Les phospholipides sont des constituants importants de la membrane cellulaire. Ce sont des lipides qui regroupent deux acides gras, du glycérol et du phosphate, liés de façon covalente. Ce projet de recherche vise à synthétiser de nouveaux composés phospholipides avec deux appendices greffés sur la tête phosphate : un groupe ferrocène (sonde électrochimique) ainsi qu'un groupe dansyle (unité fluorescente). Ces biomolécules modifiées pourraient être incorporées dans des liposomes et des membranes biologiques, permettant d'étudier ces superstructures par microscopie de fluorescence et électrochimique, cette dernière utilisant des ultra-microélectrodes. Le microscope pourrait servir à la détection des cellules particulières sécrétant des espèces électroactives à un potentiel donné. Donc, ces molécules ont un intérêt tant en électrochimie, en biochimie qu'en chimie organique. Le défi dans cette recherche est qu'il n'y a aucun phospholipide dans la littérature comportant à la fois les deux fonctions de visualisation : fluorescence et potentiel redox. La première étape du projet, qui consiste en la production du composé 1,2-dioléoylglycérol, a bien été réalisée en trois étapes seulement et avec un rendement global de 34 % via une mono-protection du glycérol. Le choix de la sonde fluorescente a été porté sur le groupe dansyle pour des raisons de stabilité, de facilité de couplage et de disponibilité. Le chlorure de dansyle a réagi avec l'éthanolamine pour fabriquer l'alcool à coupler, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol, le phospholipide marqué avec le dansyle a été préparé avec succès avec un bon rendement de 85 %. Pour le dernier groupe, soit la sonde électrochimique de cette synthèse, le ferrocène a été choisi selon les prérogatives des collègues électrochimistes, pour son potentiel redox compatible avec les milieux biologiques. Le composé ferrocèneéthanol, préparé par le groupe de Prof. Mauzeroll, a été utilisé comme alcool de couplage. Ensuite, en vue d'obtenir un phospholipide fluorescent et électroactif, deux types de structures ont été visées. Le premier type est un phosphate trisubstitué combinant le 1,2-dioléoylglycérol et les deux alcools sondes, soit le N-dansyl-2-aminoéthanol et le ferrocèneéthanol. Malheureusement cette synthèse, tentée via divers protocoles connus, n'a pas fonctionné, particulièrement lors du couplage du partenaire ferrocène. Un deuxième type de composé comprend un phosphate dialkylé cette fois, combinant toujours le 1,2-dioléoylglycérol avec un autre alcool comportant à la fois le groupe dansyle et le ferrocène, en l'occurrence le (N-dansyl, N-ferrocényléthyl)-2-aminoéthanol. Malheureusement encore, cet alcool bifonctionnalisé n'a pas pu être obtenu par des méthodes usuelles. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Phospholipides, sonde électrochimique, unité fluorescente, ultra-microélectrodes, 1,2-dioléoylglycérol, ferrocèneéthanol, dansyle.

La microscopie par fluorescence de cellules vivantes produit de grandes quantités de données. Ces données sont composées d’une grande diversité au niveau de la forme des objets d’intérêts et possèdent un ratio signaux/bruit très bas. Pour concevoir un pipeline d’algorithmes efficaces en traitement d’image de microscopie par fluorescence, il est important d’avoir une segmentation robuste et fiable étant donné que celle-ci constitue l’étape initiale du traitement d’image. Dans ce mémoire, je présente MinSeg, un algorithme de segmentation d’image de microscopie par fluorescence qui fait peu d’assomptions sur l’image et utilise des propriétés statistiques pour distinguer le signal par rapport au bruit. MinSeg ne fait pas d’assomption sur la taille ou la forme des objets contenus dans l’image. Par ce fait, il est donc applicable sur une grande variété d’images. Je présente aussi une suite d’algorithmes pour la quantification de petits complexes dans des expériences de microscopie par fluorescence de molécules simples utilisant l’algorithme de segmentation MinSeg. Cette suite d’algorithmes a été utilisée pour la quantification d’une protéine nommée CENP-A qui est une variante de l’histone H3. Par cette technique, nous avons trouvé que CENP-A est principalement présente sous forme de dimère. / Live-cell fluorescence microscopy produces high amounts of data with a high variability in shapes at low signal-to-noise ratio. An efficient design of image analysis pipelines requires a reliable and robust initial segmentation step that needs little parameter fine-tuning. Here, I present a segmentation algorithm called MinSeg for fluorescence image data that relies on minimal assumptions about the image, and uses statistical considerations to distinguish signal from background. More importantly, the algorithm does not make assumptions about feature size or shape, and is thus universally applicable. I also present a pipeline for the quantification of small complexes with single-molecule fluorescence microscopy using this segmentation algorithm as the first step of the workflow. This pipeline was used for the quantification of a small histone H3 variant protein called CENP-A. We found that the CENP-A nucleosomes are dimers.

Nous nous intéressons à la détection et au suivi d'objets biologiques divers (cellules, noyaux, etc.) dans des images et séquences tri-dimensionnelles acquises en microscopie par fluorescence. L'observation de phénomènes biologiques in situ étant de plus en plus cruciale pour les experts, il est nécessaire, en plus de l'analyse quantitative, d'effectuer un rendu volumique 3D de la scène et des objets qui y évoluent. De plus, l'automatisation des techniques d'acquisition d'images requiert un haut niveau de reproductibilité des algorithmes et induit souvent des contraintes de temps de calcul que nous nous efforçons de prendre en compte.<br /><br />Les modèles déformables, également connus sous le nom de contours actifs, font actuellement partie des méthodes de pointe en analyse d'images pour la segmentation et le suivi d'objets grâce à leur robustesse, leur flexibilité et leur représentation à haut niveau sémantique des entités recherchées. Afin de les adapter à notre problématique, nous devons faire face à diverses difficultés. Tout d'abord, les méthodes existantes se réfèrent souvent aux variations locales d'intensité (ou gradients) de l'image pour détecter le contour des objets recherchés. Cette approche est inefficace en microscopie tridimensionnelle par fluorescence, où les gradients sont très peu prononcés selon l'axe de profondeur de l'image. Ensuite, nous devons gérer le suivi d'objets multiples susceptibles d'entrer en contact en évitant leur confusion. Enfin, nous devons mettre en place un système permettant de visualiser efficacement les contours durant leur déformation sans altérer les temps de calcul.<br /><br />Dans la première partie de ce travail, nous pallions à ces problèmes en proposant un modèle de segmentation et de suivi multi-objets basé sur le formalisme des lignes de niveaux (ou level sets) et exploitant la fonctionnelle de Mumford et Shah. La méthode obtenue donne des résultats quantitatifs satisfaisants, mais ne se prête pas efficacement au rendu 3D de la scène, pour lequel nous sommes tributaires d'algorithmes dédiés à la reconstruction 3D (e.g. la méthode des "Marching Cubes"), souvent coûteux en mémoire et en temps de calcul. De plus, ces algorithmes peuvent induire des erreurs d'approximation et ainsi entraîner une mauvaise interprétation des résultats.<br /><br />Dans la seconde partie, nous proposons une variation de la méthode précédente en remplaçant le formalisme des lignes de niveaux par celui des maillages triangulaires, très populaire dans le domaine de la conception assistée par ordinateur (CAO) pour leur rendu 3D rapide et précis. Cette nouvelle approche produit des résultats quantitatifs équivalents, en revanche le formalisme des maillages permet d'une part de réduire considérablement la complexité du problème et autorise d'autre part à effectuer un rendu 3D précis de la scène parallèlement au processus de segmentation, réduisant d'autant plus les temps de calculs.<br /><br />Les performances des deux méthodes proposées sont d'abord évaluées puis comparées sur un jeu de données simulées reproduisant le mieux possible les caractéristiques des images réelles. Ensuite, nous nous intéressons plus particulièrement à l'évaluation de la méthode par maillages sur des données réelles, en évaluant la robustesse et la stabilité de quelques descripteurs de forme simples sur des expériences d'imagerie haut-débit. Enfin, nous présentons des applications concrètes de la méthode à des problématiques biologiques réelles, réalisées en collaboration avec d'autres équipes de l'Institut Pasteur de Corée.

Cette thèse porte sur l'utilisation du BLASSO, un problème d'optimisation convexe en dimension infinie généralisant le LASSO aux mesures, pour la super-résolution de sources ponctuelles. Nous montrons d'abord que la stabilité du support des solutions, pour N sources se regroupant, est contrôlée par un objet appelé pré-certificat aux 2N-1 dérivées nulles. Quand ce pré-certificat est non dégénéré, dans un régime de petit bruit dont la taille est contrôlée par la distance minimale séparant les sources, le BLASSO reconstruit exactement le support de la mesure initiale. Nous proposons ensuite l'algorithme Sliding Frank-Wolfe, une variante de l'algorithme de Frank-Wolfe avec déplacement continu des amplitudes et des positions, qui résout le BLASSO. Sous de faibles hypothèses, cet algorithme converge en un nombre fini d'itérations. Nous utilisons cet algorithme pour un problème 3D de microscopie par fluorescence en comparant trois modèles construits à partir des techniques PALM/STORM. / This thesis studies the noisy sparse spikes super-resolution problem for positive measures using the BLASSO, an infinite dimensional convex optimization problem generalizing the LASSO to measures. First, we show that the support stability of the BLASSO for N clustered spikes is governed by an object called the (2N-1)-vanishing derivatives pre-certificate. When it is non-degenerate, solving the BLASSO leads to exact support recovery of the initial measure, in a low noise regime whose size is controlled by the minimal separation distance of the spikes. In a second part, we propose the Sliding Frank-Wolfe algorithm, based on the Frank-Wolfe algorithm with an added step moving continuously the amplitudes and positions of the spikes, that solves the BLASSO. We show that, under mild assumptions, it converges in a finite number of iterations. We apply this algorithm to the 3D fluorescent microscopy problem by comparing three models based on the PALM/STORM technics.