (Albumina Bovina Sérica) como padrão. As amostras foram coletadas a cada 24 horas durante 6 horas de cultivo sob regime de batelada. A atividade da proteína estreptavidina presente no sobrenadante das culturas recombinantes foi determinada pelo teste do reagente HABA. Os meios YPL e YNB contendo 0,5% de extrato de levedura exibiram os melhores resultados quanto à produção extracelular de estreptavidina ativa e de proteínas totais.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) pode causar diarréia aguda ou persistente. É caracterizada por seu padrão de aderência agregativa em células HEp-2, em que há presença de agregados bacterianos com aspecto de tijolos empilhados. Muitas cepas têm a capacidade de produzir sideróforos, moléculas de baixo peso molecular especializadas na captação de ferro, em condições de baixa concentração deste elemento. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, pois é utilizado como cofator de enzimas envolvidas em processos celulares fundamentais. Além disto, pode participar da geração de espécies reativas de oxigênio (ERO) através da reação de Fenton. No presente estudo, analisamos os efeitos da baixa disponibilidade de ferro, mediada pelo quelante 2,2-dipiridil, nas propriedades adesivas e formação de biofilme da cepa protótipo 042 e de cepas clínicas de EAEC. Todas as cepas apresentaram diminuição da aderência às células HEp-2 e T84 quando cultivadas em níveis restritos de ferro, mostrando que a homeostasia do ferro é importante para a aderência, primeira etapa da patogênese de EAEC. Além disso, houve formação de filamentos bacterianos nessa condição. O estudo da formação de biofilme apresentou resultados diferentes da cepa protótipo em relação às cepas clínicas, sugerindo uma relevante diferença entre elas. Enquanto a cepa protótipo teve sua capacidade de formar biofilme diminuída em níveis restritos de ferro, as cepas clínicas apresentaram maior formação dessa estrutura. A capacidade da tiouréia, um captador de radical hidroxil, de reverter os efeitos observados com a restrição de ferro, sugerem a ocorrência de estresse oxidativo na presença do quelante. Nossos dados mostram que a homeostasia do ferro não é importante somente para o crescimento bacteriano, mas também para a proteção contra o estresse oxidativo, condição esta que também pode ocorrer in vivo, durante o estabelecimento de infecções, devido à ação de neutrófilos e macrófagos ativados. / Escherichia coli enteroaggregative (EAEC) can cause persistent or acute diarrhea. It is characterized by the aggregative adherence pattern on HEp-2 cells, with the presence of bacteria aggregates like stacked bricks. Many strains have the capacity to produce siderophores, low-molecular-mass compounds that capture iron under conditions of low concentration of this element. The iron is an essential microelement to bacteria, because is used as cofactor of enzymes involved at importants cellular processes. Mareover, the iron can participate of reactive oxygen species production (ERO) by Fenton reaction. At this study, we analyzed the effects of low iron availability mediated by the chelator 2,2-dypiridyl at adhesives properties and biofilm formation of prototype EAEC 042 strain and EAEC clinical isolates. All strains showed a decreased adherence to HEp-2 and T84 cells under iron restriction, suggesting that iron homeostasis is important to adherence, the first step of EAEC pathogenesis. Besides, filament growth was observed at this condition. The study of biofilm formation revealed differences among the prototype EAEC 042 strain and the clinical isolates. While the prototype strain showed a decreased biofilm formation when under iron restriction, the clinical isolates showed an increase of this process. The capacity of thiourea, a hydroxyl radical scavenger, to revert the effects of iron restriction, suggests the occurrence of oxidative stress at the chelator presence. Our data show that iron homeostasis is important not only to bacterial growth, but also for protection against oxidative stress, a condition that also can occur in vivo, during the establishment of infections, through the action of neutrophiles and activated macrophages.

Nas últimas décadas, os Staphylococcus coagulase-negativo, têm sido considerados como patógenos verdadeiros, sendo um dos principais grupos bacterianos responsáveis pelas infecções relacionadas a assistência a saúde (IRAS). O presente estudo teve como objetivo geral: avaliação da relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras Staphylococcus coagulase-negativo de origem comunitária e hospitalar. Neste sentido, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específico: identificar ao nível de espécie os Staphylococcus coagulase-negativo; analisar por técnica fenotípica (Ágar vermelho do Congo) a produção de slime; avaliar quantitativamente, a produção de biofilme; correlacionar a produção de polissacarídeos extracelulares (slime) com a produção de biofilme; avaliar a relação da resistência a oxacilina como indicador da presença do gene mecA; avaliar a relação entre a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima para oxacilina; pesquisar a presença dos genes mecA, icaAD e atlE, pela técnica de PCR. Foi estudado um total de 150 amostras, sendo 50 isoladas de fômites, 50 isoladas de sangue e 50 isoladas de comunidade. Independente da origem, foram identificadas 14 espécies de Staphylococcus coagulase-negativo, sendo mais frequentes S. epidermidis 42,6%, S. haemolyticus 13,3% e S. cohnii cohnii 10,7%. A análise geral da expressão fenotípica de slime mostrou que 64% das amostras avaliadas eram produtoras de slime. Das 150 amostras testadas neste estudo, 95,3% foram produtoras de biofilme. Ao considerarmos a análise da quantificação do biofilme em relação às origens das amostras estudadas não encontramos diferenças significativas e a maioria das amostras foi considerada moderadamente produtora de biofilme. O gene mecA foi detectado em 6 amostras comunitárias, 34 amostras de fômites e 34 amostras de sangue. Não houve diferença significativa entre as amostras de fômites e sangue. Porém, houve diferença significativa entre as amostras de origem comunitária e as de origem hospitalar - fômites e sangue (p < 0,0001). Ao compararmos as três origens de isolamento quanto a presença do gene atlE observamos que houve diferença significativa (p = 0,0012) entre elas. Sendo, as amostras isoladas de sangue, as que apresentaram maior número de amostras que possuíam o gene atlE (n = 18). Das 150 amostras testadas observamos a presença do gene icaAD em 46% amostras comunitárias, 56% amostras de fômites e 60% amostras de sangue, não encontramos diferença significativa (p = 0,5750). Observamos uma correlação entre a resistência a oxacilina e a produção de slime, pois as amostras de origem hospitalar (fômites e sangue) apresentaram altos níveis de resistência a oxacilina e em sua grande maioria foram produtoras de slime. A espécie S. epidermidis foi a mais isolada e deve-se ressaltar que, quando comparada com as outras espécies, apresentou altos níveis de resistência a oxacilina, sendo a maioria produtora de slime e biofilme. / In recent decades, coagulase-negative Stapphylococci have been considered as true pathogen, one of the major bacterial groups responsible for hospital infection. The present study aimed to: assess the relationship between oxacillin resistance and biofilm production samples coagulase-negative Stapphylococci of community and hospital. In this sense, we have developed the following specific objectives: to identify to species level coagulase-negative Staphylococci; analyze by phenotypic test (Congo red Agar) slime production, evaluate quantitatively the biofilm production; correlate the production of extracellular polysaccharides (slime) with biofilm production; evaluate the relationship of resistance to oxacillin as an indicator of the presence of the mecA gene; evaluate the relationship between minimal inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration for oxacillin; investigate the presence of the mecA gene, atlE and icaAD, by PCR. We studied a total of 150 samples, 50 were isolated from fomites, 50 from community and 50 isolated from blood. Regardless of origin, 14 species of coagulase-negative Stapphylococci were identified , being more frequent 42.6% S.epidermidis, 13.3% S. haemolyticus and 10.7% S. cohnii cohnii. A general analysis of the phenotypic expression of slime showed that 64% of the samples were slime producers. Of the 150 samples tested in this study, 95.3% produced biofilm. When we consider the analysis of quantification of biofilm in relation to the origins of the samples studied we did not find significant differences and most of the samples were considered moderately biofilm producers. The mecA gene was detected in 6 community samples, 34 samples of fomites and 34 blood samples. There was no significant difference between the samples of blood and fomites. However, there was significant differences between the samples from the community and nosocomial - fomites and blood (p <0.0001). Comparing the three origins insulation as the presence of the gene atlE we observed a significant difference (p = 0.0012) between them. Being the isolated blood samples which showed the highest number of samples that had the gene atlE (n = 18). From the 150 tested samples we observed the presence of the gene icaAD 46% in community samples, 56% samples from fomites and 60% of blood samples, we found no significant difference (p = 0.5750). We observed a correlation between oxacillin resistance and slime production, because the nosocomial (fomites and blood) samples showed high levels of resistance to oxacillin and mostly were slime producers. The species S. epidermidis were the most isolated and it should be noted that, compared with other species, it showed high levels of resistance to oxacillin, mostly producing slime and biofilm.