La microscopie optique est une technique essentielle pour de nombreuses disciplines des sciences expérimentales qui nécessitent des résolutions sans cesse plus petites. Dans ce travail de thèse sont présentés plusieurs travaux pour l'amélioration de la résolution en microscopie de fluorescence et en microscopie tomographique par diffraction (MTD), une récente technique de microscopie de phase. Dans un premier temps, il est montré que déposer l'échantillon sur un miroir permet d'augmenter la résolution axiale en MTD et en microscopie confocale de fluorescence. En microscopie confocale, il faut pour cela mettre en forme le faisceau incident grâce à un modulateur spatial de lumière. En MTD, il suffit d'adapter le programme de reconstruction. La deuxième partie présente des algorithmes pour reconstruire des images haute résolution à partir de mesures en éclairement structuré avec de champs d'illumination inconnus, à la fois en microscopie de fluorescence (algorithme blind-SIM) et en MTD. En microscopie de fluorescence, ces algorithmes permettent de simplifier drastiquement les montages expérimentaux produisant l'éclairement structuré et en MTD, d'obtenir des images d'échantillons à fort indice.

Les phospholipides sont des constituants importants de la membrane cellulaire. Ce sont des lipides qui regroupent deux acides gras, du glycérol et du phosphate, liés de façon covalente. Ce projet de recherche vise à synthétiser de nouveaux composés phospholipides avec deux appendices greffés sur la tête phosphate : un groupe ferrocène (sonde électrochimique) ainsi qu'un groupe dansyle (unité fluorescente). Ces biomolécules modifiées pourraient être incorporées dans des liposomes et des membranes biologiques, permettant d'étudier ces superstructures par microscopie de fluorescence et électrochimique, cette dernière utilisant des ultra-microélectrodes. Le microscope pourrait servir à la détection des cellules particulières sécrétant des espèces électroactives à un potentiel donné. Donc, ces molécules ont un intérêt tant en électrochimie, en biochimie qu'en chimie organique. Le défi dans cette recherche est qu'il n'y a aucun phospholipide dans la littérature comportant à la fois les deux fonctions de visualisation : fluorescence et potentiel redox. La première étape du projet, qui consiste en la production du composé 1,2-dioléoylglycérol, a bien été réalisée en trois étapes seulement et avec un rendement global de 34 % via une mono-protection du glycérol. Le choix de la sonde fluorescente a été porté sur le groupe dansyle pour des raisons de stabilité, de facilité de couplage et de disponibilité. Le chlorure de dansyle a réagi avec l'éthanolamine pour fabriquer l'alcool à coupler, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol, le phospholipide marqué avec le dansyle a été préparé avec succès avec un bon rendement de 85 %. Pour le dernier groupe, soit la sonde électrochimique de cette synthèse, le ferrocène a été choisi selon les prérogatives des collègues électrochimistes, pour son potentiel redox compatible avec les milieux biologiques. Le composé ferrocèneéthanol, préparé par le groupe de Prof. Mauzeroll, a été utilisé comme alcool de couplage. Ensuite, en vue d'obtenir un phospholipide fluorescent et électroactif, deux types de structures ont été visées. Le premier type est un phosphate trisubstitué combinant le 1,2-dioléoylglycérol et les deux alcools sondes, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol et le ferrocèneéthanol. Malheureusement cette synthèse, tentée via divers protocoles connus, n'a pas fonctionné, particulièrement lors du couplage du partenaire ferrocène. Un deuxième type de composé comprend un phosphate dialkylé cette fois, combinant toujours le 1,2-dioléoylglycérol avec un autre alcool comportant à la fois le groupe dansyle et le ferrocène, en l'occurrence le (N-dansyl, N-ferrocényléthyl)-2-aminoéthanol. Malheureusement encore, cet alcool bifonctionnalisé n'a pas pu être obtenu par des méthodes usuelles. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Phospholipides, sonde électrochimique, unité fluorescente, ultra-microélectrodes, 1,2-dioléoylglycérol, ferrocèneéthanol, dansyle.

Thèse doctorat : Matériaux : Villeurbanne, INSA : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. à la fin de chaque chapitre.

Thèse de doctorat : Electronique : Lille 1 : 2000. / Résumé en français. Textes en français et en anglais (publications). Bibliogr. en fin de chapitres.

Thèse doctorat : Micro-Electronique. Dispositifs de l'Electronique Intégrée : Villeurbanne, INSA : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. à la fin de chaque chapitre.

Thèse doctorat : Génie des Matériaux : Villeurbanne, INSA : 2006. / Contient 1 lexique. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. à la fin de chaque chapitre.

Bacillus anthracis, l'agent infectieux responsable de la maladie du charbon, est un agent pathogène majeur du risque biologique provoqué, notamment en raison de la sévérité de la forme respiratoire de la maladie. Celle-ci résulte de l'inhalation de spores dont les mécanismes de pénétration au niveau pulmonaire sont mal connus à l'heure actuelle. Cette thèse présente les apports des microscopies confocale et biphotonique à l'étude de ces mécanismes de pénétration des spores inhalées. Le modèle murin CX3CR1+/gfp, dont la sous-population CD11b+ de cellules dendritiques (DCs) exprime constitutivement la protéine de fluorescence verte (GFP), a été utilisé dans ces travaux. Une première partie présente le développement d'une méthode automatisée de discrimination des DCs parmi d'autres populations cellulaires exprimant le même fluorophore, en se basant sur le calcul d'un coefficient morphologique. Cette méthode a permis d'étudier dans un deuxième temps le comportement spécifique de la sous-population de DCs CD11b, après infection par des spores de B. anthracis. L'étude microscopique a été d'abord effectuée in situ, c'est-à-dire sur des explants pulmonaires maintenus dans des conditions favorables à la préservation de l'activité cellulaire, puis in vivo, sur des souris anesthésiées et ventilées. Le protocole d'imagerie tire profit d'une stratégie d'acquisition et de traitement a posteriori des données permettant de surmonter, sans contrainte mécanique appliquée à l'organe, les problèmes de focalisation liés aux mouvements thoraciques durant la ventilation de l'animal. Cette stratégie originale utilise un sur-échantillonnage de l'acquisition et profite du signal de seconde harmonique généré par le collagène comme référence spatiale ; elle a permis l'observation in vivo d'interactions entre DCs et macrophages au niveau pulmonaire. Ces interactions, de type synapse immunologique, sont favorisées par l'infection et présentent donc un rôle fonctionnel qui reste à définir. La formation de synapses immunologiques entre macrophages et DCs pourrait non seulement représenter un chaînon manquant à l'explication de la pénétration des spores de B. anthracis au niveau pulmonaire, mais pourrait aussi constituer un enjeu crucial dans la compréhension de la réponse immunitaire associée aux infections pulmonaires. / Bacillus anthracis, the causative agent of anthrax, is a major bioterrorism pathogen mainly because it can lead to a severe respiratory form of the disease. This form results from inhalation of spores, whose ways of entry into the lungs are not fully understood. This thesis reports the contribution of confocal and two-photon microscopy to the study of the penetration mechanisms of inhaled spores. The animal model utilized was CX3CR1+/gfp mouse, which constitutively expresses the green fluorescent protein (GFP) on CD11b+ dendritic cells (DCs). First, we present an automated method allowing discrimination of DCs among other GFP expressing cells, based on a morphologic coefficient. This method was then applied to the study of the specific behavior of CD11b DCs, after infection by B. anthracis spores. The microscopic study was first performed in situ, i.e. on explanted organs kept in conditions favorable to cell dynamics, then in vivo, i.e. on anesthetized and ventilated mice. In this case the imaging protocol profits from both acquisition and post-processing strategies, and allowed overcoming the focalization pitfalls coming from chest movements during ventilation. This novel strategy is based on an over-sampling of frame acquisition and utilizes second harmonic generation signal from alveolar collagen as a spatial reference. It led to the first ever in vivo observation of interactions between DCs and macrophages at the lung level. These immunological synapse-like structures are promoted by infection and thus display a functional role unknown until now. The formation of macrophages-DCs immunological synapses not only could represent a missing-link in figuring out the B. anthracis spore penetration mechanisms at the lung level, but more importantly could lead to a better understanding of the immune response associated with pulmonary infections.

Cette thèse s’inscrit dans le cadre des études portant sur la toxicité des nanoparticules (NPs). Leurs propriétés physico-chimiques confèrent aux NPs la capacité de pénétrer dans les cellules en traversant la membrane plasmique. La compréhension de l’interaction NPs-membrane est donc cruciale. La structure complexe des membranes nous a imposé d’étudier l’interaction NPs-membrane à l’aide de films lipidiques plans (monocouches et bicouches) utilisés comme modèles membranaires simplifiés, déposés sur des surfaces nanostructurées par le dépôt préalable de NPs de silice (4 à 100 nm de diamètre) ou transférés à partir de monocouches étalées sur une suspension de NPs. Deux méthodes complémentaires ont été utilisées, la microscopie de force atomique (AFM) et la microscopie de fluorescence. Après une première phase d’optimisation des protocoles expérimentaux (choix des lipides, conditions de préparation des surfaces nanostructurées et des films), l’AFM a d’abord révélé l’oxydation des films monocouches constitués de lipides insaturés, se traduisant par la formation de domaines surélevés par rapport à la phase lipidique intacte. Dans le cas des films de lipides présentant une transition de phase de type liquide expansé/liquide condensé, la présence des NPs (le plus souvent sous forme d’agrégats) semble favoriser la transition vers la phase condensée, les NPs étant situés soit au coeur soit en lisière des domaines condensés.Dans le cas des bicouches, l’étude par AFM en milieu liquide montre des comportements tribologiques différents des agrégats de NPs, suggérant deux organisations possibles de la bicouche lipidique, recouvrant les NPs ou formant des pores autour d’elles. / The subject of this thesis fits into the large field of the toxicity of nanoparticles (NPs). Thanks to their physico-chemical properties, NPs are able to enter cells through the plasma membrane. Understanding the NPs-membrane interaction is thus very important. Membranes being complex structures, we chose to study this interaction using planar lipid films (monolayers and bilayers) as simplified membrane models, either deposited on nanostructured surfaces prepared by the prior deposition of silica NPs or transferred from monolayers spread on a subphase containing NPs (4-100 nm in diameter). Two complementary methods were used, atomic force microscopy (AFM) and fluorescence microscopy.After a first part devoted to the optimization of the experimental procedure (choice of lipids, design of nanostructured surfaces and films), AFM first revealed the oxidation of transferred monolayers made of unsaturated lipids, leading to the formation of domains raised above the intact lipid phase. In the case of films made of lipids characterized by a liquid expanded/liquid condensed phase transition, the presence of NPs (usually organized in aggregates) seems to favor the transition to the condensed phase, NPs being either embedded in condensed domains or at their edges.The final phase of this work was devoted to the study of NPs / bilayer interaction by AFM in liquid medium. The study shows different tribological behavior of NPs aggregates, suggesting two possible organizations of the lipid bilayer, covering the NPs or forming holes around them.

L'objectif du projet de doctorat est le développement d'une procédure innovante de mesure et post-traitement des données pour obtenir des informations quantitatives sur les paramètres magnétiques de nanoparticules magnétiques individuelles par l'utilisation de la Microscopie à Force Magnétique (MFM). Les nanoparticules magnétiques (MNP), grâce à leurs propriétés magnétiques particulières (monodomaine, superparamagnétisme, etc.) et leur taille nanométrique, conviennent à plusieurs applications biomédicales, telles que les systèmes d'administration de médicaments, les traitements de hyperthermie magnétique, l'étiquetage cellulaire, les agents de contraste pour l'imagerie a résonance magnétique (IRM). La conception de ces techniques requiert une connaissance détaillée des propriétés magnétiques des nanomatériaux utilisès, comme l'aimantation de saturation Ms, le champ magnétique de saturation Hs, la coercivité Hc. Les techniques standard, comme les dispositifs supraconducteurs à interférence quantique (SQUID) ou la magnétomètrie à échantillon vibrant (VSM), permettent la détection des propriétés magnétiques globales des populations de nanoparticules. Mais la détection des propriétés magnétiques des particules isolées n'est pas possible et l'évaluation de ces propriétés en fonction de la taille des particules n'est pas explicite. Grâce à sa résolution latérale nanométrique et sa capacité à détecter des champs magnétiques faibles, MFM est un outil puissant pour la caractérisation de dimensions de nanoparticules isolées, ainsi que leurs propriétés magnétiques. Cependant, une méthodologie pour obtenir des informations quantitatives sur les caractéristiques magnétiques de nanoparticules isolées par MFM n'a pas été individualisée, principalement en raison de i) la complexité des interactions pointe-échantillon qui affectent les mesures MFM et qui produisent également des phénomènes non magnétiques (par exemple, des interactions électrostatiques), et ii) l’absence d'un modèle théorique décrivant les interactions magnétiques entre la pointe et une nanoparticule de manière cohérente avec les données expérimentales détectées. Pour exploiter toutes le potentialités de la technique MFM en tant qu'instrument de nanométrologie magnétique, la stratégie proposée et suivie dans ce projet est organisée en 4 phases:1) a vérification théorique et expérimentale et la rationalisation des problemes ouvertes limitant l'applicabilité de la MFM à la caractérisation magnétique quantitative des NP individuels; Dans cette phase, la présence d'artefacts électrostatiques a été individualisée comme principale limite responsable de l'incohérence entre les données expérimentales et les modèles théoriques décrivant les interactions tip-NP. 2) le développement d'un appareil instrumental et d'une procédure de mesure pour évaluer et éliminer les contributions non magnétiques (électrostatiques) affectant quantitativement les données MFM; 3) l'individuation d'un modèle théorique décrivant l'interaction magnétique pointe-NP, cohérente avec les données expérimentales, et capable d'établir une relation précise entre les données mesurées et les paramètres physiques à déterminer (magnétisation dans le cas spécifique); 4) le développement d'une procédure pour mesurer quantitativement les propriétés magnétiques, et eventuellement d'autres paramètres, de nanoparticules isolées par MFM. Les résultats obtenus avec les procédures et les méthodologies présentées dans cette thèse ont démontré la possibilité de réaliser des mesures magnétiques quantitatives sur des NP magnétiques individuelles par la plateforme technologique MFM. / The objective of the PhD project is the development of a innovative measurement procedure and a data post-processing method to obtain quantitative information about the magnetic parameters of single magnetic nanoparticles through the use of the Magnetic Force Microscopy (MFM) technique. Magnetic nanoparticles (MNPs), thanks to their particular magnetic properties (single domains, superparamagnetism, etc.) and their nanometric size, are thought to be suitable for several biomedical applications, such as drug delivery systems, magnetic hyperthermia treatments, cell labelling, contrast agents for Magnetic Resonance Imaging (MRI). The design of these techniques requires a detailed knowledge on the magnetic properties of the adopted nanomaterials, like the saturation magnetization Ms, the saturation magnetic field Hs, the coercivity Hc. Standard techniques, like Superconducting Quantum Interference Devices (SQUID) or Vibrating Sample Magnetometer (VSM), to allow the detection of global magnetic properties of nanoparticles populations. Nevertheless, the detection of magnetic properties of single particles is not possible and the evaluation of the particle size dependence is not explicit. Thanks to its nanometric lateral resolution and its capability to detect weak magnetic fields, MFM is a potential powerful tool for the characterization of single nanoparticles dimensions, together with their magnetic properties. However, a methodology to extract quantitative information about the magnetic characteristics of single nanoparticles through MFM has not been individuated, mainly because of the complexity of tip-sample interactions affecting MFM measurements, which produces also non magnetic phenomena (e.g. electrostatic interactions), and the lack of a theoretical model describing the magnetic tip-NP interactions consistently with the detected experimental data. In order to exploit all the potential capabilities of MFM as a magnetic nanometrology tool, the strategy proposed and followed in this project is organized in the following four phases: 1) the theoretical and experimental verification and rationalization of the open issues and the problems limiting the applicability of MFM to the quantitative magnetic characterization of single NPs; in this phase the presence of electrostatic artifacts has been individuated as the main limitation responsible for the inconsistency between experimental data and theoretical models describing the tip-NP interactions. 2) the development of an instrumental apparatus and a measurement procedure to evaluate and eliminate the non-magnetic (electrostatic) contributions quantitatively affecting the MFM data; 3) the individuation of a theoretical model describing the magnetic tip-NP magnetic interaction, coherent with the experimental data, and able to establish a precise relationship between the measured data and the physical parameters desired to be determined (magnetization in the specific case); 4) the development of a procedure to quantitatively measure the magnetic properties, and eventually other parameters, of single nanoparticles by MFM. The results obtained with the procedures and methodologies presented in this thesis demonstrated the possibility of performing quantitative magnetic measurements on single magnetic NPs by MFM technology platform. / L'obiettivo del progetto di dottorato è lo sviluppo di una procedura di misura innovativa e di un metodo di elaborazione dei dati al fine di ottenere informazioni quantitative sui parametri magnetici di singole nanoparticelle magnetiche attraverso l'uso della Microscopia a Forza Magnetica MFM. Le nanoparticelle magnetiche (MNPS), grazie alle loro particolari proprietà magnetiche (singolo dominio, superparamagnetismo, etc.) e le loro dimensioni nanometriche, stanno recentemente trovando grande applicazione in diverse tecniche in campo biomedico, come i sistemi di somministrazione mirata di farmaci, trattamenti di tumori tramite ipertermia magnetica, l'etichettatura cellulare, gli agenti di contrasto per la risonanza magnetica nucleare (MRI). Il design e l’ottimizzazione di queste tecniche richiede una conoscenza dettagliata delle proprietà magnetiche dei nanomateriali adottati, come la magnetizzazione di saturazione Ms, il campo magnetico di saturazione Hs, la coercitività Hc. Le tecniche standard, come i Superconducting Quantum Interference Devices (SQUID) o i magnetometro a vibrazione del campione (VSM), consentono il rilevamento delle proprietà magnetiche globali di numerose popolazioni di nanoparticelle. Ma il rilevamento delle proprietà magnetiche di singole particelle non è possibile e la valutazione di queste proprietà in dipendenza della dimensione delle particelle non è esplicito. Grazie alla risoluzione laterale nanometrica e la sua capacità di rilevare i campi magnetici deboli, la tecnica MFM rappresenta uno strumento ad elevato potenziale per la caratterizzazione delle proprietà magnetiche di singole nanoparticelle, insieme alle loro dimensioni. Tuttavia, un metodo per estrarre informazioni quantitative sulle caratteristiche magnetiche di singole nanoparticelle attraverso la tecnica MFM non è stato individuato, soprattutto a causa della complessità delle interazioni punta-campione che interessano le misurazioni e che possono dare luogo anche a contributi non magnetici (ad esempio interazioni elettrostatiche), e alla mancanza di un modello teorico in grado di descrivere le interazioni magnetiche punta-NP in modo coerente con i dati sperimentali rilevati. Al fine di individuare e superare i limiti della tecnica MFM che ne limitano l’utilizzo come strumento nanometrologico magnetico, la strategia proposta e seguita in questo progetto di dottorato è organizzata nelle seguenti 4 fasi: 1) la verifica teorica e sperimentale e la razionalizzazione delle problematiche che limitano l'applicabilità della tecnica MFM alla caratterizzazione magnetica quantitativa di singole NP; in questa fase la presenza di artefatti elettrostatici è stato individuata come il principale limite responsabile per la riscontrata l'inconsistenza tra i dati sperimentali e modelli teorici che descrivono le interazioni tip-NP. 2) lo sviluppo di un apparato strumentale e una procedura miosura per la valutazione ed eliminazione dei contributi elettrostaticie non magnetici che influiscono quantitativamente sui dati MFM; 3) l'individuazione di un modello teorico che descrive l'interazione magnetica punta-NP coerentemente con i dati sperimentali, e in grado di stabilire una relazione precisa tra i dati misurati e i parametri fisici che si desiderano misurare (magnetizzazione nel caso specifico); 4) lo sviluppo di un procedimento per misurare quantitativamente le proprietà magnetiche, ed eventualmente altri parametri, di singole nanoparticelle tramite MFM. I risultati ottenuti con le procedure e le metodologie presentate in questa tesi hanno dimostrato la possibilità di effettuare misure magnetiche quantitative su singole NP magnetiche facendo uso della piattaforma tecnologica MFM.

Un des plus grands défis de la neuroscience moderne pour parvenir à comprendre et diagnostiquer les maladies du cerveau est de déchiffrer les détails des interactions neuronales dans le cerveau vivant. Pour ce faire, on doit être capable d'observer des populations de cellules vivantes dans leur matrice d'origine avec une bonne résolution spatiale et temporelle. La microscopie à deux photons se prête bien à cet exercice car elle permet d'exciter des fluorophores à de grandes profondeurs dans les tissus biologiques et elle offre une résolution spatiale de l'ordre du micron. Malheureusement, la très bonne résolution tridimensionnelle diminue la résolution temporelle, car l'effet de sectionnement optique causé par la faible profondeur de champ du microscope nous oblige à balayer les échantillons épais une multitude de fois avant de pouvoir compléter l'acquisition d'un grand volume. Dans ce projet de doctorat, nous avons conçu, construit et caractérisé un microscope à deux photons avec une profondeur de champ étendue afin de faciliter l'imagerie fonctionnelle de neurones dans un échantillon épais. Pour augmenter la profondeur de champ du microscope à deux photons, nous avons modifié le faisceau laser entrant dans le système optique afin de générer une aiguille de lumière, orientée axialement, dans l'échantillon au lieu d'un point. Nous modifions le faisceau laser avec un axicon, une lentille en forme de cône qui transforme le faisceau gaussien en un faisceau quasi non-diffractant, de type Bessel-Gauss. Le faisceau d'excitation conserve donc la même résolution transverse à différentes profondeurs dans l'échantillon, éliminant le besoin de balayer l'échantillon à répétition afin de sonder un volume complet. Dans cette thèse, nous démontrons que le microscope à grande profondeur de champ fonctionne effectivement tel que nous l'avons conçu et nous l'utilisons pour faire de l'imagerie calcique dans un réseau tridimensionnel de neurones vivants. Nous présentons aussi les différents avantages de notre système par rapport à la microscopie à deux photons conventionnelle. / One of the greatest challenges of modern neuroscience that will lead to a better understanding and earlier diagnostics of brain sickness is to decipher the details of neuronal interactions in the living brain. To achieve this goal, we must be capable of observing populations of living cells in their original matrix with a good resolution, both spatial and temporal. Two-photon microscopy offers the right tools for this since it presents with a spatial resolution in the order of the micron. Unfortunately, this very good three-dimensional resolution lowers the temporal resolution because the optical sectioning caused by the microscope's small depth of field forces us to scan thick samples repeatedly when acquiring data from a large volume. In this doctoral project, we have designed, built and characterized a two-photon microscope with an extended depth of field with the goal of simplifying the functional imaging of neurons in thick samples. To increase the laser scanning microscope's depth of field, we shaped the laser beam entering the optical system in such a way that a needle of light is generated inside the sample instead of a spot. We modify the laser beam with an axicon, a cone-shaped lens that transforms a gaussian beam into a quasi non-diffractive beam called Bessel-Gauss beam. The excitation beam therefore maintains the same transverse resolution at different depths inside the sample, eliminating the need for many scans in order to probe the entire volume of interest. In this thesis, we demonstrate that the extended depth of field microscope effectively works as we designed it, and we use it to image calcium dynamics in a three-dimensional network of live neurons. We also present the different advantages of our system in comparison with standard two-photon microscopy.