O gene nuclear GAL1 de Saccharomyces cerevisiae codifica uma galactoquinase induzida por galactose e reprimida por glicose. Três evidências indicam que a transcrição de GAL1 é dependente da atividade mitocondrial. Linhagens petite, com deleção no DNA da organela (ρ-) ou rompimento em gene nuclear, que codifica a farnesil transferase mitocondrial, são incapazes de induzir GAL1. Os inibidores de respiração antimicina-A e azoteto de sódio (NaN3), que atuam, respectivamente, nos complexos III e IV da cadeia de transporte de elétrons, impedem a indução de GAL1. Em células crescidas em glicose ou glicerol, o oligômero formado pela proteína URF13, na presença de metomil, produz um poro na membrana mitocondrial interna que reduz o potencial de membrana ΔΨ e os níveis do mRNA de GAL1. A regulação dependente da atividade da mitocôndria ocorre a nível transcricional, pois o gene repórter GUS, sob controle de GAL1, não é induzido na presença de galactose, após tratamento prévio das células com antimicina-A ou NaN3. Mig1p é um repressor que atua diretamente no promotor de GAL1 e inibe a transcrição da galactoquinase. Os resultados obtidos indicam que Mig1p media a repressão da indução de GAL1, na presença do inibidor da cadeia respiratória antimicina-A. / The nuclear gene GAL1 of Saccharomyces cerevisiae encodes a galactokinase induced by galactose and repressed by glucose. Three lines of evidence indicate that expression of GAL1 transcript is dependent on mitochondrial activity. Petite strains in which mitochondrial DNA was partialy deleted (ρ-) or cells containing a disruption in the nuclear gene COX10, which encodes the mitochondrial farnesil transferase, are unable to induce GAL1. Respiratory inhibitors such as antimycin-A or sodium azide (NaN3), that inhibit complexes III and IV of the electron transport chain, respectively, affect GAL1 induction. Functional expression of the maize protein URF13, which is translocated to the mitochondrial inner membrane, forming a pore that leads to a reduction of the mitochondrial membrane potential ΔΨ and reduces the leveis of GAL1 transcripts. Experiments using a heterologous gene fusion showed that the inhibition of GAL1 expresion, by treatment of cells with antimycin-A or NaN3, controls the expression of GAL1 at the transcrptional level. Mig1p is a repressor that binds GAL1 promoter. Our results indicate that Mig1p mediates the represion of GAL1 induction, observed in the presence of the mitochondrial inhibitor antimycin-A.

A fibrose hepática é uma patologia que acompanha outras doenças crônicas do fígado como a cirrose e o hepatocarcinoma. As células estreladas hepáticas (HSC, do inglês hepatic stellate cells) compõem uma população celular heterogênea que se caracteriza por transitar entre dois fenótipos. As células com fenótipo quiescente possuem a capacidade de armazenar vitamina A em gotas lipídicas. Os insultos ao fígado desencadeiam uma resposta inflamatória que gera estímulos parácrinos e autócrinos mediados por citocinas e espécies reativas. Neste contexto, as HSC assumem um fenótipo ativado fibrogênico e tornam-se responsáveis pela cicatrização hepática. Danos crônicos ao fígado levam a uma deposição de matriz extracelular exagerada que configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas. Inúmeros efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao RSV por causa do seu potencial antioxidante, antiinflamatório e pró-apoptótico. Estudos anteriores mostraram que tratamento da GRX, uma linhagem murina de HSC ativadas, com concentrações de RSV próximas as biodisponíveis (0,1 a 1 μM) resultou em parada do ciclo na fase S com consequente inibição de proliferação celular, um efeito associado à citotoxicidade e que pode favorecer a resolução da fibrose hepática. Neste estudo, por técnicas espectrofotométricas, foi demonstrado que tratamento da GRX por 24 horas com concentrações entre 0,1 a 50 μM de RSV promoveu um efeito pró-oxidante que causa uma citotoxicidade dependente da dose, bastante aumentada no grupo tratado com a concentração mais alta. Os efeitos citotóxicos atenuados encontrados nas células tratadas por 120 horas sugerem que a GRX pode se tornar resistente a estes efeitos. O potencial pró-oxidante do RSV foi o ponto de partida para investigar a possibilidade de que esta fitoalexina provocasse uma alteração no metabolismo mitocondrial da GRX. Para isso, os efeitos do RSV (1 a 50 μM) na função mitocondrial, na indução de morte mediada por estas organelas e na autofagia/mitofagia foram investigados por técnicas de espectrofotometria, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo, de microscopia confocal e de microscopia eletrônica de transmissão em GRX tratadas por 24 e 120 horas. Foi demonstrado que todas as concentrações de RSV promovem apoptose por meio da ativação de caspases, alteram a dinâmica/função mitocondrial e induzem o aumento de autofagia/mitofagia na GRX. No entanto, o RSV provocou biogênese de mitocôndrias nos grupos tratados com 1 e 10 μM, enquanto que o tratamento com 50 μM causou dano celular evidente na GRX, sem induzir biogênese de mitocôndrias. Desta forma, é possível que a citotoxicidade “dose-dependente” do RSV, que causa a morte celular e dano oxidativo em 24 horas de tratamento, esteja relacionada com o desequilíbrio entre a indução concomitante de apoptose mediada por dano mitocondrial, autofagia/mitofagia e biogênese de mitocôndrias. Por fim, foi investigada a liberação de TNF-α, Interleucina-6 e Interleucina-10 pela GRX tratada por 24 e 120 horas com RSV (0,1 a 50 μM), considerando o papel antiinflamatório do RSV e o papel das HSC ativadas na sinalização autócrina que contribui para a modulação fenotípica destas células. Foi demonstrado que o tratamento da GRX com RSV por 24 e 120 horas induziu a redução da liberação de Interleucina-6; enquanto que a liberação de TNF-α e Interleucina-10 foi aumentada. Estes resultados confirmam um efeito antiinflamatório do RSV que deve contribuir na prevenção da ativação ou da perpetuação do estado ativado das HSC por meio de sinalização autócrina. Ainda que a concentração do RSV seja importante para efetivamente induzir a morte das HSC ativadas, o tratamento com esta fitoalexina pode ser promissor para a resolução da fibrose hepática por diminuir a população de células ativadas e, possivelmente, prevenir a perpetuação do estado fenotípico ativado. Estudos avaliando indicadores de quiescência em células tratadas são ainda necessários para desvendar completamente os efeitos do RSV quanto às possibilidades de inibição da perpetuação ou reversão fenotípica das HSC ativadas. / Liver fibrosis is a disease that accompanies other hepatic chronic diseases such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatic stellate cells (HSC) are a heterogeneous cell population characterized by transiting between two phenotypes. Cells with a quiescent phenotype are able to store vitamin A into lipid droplets. Damage to the liver trigger an inflammatory response that generates paracrine and autocrine stimulation mediated by cytokines and reactive species. In this context, HSC assume an activated and fibrogenic phenotype responsive for hepatic wound-healing. Chronic insults to the liver lead to an excessive deposition of extracellular matrix that configures the pathological state of fibrosis. Resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic potential. Previous studies showed that treatment with bioavailable concentrations of RSV (0.1 to 1 μM) promoted an arrest cycle at the S phase in GRX, a murine activated HSC model, leading to cell proliferation inhibition, a cytotoxic effect that contributes to the liver fibrosis resolution. In this study, it was shown by spectrophotometric techniques that GRX treatment for 24 hours at concentrations between 0.1 to 50 μM of RSV promoted a fairly clear pro-oxidant effect that causes a dose-dependent cytotoxicity that was higher in the group treated with 50 μM. The attenuated cytotoxicity found after 120 hours of GRX treatment suggest that these cells became resistant to this effect. The pro-oxidant potential of RSV was the starting point for investigating the possibility that this phytoalexin would cause a change in the GRX mitochondrial metabolism. Thus, the effects of RSV (1 to 50 μM) on altering the mitochondrial function, on inducing mitochondrial-mediated cell death, and autophagy/mitofagia were investigated in GRX treated for 24 and 120 hours by spectrophotometric techniques, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal microscopy, and transmission electron microscopy. All the RSV concentrations promote cell apoptosis through caspases activation, alter the mitochondrial dynamics and function, and induce an increase of autophagy/mitofagia. Curiously, only 1 and 10 μM of RSV induced mitochondrial biogenesis in GRX, while the highest concentration caused an evident cell damage without inducing mitochondrial biogenesis. Thus, it is possible that the "dose-dependent" cytotoxicity of RSV, which causes cell death and oxidative damage in 24 hours of treatment, is related to an imbalance between the concomitant induction of mitochondrial-mediated apoptosis, autophagy/mitofagia, and mitochondrial biogenesis. Finally, it was investigated the release of TNF-α, Interleukin-6 and Interleukin-10 by GRX treated for 24 and 120 hours with RSV (0.1 to 50 μM), considering the anti-inflammatory role of RSV and the autocrine signalling role of HSC that contributes to the perpetuation of its activated phenotype. It was demonstrated that GRX treatment with RSV for 24 and 120 hours reduced the release of Interleukin-6 in the culture medium; whereas the release of TNF-α and Interleukin-10 was increased. These results confirm the anti-inflammatory properties of RSV and may contribute to the prevention of HSC activation through autocrine signalling. Although RSV concentration is important to effectively induce activated HSC death, cells treatment with this phytoalexin may be promising for liver fibrosis resolution through decreasing the population of activated cells or through preventing the perpetuation of activated state of HSC. Future studies evaluating the quiescence indicators of GRX under RSV treatment are still needed to fully unravel the effects of this phytoalexin on inhibiting the perpetuation of activated HSC or reversing its activated phenotype.

A obesidade está relacionada com uma grande variedade de disfunções, tais como as dislipidemias, resistência à insulina e diabetes tipo II. Estas patologias estão relacionadas com alterações da fisiologia mitocondrial. As mitocôndrias são o principal sítio do metabolismo oxidativo e são importantes fontes de espécies reativas de oxigênio. Alberici et al. (2006) mostraram que a atividade de canais de potássio sensíveis a ATP mitocondriais (mitoKATP), via dissipativa branda, estava aumentada em fígados de animais hipertrigliceridêmicos transgênicos. Este dado sugere um papel adaptativo importante para o mitoKATP como regulador do metabolismo e da massa corpórea. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o papel deste canal em fígados de camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica, obtida por meio de suplementação de óleo de soja à única fonte de água dos animais. Foram estabelecidas correlações entre a atividade do canal e parâmetros da fisiologia mitocondrial ou parâmetros sorológicos clássicos como colesterolemia e trigliceridemia. Sendo realizados experimentos de espalhamento de luz, quantificação de peróxido de hidrogênio, potencial de membrana e consumo de oxigênio em mitocôndrias. Nossos resultados mostram aumento de massa corpórea sem dislipidemias e aumento da atividade do mitoKATP, dependente do tempo da suplementação, diretamente correlacionada com a colesterolemia. Nossos resultados apontam aumento da geração de EROs e diminuição da eficiência de conversão energética no grupo suplementado. Como conclusão: manipulações de dieta são eficazes para a indução da atividade do mitoKATP, sendo este um novo e interessante sítio de regulação do metabolismo oxidativo e da massa corpórea. / Obesity is associated with multiple dysfunctions including dyslipidemia, insulin resistance and diabetes. These malfunctions are associated with modifications in mitochondrial physiology. Furthermore, mitochondria are the most important site of energy metabolism and reactive oxygen species production. Alberici et al. (2006) demonstrated that hypertriglyceridemic transgenic mice display increased expression ad activity of mitochondrial ATP sensitive potassium channels (mitoKATP), a mild uncoupling pathway, in liver. This suggests that mitoKATP is an important adaptation to regulate body mass and metabolism. The aim of this work is to investigate the role of mitoKATP in a high fat diet induced by soy oil supplementation, correlating changes in channel activity with metabolic and mitochondrial parameters. Mitochondria were isolated from mouse livers and serological parameters were measured for each animal. Light scattering (to estimate mitoKATP activity), hydrogen peroxide generation, membrane potentials and oxygen consumption were measured in the mitochondrial suspensions. Our results indicate an increase in body mass, without dyslipidemia; and increases in mitoKATP activity, in time-dependent manner, directly correlated to cholesterol levels. In addition, we found increases in ROS generation and decreased capacity of energy conversion (ADP/O) in the high fat diet group. In conclusion, our results indicate that the activity of mitoKATP could be induced by high fat diets and that this is an novel site for metabolic and body mass control.

Muitos estudos demonstram que a abertura de canais de K+ mitocondriais sensíveis à ATP (mitoKATP) previnem contra danos promovidos por isquemia/reperfusão em coração. Em geral, esta proteção envolve mudanças no estado redox mitocondrial. Em cérebro, sabe-se que agonistas farmacológicos de mitoKATP também protegem em modelo de isquemia/reperfusão. Entretanto, os mecanismos envolvidos na prevenção de danos em cérebro ainda não estão claros. O objetivo principal deste trabalho é compreender os efeitos de canais de K+ mitocondriais ATP-sensíveis em tecido cerebral e os mecanismos pelos quais a sua ativação pode proteger contra danos promovidos por excitotoxicidade, uma das principais conseqüências de um evento isquêmico em cérebro. Neste contexto, demonstramos a proteção pelo mitoKATP em modelo de excitotoxicidade induzida pela ativação direta de receptores NMDA, utilizando cultura de células granulosas de cerebelo. Paralelamente a essa proteção, verificamos que a ativação de mitoKATP reduz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Em mitocôndrias isoladas, observamos que ROS geradas pela mitocôndria ativam mitoKATP cerebral, resultando em um aumento da captação de K+ para a matriz, medida através da técnica de inchamento mitocondrial. Em condições de baixa geração de ROS, a adição de H2O2 exógeno ativa o inchamento mitocondrial em resposta à entrada de K+ de modo prevenido por catalase, assim, confirmando que a atividade desses canais é redox-sensível. A ativação de mitoKATP por agonistas farmacológicos, como diazóxido, também é maior na presença de alta geração de ROS, conforme indicado por uma leve diminuição no potencial de membrana mitocondrial. Interessantemente, a adição de um redutor tiólico, 2-mercaptopropionilglicina (MPG) previne a ativação de mitoKATP. A ativação de mitoKATP não alterou a capacidade de captar Ca2+ pela mitocôndria, demonstrando que este não é o mecanismo pelo qual esses canais previnem morte celular excitotóxica. Não foram observados efeitos desses canais em modelo de excitotoxicidade in vivo e em modelo de doença neurodegenerativa, acidose metilmalônica. Juntos, nossos resultados demonstram que mitoKATP cerebrais agem como sensores de ROS mitocondrial, que quando ativados reduzem a liberação de ROS por um leve desacoplamento, prevenindo morte neuronal por excitotoxicidade NMDA-induzida / Several studies have shown that mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening prevents ischemia/reperfusion injuries in heart, in a manner involving changes in redox state. In brain, mitoKATP agonists also protect against ischemia/reperfusion. However, the exactly mechanism that mitoKATP protects the brain is still unclear. The purpose of this work is to understand the effects of mitochondrial ATP-sensitive K+ channels in brain and how this channel can protect against excitotoxic cell death, the main consequence of a cerebral ischemia. In this context, we demonstrate that mitoKATP protects against excitotoxicity promoted by NMDA receptor activation in cultured cerebellar granule cells. In paralell, we verified that mitoKATP activation also decreases reactive oxygen species (ROS). In isolated mitochondria, we observed that mitochondrially-generated ROS can activate brain mitoKATP, resulting in enhanced K+ uptake into the matrix, measured as swelling of the organelle. Under conditions in which mitochondrial ROS release is low, exogenous H2O2 activated swelling secondary to K+ entrance, in a manner prevented by catalase, confirming that the activity of this channel is redox-sensitive. Activation of mitoKATP channels by the pharmacological agonist diazoxide was also improved when endogenous mitochondrial ROS release was enhanced, as indicated by mild decreases in mitochondrial membrane potentials. Interessantly, mitoKATP activation was preveted by the thiol reductant 2-mercaptopropionylglycine (MPG). Mitochondrial Ca2+ uptake was not modified by opening mitoKATP, suggesting that this is not the mechanism through which this channel prevents excitotoxic cell death. In an in vivo excitotoxicity model and also neurodegenerative disease model, methylmalonic acidemia, the effects of mitoKATP agonists were not observed. Together, our results demonstrate that brain mitoKATP acts as a mitochondrial ROS sensor, which, when activated, prevents ROS release by mildly uncoupling respiration from oxidative phosphorylation, decreasing excitotoxic cell death

Os esteroides anabolizantes androgênicos (EAA) como o decanoato de nandrolona (ND) são hormônios sintéticos derivados da testosterona. Sabe-se que um dos efeitos mais marcantes da administração abusiva destes esteroides é o aumento do comportamento agressivo. Evidências indicam que altas doses de EAA alteram a morfologia e causam hiperativação de sinapses glutamatérgicas, o que se correlaciona com um fenótipo agressivo exacerbado. Fisiologicamente o glutamato é considerado o principal neurotransmissor excitatório no cérebro de mamíferos, entretanto, em níveis elevados, pode causar hiperexcitabilidade neuronal mediada pelos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo N-metil-d-aspartato (NMDAr) e, consequentemente alterações no metabolismo mitocondrial. A terminação da sinalização excitatória glutamatérgica é realizada majoritariamente por transportadores existentes em astrócitos. Neste sentido, o transportador astrocitário de glutamato GLT-1 é responsável por mais de 90% da remoção do glutamato da fenda sináptica, contribuindo significativamente, para a manutenção da homeostasis da sinalizacão glutamatérgica. A administração do antibiótico β-lactâmico ceftriaxona (CEF) aumenta a expressão de GLT-1 e diminui a hiperexcitabilidade glutamatérgica, o que poderia potencialmente contrapor mecanismos cerebrais associados ao aumento do fenótipo agressivo induzidos pelo decanoato de nandrolona (ND). Entretanto, estas possíveis interacões moleculares e comportamentais ainda não foram exploradas. Assim, o objetivo primário deste trabalho foi investigar se o aumento da expressão do transportador astrocitário GLT-1 modula mecanismos glutamatérgicos envolvidos na agressividade induzida pelo ND, e a atividade mitocondrial. Para tanto, camundongos CF-1 machos de 60 dias de idade foram divididos em 4 grupos: veículo oleoso (VEH), nandrolona (ND), ceftriaxona (CEF) e nandrolona+ceftriaxona (ND/CEF). A nandrolona foi injetada por via subcutânea (15mg/Kg) por 19 dias. A ceftriaxona (200mg/Kg) ou solução salina foram administradas intraperitonealmente por 5 dias. Após a última injeção foi avaliada a latência para o primeiro ataque e o número de ataques no teste do intruso. Os animais foram sacrificados logo após o teste, e homogeneizados de córtex foram utilizados para imunoquantificação do GLT-1 e da fosforilação da subunidade pNR2Bser1232 do NMDAr. A atividade mitocondrial foi avaliada em sinaptossoma de cérebro total. Os níveis de glutamato foram medidos no líquido cefalorraquidiano. Comparado com o veículo, o tratamento com ND diminuiu significativamente a expressão do GLT-1, aumentou os níveis de glutamato e a expressão da subnidade pNR2Bser1232 o que foi mecanisticamente associado ao aumento do fenótipo agressivo; diminuicão da latência e aumento do número de ataques ao intruso. Ainda, a ND diminuiu o controle respiratório mitocondrial. A administração de CEF aumentou significativamente a expressão do GLT-1 e diminuiu os níveis de glutamato em relação ao grupo ND, enquanto que os níveis de pNR2Bser1232 e a agressividade foram similar ao grupo controle. No grupo ND/CEF o immunoconteúdo de GLT-1 e de pNR2Bser1232, os níveis de glutamato e o fenótipo agressivo, foram significativamente menores que no grupo ND, e similares ao grupo controle. Ainda, a CEF foi capaz de atenuar o prejuízo no controle respiratório mitocondrial causado pela ND. Nossos resultados demonstram que a interação bidirecional entre o transportador astrocitário GLT-1 e a subunidade pNR2Bser1232 neuronal mediada pelo glutamato, exercem um impacto regulatório no fenótipo agressivo induzido pela ND, e no controle respiratório mitocondrial. Desta maneira, este modelo reforça a importância da homeostasia funcional da sinapse tripartide glutamatérgica no fenótipo agressivo. / Anabolic androgenic steroids (AAS) such as nandrolone decanoate (ND) are synthetic hormones derived from testosterone. It is known that one of the most important adverse effects of abusive administration of these steroids is the increase in aggressive behavior. Evidence indicates that high doses of AAS alter morphology and cause hyperactivation of glutamatergic synapses which correlates with an aggressive exacerbated phenotype. Physiologically, glutamate is considered the main excitatory neurotransmitter in the mammalian brain. At high glutamate levels, occurs neuronal hyperexcitability mainly trhough the ionotropic N-methyl-d-aspartate (NMDAr) type of glutamatergic receptors and, consequently, changes in mitochondrial metabolism. Existing transporters in astrocytes predominantly perform the termination of glutamatergic excitatory signaling. In this sense, the GLT-1 glutamate astrocytic transporter is responsible for more than 90% of glutamate removal from the synaptic cleft, contributing significantly to the maintenance of glutamatergic signaling homeostasis. Administration of the β-lactam antibiotic ceftriaxone (CEF) increases GLT-1 expression and decreases glutamatergic hyperexcitability, which could potentially counteract brain mechanisms associated to increased aggressive phenotype mediated by nandrolone decanoate (ND). However, a possible molecular and behavioral interaction has not yet been explored in context. Thus, the primary objective of this work was to investigate whether increased expression of the GLT-1 astrocyte transporter modulates the glutamatergic mechanisms involved in ND-induced aggressive phenotype, and mitochondrial activity. Sixty-day-old male CF-1 mice were divided into 4 groups: oil vehicle (VEH), nandrolone (ND), ceftriaxone (CEF) and nandrolone + ceftriaxone (ND / CEF). Nandrolone was injected subcutaneously (15mg / kg) for 19 days. Ceftriaxone (200mg / kg) or saline solution were administered intraperitoneally for 5 days. After the last injection, the latency for the first attack and the number of attacks on the intruder test were evaluated. The animals were sacrificed after the test, and homogeinized cortex were used for immunoquantification of GLT-1 and phosphorylation of the NMDAr pNR2Bser1232 subunit. Mitochondrial activity was evaluated in total brain sinaptossomes. Glutamate levels were measured in the cerebrospinal fluid. Compared to the vehicle group, treatment with ND significantly decreased the expression of GLT-1, increased glutamate levels and expression of the pNR2Bser1232 which was mechanistically associated with an increase in the aggressive phenotype; decrease in the latency and increase in the number of attacks. Also, ND decreased mitochondrial respiratory control. Administration of CEF significantly increased GLT-1 expression and decreased glutamate levels relative to the ND group, whereas pNR2Bser1232 levels and aggressive phenotype were similar to the control group. In the ND / CEF group the expression of GLT-1 and pNR2Bser1232, glutamate levels and aggressive phenotype were significantly lower than in the ND group, and similar to the control group. Furthermore, CEF was able to attenuate the alteration in the mitochondrial respiratory control caused by ND. Our results demonstrated that the levels of glutamate astrocytic transporter GLT-1 and pNR2Bser1232 are important mechanism behind the increased aggressive phenotype induced by ND, and decreased mitochondrial respiratory control. Also, this model reinforces the importance of glutamate levels and astrocytic molecular targets in the regulation of the aggressive phenotype.

Os esteroides anabolizantes androgênicos (EAA) como o decanoato de nandrolona (ND) são hormônios sintéticos derivados da testosterona. Sabe-se que um dos efeitos mais marcantes da administração abusiva destes esteroides é o aumento do comportamento agressivo. Evidências indicam que altas doses de EAA alteram a morfologia e causam hiperativação de sinapses glutamatérgicas, o que se correlaciona com um fenótipo agressivo exacerbado. Fisiologicamente o glutamato é considerado o principal neurotransmissor excitatório no cérebro de mamíferos, entretanto, em níveis elevados, pode causar hiperexcitabilidade neuronal mediada pelos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo N-metil-d-aspartato (NMDAr) e, consequentemente alterações no metabolismo mitocondrial. A terminação da sinalização excitatória glutamatérgica é realizada majoritariamente por transportadores existentes em astrócitos. Neste sentido, o transportador astrocitário de glutamato GLT-1 é responsável por mais de 90% da remoção do glutamato da fenda sináptica, contribuindo significativamente, para a manutenção da homeostasis da sinalizacão glutamatérgica. A administração do antibiótico β-lactâmico ceftriaxona (CEF) aumenta a expressão de GLT-1 e diminui a hiperexcitabilidade glutamatérgica, o que poderia potencialmente contrapor mecanismos cerebrais associados ao aumento do fenótipo agressivo induzidos pelo decanoato de nandrolona (ND). Entretanto, estas possíveis interacões moleculares e comportamentais ainda não foram exploradas. Assim, o objetivo primário deste trabalho foi investigar se o aumento da expressão do transportador astrocitário GLT-1 modula mecanismos glutamatérgicos envolvidos na agressividade induzida pelo ND, e a atividade mitocondrial. Para tanto, camundongos CF-1 machos de 60 dias de idade foram divididos em 4 grupos: veículo oleoso (VEH), nandrolona (ND), ceftriaxona (CEF) e nandrolona+ceftriaxona (ND/CEF). A nandrolona foi injetada por via subcutânea (15mg/Kg) por 19 dias. A ceftriaxona (200mg/Kg) ou solução salina foram administradas intraperitonealmente por 5 dias. Após a última injeção foi avaliada a latência para o primeiro ataque e o número de ataques no teste do intruso. Os animais foram sacrificados logo após o teste, e homogeneizados de córtex foram utilizados para imunoquantificação do GLT-1 e da fosforilação da subunidade pNR2Bser1232 do NMDAr. A atividade mitocondrial foi avaliada em sinaptossoma de cérebro total. Os níveis de glutamato foram medidos no líquido cefalorraquidiano. Comparado com o veículo, o tratamento com ND diminuiu significativamente a expressão do GLT-1, aumentou os níveis de glutamato e a expressão da subnidade pNR2Bser1232 o que foi mecanisticamente associado ao aumento do fenótipo agressivo; diminuicão da latência e aumento do número de ataques ao intruso. Ainda, a ND diminuiu o controle respiratório mitocondrial. A administração de CEF aumentou significativamente a expressão do GLT-1 e diminuiu os níveis de glutamato em relação ao grupo ND, enquanto que os níveis de pNR2Bser1232 e a agressividade foram similar ao grupo controle. No grupo ND/CEF o immunoconteúdo de GLT-1 e de pNR2Bser1232, os níveis de glutamato e o fenótipo agressivo, foram significativamente menores que no grupo ND, e similares ao grupo controle. Ainda, a CEF foi capaz de atenuar o prejuízo no controle respiratório mitocondrial causado pela ND. Nossos resultados demonstram que a interação bidirecional entre o transportador astrocitário GLT-1 e a subunidade pNR2Bser1232 neuronal mediada pelo glutamato, exercem um impacto regulatório no fenótipo agressivo induzido pela ND, e no controle respiratório mitocondrial. Desta maneira, este modelo reforça a importância da homeostasia funcional da sinapse tripartide glutamatérgica no fenótipo agressivo. / Anabolic androgenic steroids (AAS) such as nandrolone decanoate (ND) are synthetic hormones derived from testosterone. It is known that one of the most important adverse effects of abusive administration of these steroids is the increase in aggressive behavior. Evidence indicates that high doses of AAS alter morphology and cause hyperactivation of glutamatergic synapses which correlates with an aggressive exacerbated phenotype. Physiologically, glutamate is considered the main excitatory neurotransmitter in the mammalian brain. At high glutamate levels, occurs neuronal hyperexcitability mainly trhough the ionotropic N-methyl-d-aspartate (NMDAr) type of glutamatergic receptors and, consequently, changes in mitochondrial metabolism. Existing transporters in astrocytes predominantly perform the termination of glutamatergic excitatory signaling. In this sense, the GLT-1 glutamate astrocytic transporter is responsible for more than 90% of glutamate removal from the synaptic cleft, contributing significantly to the maintenance of glutamatergic signaling homeostasis. Administration of the β-lactam antibiotic ceftriaxone (CEF) increases GLT-1 expression and decreases glutamatergic hyperexcitability, which could potentially counteract brain mechanisms associated to increased aggressive phenotype mediated by nandrolone decanoate (ND). However, a possible molecular and behavioral interaction has not yet been explored in context. Thus, the primary objective of this work was to investigate whether increased expression of the GLT-1 astrocyte transporter modulates the glutamatergic mechanisms involved in ND-induced aggressive phenotype, and mitochondrial activity. Sixty-day-old male CF-1 mice were divided into 4 groups: oil vehicle (VEH), nandrolone (ND), ceftriaxone (CEF) and nandrolone + ceftriaxone (ND / CEF). Nandrolone was injected subcutaneously (15mg / kg) for 19 days. Ceftriaxone (200mg / kg) or saline solution were administered intraperitoneally for 5 days. After the last injection, the latency for the first attack and the number of attacks on the intruder test were evaluated. The animals were sacrificed after the test, and homogeinized cortex were used for immunoquantification of GLT-1 and phosphorylation of the NMDAr pNR2Bser1232 subunit. Mitochondrial activity was evaluated in total brain sinaptossomes. Glutamate levels were measured in the cerebrospinal fluid. Compared to the vehicle group, treatment with ND significantly decreased the expression of GLT-1, increased glutamate levels and expression of the pNR2Bser1232 which was mechanistically associated with an increase in the aggressive phenotype; decrease in the latency and increase in the number of attacks. Also, ND decreased mitochondrial respiratory control. Administration of CEF significantly increased GLT-1 expression and decreased glutamate levels relative to the ND group, whereas pNR2Bser1232 levels and aggressive phenotype were similar to the control group. In the ND / CEF group the expression of GLT-1 and pNR2Bser1232, glutamate levels and aggressive phenotype were significantly lower than in the ND group, and similar to the control group. Furthermore, CEF was able to attenuate the alteration in the mitochondrial respiratory control caused by ND. Our results demonstrated that the levels of glutamate astrocytic transporter GLT-1 and pNR2Bser1232 are important mechanism behind the increased aggressive phenotype induced by ND, and decreased mitochondrial respiratory control. Also, this model reinforces the importance of glutamate levels and astrocytic molecular targets in the regulation of the aggressive phenotype.

A fibrose hepática é uma patologia que acompanha outras doenças crônicas do fígado como a cirrose e o hepatocarcinoma. As células estreladas hepáticas (HSC, do inglês hepatic stellate cells) compõem uma população celular heterogênea que se caracteriza por transitar entre dois fenótipos. As células com fenótipo quiescente possuem a capacidade de armazenar vitamina A em gotas lipídicas. Os insultos ao fígado desencadeiam uma resposta inflamatória que gera estímulos parácrinos e autócrinos mediados por citocinas e espécies reativas. Neste contexto, as HSC assumem um fenótipo ativado fibrogênico e tornam-se responsáveis pela cicatrização hepática. Danos crônicos ao fígado levam a uma deposição de matriz extracelular exagerada que configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas. Inúmeros efeitos benéficos à saúde são atribuídos ao RSV por causa do seu potencial antioxidante, antiinflamatório e pró-apoptótico. Estudos anteriores mostraram que tratamento da GRX, uma linhagem murina de HSC ativadas, com concentrações de RSV próximas as biodisponíveis (0,1 a 1 μM) resultou em parada do ciclo na fase S com consequente inibição de proliferação celular, um efeito associado à citotoxicidade e que pode favorecer a resolução da fibrose hepática. Neste estudo, por técnicas espectrofotométricas, foi demonstrado que tratamento da GRX por 24 horas com concentrações entre 0,1 a 50 μM de RSV promoveu um efeito pró-oxidante que causa uma citotoxicidade dependente da dose, bastante aumentada no grupo tratado com a concentração mais alta. Os efeitos citotóxicos atenuados encontrados nas células tratadas por 120 horas sugerem que a GRX pode se tornar resistente a estes efeitos. O potencial pró-oxidante do RSV foi o ponto de partida para investigar a possibilidade de que esta fitoalexina provocasse uma alteração no metabolismo mitocondrial da GRX. Para isso, os efeitos do RSV (1 a 50 μM) na função mitocondrial, na indução de morte mediada por estas organelas e na autofagia/mitofagia foram investigados por técnicas de espectrofotometria, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo, de microscopia confocal e de microscopia eletrônica de transmissão em GRX tratadas por 24 e 120 horas. Foi demonstrado que todas as concentrações de RSV promovem apoptose por meio da ativação de caspases, alteram a dinâmica/função mitocondrial e induzem o aumento de autofagia/mitofagia na GRX. No entanto, o RSV provocou biogênese de mitocôndrias nos grupos tratados com 1 e 10 μM, enquanto que o tratamento com 50 μM causou dano celular evidente na GRX, sem induzir biogênese de mitocôndrias. Desta forma, é possível que a citotoxicidade “dose-dependente” do RSV, que causa a morte celular e dano oxidativo em 24 horas de tratamento, esteja relacionada com o desequilíbrio entre a indução concomitante de apoptose mediada por dano mitocondrial, autofagia/mitofagia e biogênese de mitocôndrias. Por fim, foi investigada a liberação de TNF-α, Interleucina-6 e Interleucina-10 pela GRX tratada por 24 e 120 horas com RSV (0,1 a 50 μM), considerando o papel antiinflamatório do RSV e o papel das HSC ativadas na sinalização autócrina que contribui para a modulação fenotípica destas células. Foi demonstrado que o tratamento da GRX com RSV por 24 e 120 horas induziu a redução da liberação de Interleucina-6; enquanto que a liberação de TNF-α e Interleucina-10 foi aumentada. Estes resultados confirmam um efeito antiinflamatório do RSV que deve contribuir na prevenção da ativação ou da perpetuação do estado ativado das HSC por meio de sinalização autócrina. Ainda que a concentração do RSV seja importante para efetivamente induzir a morte das HSC ativadas, o tratamento com esta fitoalexina pode ser promissor para a resolução da fibrose hepática por diminuir a população de células ativadas e, possivelmente, prevenir a perpetuação do estado fenotípico ativado. Estudos avaliando indicadores de quiescência em células tratadas são ainda necessários para desvendar completamente os efeitos do RSV quanto às possibilidades de inibição da perpetuação ou reversão fenotípica das HSC ativadas. / Liver fibrosis is a disease that accompanies other hepatic chronic diseases such as cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Hepatic stellate cells (HSC) are a heterogeneous cell population characterized by transiting between two phenotypes. Cells with a quiescent phenotype are able to store vitamin A into lipid droplets. Damage to the liver trigger an inflammatory response that generates paracrine and autocrine stimulation mediated by cytokines and reactive species. In this context, HSC assume an activated and fibrogenic phenotype responsive for hepatic wound-healing. Chronic insults to the liver lead to an excessive deposition of extracellular matrix that configures the pathological state of fibrosis. Resveratrol (RSV – 3,4’,5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic potential. Previous studies showed that treatment with bioavailable concentrations of RSV (0.1 to 1 μM) promoted an arrest cycle at the S phase in GRX, a murine activated HSC model, leading to cell proliferation inhibition, a cytotoxic effect that contributes to the liver fibrosis resolution. In this study, it was shown by spectrophotometric techniques that GRX treatment for 24 hours at concentrations between 0.1 to 50 μM of RSV promoted a fairly clear pro-oxidant effect that causes a dose-dependent cytotoxicity that was higher in the group treated with 50 μM. The attenuated cytotoxicity found after 120 hours of GRX treatment suggest that these cells became resistant to this effect. The pro-oxidant potential of RSV was the starting point for investigating the possibility that this phytoalexin would cause a change in the GRX mitochondrial metabolism. Thus, the effects of RSV (1 to 50 μM) on altering the mitochondrial function, on inducing mitochondrial-mediated cell death, and autophagy/mitofagia were investigated in GRX treated for 24 and 120 hours by spectrophotometric techniques, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal microscopy, and transmission electron microscopy. All the RSV concentrations promote cell apoptosis through caspases activation, alter the mitochondrial dynamics and function, and induce an increase of autophagy/mitofagia. Curiously, only 1 and 10 μM of RSV induced mitochondrial biogenesis in GRX, while the highest concentration caused an evident cell damage without inducing mitochondrial biogenesis. Thus, it is possible that the "dose-dependent" cytotoxicity of RSV, which causes cell death and oxidative damage in 24 hours of treatment, is related to an imbalance between the concomitant induction of mitochondrial-mediated apoptosis, autophagy/mitofagia, and mitochondrial biogenesis. Finally, it was investigated the release of TNF-α, Interleukin-6 and Interleukin-10 by GRX treated for 24 and 120 hours with RSV (0.1 to 50 μM), considering the anti-inflammatory role of RSV and the autocrine signalling role of HSC that contributes to the perpetuation of its activated phenotype. It was demonstrated that GRX treatment with RSV for 24 and 120 hours reduced the release of Interleukin-6 in the culture medium; whereas the release of TNF-α and Interleukin-10 was increased. These results confirm the anti-inflammatory properties of RSV and may contribute to the prevention of HSC activation through autocrine signalling. Although RSV concentration is important to effectively induce activated HSC death, cells treatment with this phytoalexin may be promising for liver fibrosis resolution through decreasing the population of activated cells or through preventing the perpetuation of activated state of HSC. Future studies evaluating the quiescence indicators of GRX under RSV treatment are still needed to fully unravel the effects of this phytoalexin on inhibiting the perpetuation of activated HSC or reversing its activated phenotype.

A obesidade está relacionada com uma grande variedade de disfunções, tais como as dislipidemias, resistência à insulina e diabetes tipo II. Estas patologias estão relacionadas com alterações da fisiologia mitocondrial. As mitocôndrias são o principal sítio do metabolismo oxidativo e são importantes fontes de espécies reativas de oxigênio. Alberici et al. (2006) mostraram que a atividade de canais de potássio sensíveis a ATP mitocondriais (mitoKATP), via dissipativa branda, estava aumentada em fígados de animais hipertrigliceridêmicos transgênicos. Este dado sugere um papel adaptativo importante para o mitoKATP como regulador do metabolismo e da massa corpórea. O principal objetivo deste trabalho foi investigar o papel deste canal em fígados de camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica, obtida por meio de suplementação de óleo de soja à única fonte de água dos animais. Foram estabelecidas correlações entre a atividade do canal e parâmetros da fisiologia mitocondrial ou parâmetros sorológicos clássicos como colesterolemia e trigliceridemia. Sendo realizados experimentos de espalhamento de luz, quantificação de peróxido de hidrogênio, potencial de membrana e consumo de oxigênio em mitocôndrias. Nossos resultados mostram aumento de massa corpórea sem dislipidemias e aumento da atividade do mitoKATP, dependente do tempo da suplementação, diretamente correlacionada com a colesterolemia. Nossos resultados apontam aumento da geração de EROs e diminuição da eficiência de conversão energética no grupo suplementado. Como conclusão: manipulações de dieta são eficazes para a indução da atividade do mitoKATP, sendo este um novo e interessante sítio de regulação do metabolismo oxidativo e da massa corpórea. / Obesity is associated with multiple dysfunctions including dyslipidemia, insulin resistance and diabetes. These malfunctions are associated with modifications in mitochondrial physiology. Furthermore, mitochondria are the most important site of energy metabolism and reactive oxygen species production. Alberici et al. (2006) demonstrated that hypertriglyceridemic transgenic mice display increased expression ad activity of mitochondrial ATP sensitive potassium channels (mitoKATP), a mild uncoupling pathway, in liver. This suggests that mitoKATP is an important adaptation to regulate body mass and metabolism. The aim of this work is to investigate the role of mitoKATP in a high fat diet induced by soy oil supplementation, correlating changes in channel activity with metabolic and mitochondrial parameters. Mitochondria were isolated from mouse livers and serological parameters were measured for each animal. Light scattering (to estimate mitoKATP activity), hydrogen peroxide generation, membrane potentials and oxygen consumption were measured in the mitochondrial suspensions. Our results indicate an increase in body mass, without dyslipidemia; and increases in mitoKATP activity, in time-dependent manner, directly correlated to cholesterol levels. In addition, we found increases in ROS generation and decreased capacity of energy conversion (ADP/O) in the high fat diet group. In conclusion, our results indicate that the activity of mitoKATP could be induced by high fat diets and that this is an novel site for metabolic and body mass control.

A oxidação do resíduo de cisteína 56 (ANT-cys56) do transportador de nucleotídeos de adenina (ANT) é descrita como evento crítico da Transição de Permeabilidade Mitocondrial (TPM), fenômeno caracterizado pela sensibilidade ao fármaco imunossupressor ciclosporina A (CsA), responsável pela ligação e inibição do componente promotor da abertura do Poro de Transição de Permeabilidade (PTP), a enzima peptidil-prolil-cis trans isomerase (cyp D). Aspectos bioquímico-estruturais do ANT, das cardiolipinas (CDL) que envolvem o transportador e da cyp D na TPM foram avaliados por meio de ensaios turbidimétricos de inchamento mitocondrial e estado conformacional do ANT em mitocôndrias isoladas de fígado de rato, associados a abordagens de química computacional para análises de campos de interação molecular (MIF) e dinâmica molecular (MD), visando a predição de eventos envolvidos na abertura do PTP. As análises computacionais revelaram aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56, como resultado da interação preferencial do Ca2+ com a molécula de CDL ligada à hélice 4 do transportador, enquanto que a inversão da configuração do resíduo de prolina do ANT (ANT-pro61) potencializou o efeito induzido por Ca2+. A presença de ADP no interior do ANT preveniu o aumento da mobilidade relativa do ANT-cys56 promovida pelo Ca2+, enquanto que a inversão da configuração do ANT-pro61, de trans para cis, potencializou o efeito promovido pelo Ca2+ na mobilidade relativa do ANT-cys56, de forma insensível ao nucleotídeo. Os ensaios com mitocôndrias isoladas demonstraram que o Ca2+ induz a conformação c do ANT e promove abertura do PTP, de forma sensível à CsA e ADP. A presença de cyp D estabilizou a conformação c do ANT induzida por Ca2+, sendo que Atractilosídeo (ATR) tornou o efeito parcialmente insensível aos inibidores da TPM. Os resultados sugerem que a abertura do PTP induzida por Ca2+ envolve a mudança conformacional do ANT para o estado c, cuja estabilização é obtida pela cyp D na função de inversão do ANT-pro61, com base na avaliação da mobilidade relativa do ANT-cys56 parcialmente sensível ao ADP. / Oxidation of the Adenine Nucleotide Translocase (ANT) cysteine residue 56 (ANT-cys56) is potentially involved in Ca2+-induced Mitochondrial Permeability Transition (MPT), a process which is prevented by cyclosporine A (CsA), due to its inhibition of Permeability Transition Pore (PTP) opener component, the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase cyclophylin D (cyp D). The main aspects of ANT, cardiolipins (CDL) and cyp D on Ca2+-induced PTP opening were addressed by employing light scattering techniques in isolated rat liver mitochondria to assess both ANT conformational change and mitochondrial swelling in association with computational chemistry analysis of Molecular Interaction Fields (MIF) and Molecular Dynamics (MD) for PTP events predictions. Computational analysis revealed that Ca2+ interacts preferentially with the ANT surrounding CDL bound to the H4 helix of the carrier and weakens the CDL/ANT interactions accounting for the ADP-sensitive increase of ANT-cys56 relative mobility while ANT-pro61 cis to trans configuration inversion intensified the Ca2+ effect in a ADP-insensitive way. The ANT conformation and mitochondrial swelling analyses demonstrated that Ca2+ induces conformation c of ANT and opens PTP in a CsA- and ADP-sensitive way. Cyp D stabilizes Ca2+-induced ANT conformation c, whereas ATR renders a PTP opening less sensitive to the inhibition by CsA or ADP. The results suggest that Ca2+-induced PTP opening involves ANT conformation c change supported by a cyp D-induced trans to cys ANT-pro61 configuration inversion based on the relative mobility of ANT-cys56, in a ADP-sensitive manner.

The rapid pace of conversion of natural areas to agronomic systems is a matter of great concern, and the consequences for conservation and pest management are not yet fully understood. We examined mitochondrial (COI and Cytb) and nuclear (ITS1) gene regions of 21 Euschistus heros populations to investigate the genetic diversity, genetic structure, and the demographic history of this emerging pest of soybean crops in South America. Two deep divergent lineages that separated in the Pliocene (4.5 My) have been found over a wide area. The northern lineage is older, more diverse, and prevalent in the Amazon and Caatinga, while the southern lineage is younger, less diverse, and prevalent in the Atlantic Forest and Chaco biomes. The secondary contact is occurring mainly in the Cerrado, an important agriculture frontier. Euschistus heros populations are expanding in size and range, but are strongly affected by environment variables. Historical changes during the Plio-Pleistocene created significant genetic differentiation between E. heros populations, which differentiated further in several biomes. The present populations are expanding at different rates, mixing highly diverse populations with less-diverse populations in regions of intensive farming. This, individuals adapted to different environmental conditions and to large monocultures might currently be combining into a panmictic and hard-to-control pest population. / O ritmo acelerado da conversão de áreas naturais em sistemas agronômicos é motivo de grande preocupação e as consequências para conservação e manejo de pragas ainda não são totalmente compreendidas. Examinamos regiões de genes mitocondriais (COI e Cytb) e nucleares (ITS1) de 21 populações de Euschistus heros para investigar a diversidade genética, a estrutura genética e a história demográfica dessa praga emergente de soja na América do Sul. Duas linhagens profundamente divergentes que se separaram no Plioceno (4.5 My) foram encontradas amplamente distribuidas na América do Sul. A linhagem norte é mais antiga, mais diversificada e predomina na Amazônia e Caatinga, enquanto a linhagem sul é mais jovem, menos diversificada e prevalente nos biomas da Mata Atlântica e Chaco. O contato secundário está ocorrendo principalmente no Cerrado, uma importante fronteira agrícola. As populações de E. heros estão se expandindo em tamanho e área, mas são fortemente afetadas pelas variáveis ambientais. As mudanças históricas durante o Plio-Pleistoceno criaram significativa diferenciação genética entre as populações de E. heros, que se encontram estruturadas nos biomas. As populações atuais estão se expandindo em diferentes taxas, misturando populações altamente diversas com populações menos diversas em regiões de agricultura intensiva. Assim, indivíduos adaptados a diferentes condições ambientais e grandes monoculturas podem combinar-se em uma população de pragas panmítica e difícil de controlar.