Nesta tese serão discutidos alguns aspectos químicos, fotoquímicos e fotofísicos importantes no desenvolvimento de fotossensibilizadores para aplicação em terapia fotodinâmica (TFD). Os estudos abrangeram a investigação de 29 espécies, sendo que 20 delas continham um anel porfirínico convencional e 9 eram porfirinas duplamente N-confusas. As primeiras foram sintetizadas para apresentarem diferentes números e tipos de substituintes catiônicos coordenados à posição meso do anel porfirínico, mais especificamente as meso(N-4-piridil)fenilporfirinas e as meso(N-3-piridil)fenilporfirinas contendo um, dois (em trans), dois (em cis), três e quatro grupos [Ru(bipy)2Cl]+ ou CH3+ (figura 1). Em contraste com as porfirinas convencionais. as outras 9 estruturas consistiram das formas protonadas, neutras e desprotonadas de porfirinas que exibem dois anéis pirrólicos adjacentes voltados para fora do anel porfirínico, mais especificamente a base livre (H2N2CP) e os respectivos complexos de prata (AgHN2CP) e de cobre (CuHN2CP). Esta peculiaridade estrutural permite coordenar metais de transição por meio de dois átomos de carbono e dois de nitrogênio, estabilizando fortemente íons metálicos em estados de oxidação anormalmente elevados como Ag3+ e Cu3+. Os dois nitrogênios pirrólicos externos ao anel são susceptíveis tanto a protonação quanto a desprotonação, possibilitando a modulação das propriedades eletrônicas desses compostos por simples alteração no pH do meio. De um modo geral, a acidificação das amostras perturbou mais significativamente suas propriedades fotoquímicas que a desprotonação. Em especial, as espécies neutras metaladas apresentaram bandas bastante intensas na região fototerapêutica de 600 a 750 nm, além de um elevado rendimento quântico de formação de oxigênio singlete (ΦΔ > 0,90 para o complexo Ag(III)). Todavia, um processo de fotodecomposição atribuído ao ataque do 1O2 formado, também foi observado. Ambos os processos, ΦΔ e fotodecomposição, parecem ser modulados pelo metal coordenado no centro do anel. Tanto a coordenação de Ag(lII) como Cu(lII) aumentou o ΦΔ, provavelmente devido ao efeito do metal pesado sobre o cruzamento interssistema. Todavia, verificou-se que o derivado AgHN2CP é muito menos reativo que o CuHN2CP e a base livre. Os motivos deste comportamento ainda não são completamente compreendidos, mas é evidente que o complexo de Ag(lII) apresenta melhores propriedades fotodinâmicas que as demais. Em comparação com as porfirinas duplamente N-confusas, as demais 20 porfirinas catiônicas são muito mais solúveis em água. Neste caso, o enfoque dos experimentos foi direcionado às aplicações biológicas propriamente ditas. Assim, além das propriedades fotofísicas associadas à formação de oxigênio singlete (1O2), também foram exploradas a influência do número dos substituintes periféricos sobre a ligação e danos fotooxidativos provocados em eritrócitos, lipossomos, mitocôndrias e células cancerígenas. Os resultados de ΦΔ mostraram ser inversamente proporcionais ao número de cargas positivas, para as porfirínas contendo grupos N-4metilpiridíniom. Estas diferenças foram consistentes com os efeitos de agregação, causados pela formação de dímeros ou oligômeros, no caso das espécies mais hidrofóbicas. Os coeficientes de partição em n-octanol/água (logPOA) corroboraram estes resultados, apresentando uma dependência inversamente proporcional ao número de cargas positivas ou proporcional ao número de resíduos fenila. As eficiências de ligação à bicamada lipídica mitocondrial, lipossomal e celular e os processos de peroxidação lipídica fotoinduzidos mostraram uma dependência proporcional aos valores de logPOA, exceto para as porfirinas contendo complexos de rutênio. O comportamento não linear neste último caso pode estar associada a dissociação da ligação rutênio-porfirina, devido a elevada força iônica das soluções fisiológicas utilizadas. Neste caso, a descoordenação dos complexos periféricos deve promover uma drástica diminuição da solubilidade do composto. Por este motivo os experimentos foram conduzidos somente com as espécies metiladas. No caso, de mitocôndrias isoladas verificou-se que a interação também apresenta uma razoável participação do potencial de membrana. De fato, quando a mitocôodria estava energizada foi observado um acréscimo de 15% no acúmulo da 3P2cMe em comparação com à mitocôndria desacoplada. Para as demais porfirinas houve um menor acúmulo com o aumento do número de resíduos N-3-metilpirídínio. Em todos os experimentos, um comportamento diferenciado foi observado no caso dos isômeros dicatiônicos. A espécie com cargas dispostas nas posições cis (3P2cMe) apresentou praticamente o dobro de eficiência que o correspondente isômero trans (3P2tMe). Este comportamento parece consistente com uma maior penetração da primeira espécie na bicamada lipídica, proporcionado pelo caráter antipático de sua estrutura química. Os resultados apresentados neste estudo mostraram que estas séries de meso-porfirinas catiônicas constituem sistemas bastante interessantes para a compreensão dos efeitos estruturais envolvidos na ação fotodinâmica dos compostos sobre membranas lipídicas, devido à possibilidade de modulação da relação hidrofilicidade/lipofilicidade, sem alterar significativamente a eficiência na formação de 1O2. Além disso, a disposição espacial das cargas positivas na estrutura do fotossensibilizador demonstrou ser extremamente crítica no processo de ancoragem do mesmo na membrana celular ou mitocondrial e consequentemente em causar efeitos fotooxidativos mais eficientemente. As porfirinas contendo grupos 3-metilpiridínio apresentam vantagens sobre as 4-metilpiridínio, normalmente estudas, por serem mais hidrofílicas, terem menor tendência de agregação e possuírem similar atividade fotodinâmica. Em especial, a estrutura anfipática da 3P2cMe associada a sua elevada formação de 1O2 e estabilidade lhe conferem uma interessante potencialidade como agente fototerapêutico. / In this thesis the chemical, photochemical and photophysical relevant aspects for the development of new photosensitizers for photodynamic therapy applications are discussed. 20 conventional porphyrins species and 9 doubly Nconfused porphyrins species were investigated. The first series contains variable number (1 to 4) of cationic groups, [Ru(bipy)2CI]+ or CH3+ (figure 1), bound to the meta or para-pyridil N-atoms of meso-phenylpyridylporphyrins. On the other hand, the protonated, neutral and deprotonated doubly N-confused porphyrins possess two rotated adjacent pyrrol rings, such that they have two coordinating camon atoms. Consequently, transition metal ions in unusually high oxidation states such as Ag(lII) and Cu(lII) can be stabilized by this structure, while the outer pyrrol N-atoms are susceptible to protonation and deprotonation reactions, allowing the modulation of their electronic properties simply by controlling the pH of the solution. In general, the protonation perturbed more significantly the photochemical properties than the deprotonation. The neutral species exhibit intense absorption bands in the phototherapeutical range (600 to 750 nm), associated with a high singlet oxygen sensitization quantum yield (ΦΔ> 0,90 for the Ag(lII) complex). Furthermore, a photodecomposition process due to the reaction with 1O2 was also identified. Both ΦΔ and photodecomposition are influenced by the metal ion coordinated to the doubly N-confused porphyrin ring. The coordination of Ag(lIl) and Cu(lII) increased ΦΔ, probably due to the enhancement of intersystem crossing quantum yield associated with the heavy atom effects. However, AgHN2CP is much more stable than CuHN2CP or the free-base, but the reasons are not clear and should be further investigated. The above results clearly evidence the superior properties of the Ag(lIl) complex as photosensitizer for PDT applications. The 20 cationic pyridylporphyrin derivatives are much soluble in water and experiments directed to biological applications could be carried out. Accordingly, in addition to the quantum yield for singlet oxygen generation(1O2), the effect of the stereochemistry and number and position of the electrically charged substituents on the binding constants and photooxidative damage on erythrocytes, lipossomes, mitochondria and HeLa cells were evaluated. The ΦΔ values were constant in the case of the N-3-methylpyridinium derivatives but inversely proportional to the number of positive charges for the N-4-methylpyridinium derivatives. This was assigned to an increase of aggregation of the sensitizers as the number of meso-phenyl rings and the lipophylicity increase. The partition coefficients in n-octanol/water (logPOA) corroborate that assertion showing a linear correlation with increasing of the number of phenyl groups. The binding efficiency towards the mitochondrial, lipossomal and cellular membrane and the photo-induced lipidic peroxidation processes were directly proportional to the logPOA, except for the ruthenated porphyrins. This last behavior may be associated with the dissociation reactions of the rutheniumpyridylporphyrin bond in the physiologic solution. Accordingly, those experiments were carried out only with the methylpyridynium derivatives. For the first time, we showed inequivocally that the interaction of the methyllated porphyrins with mitochondria are significantly influenced by the membrane potential. In fact, when the mitochondria was energized a 15% increase was observed in the binding constants of 3P2cMe in comparison with teh results with decoupled mitochondria. Also, the amount of bond porphyrin sensitizer decreased as the number of methylpyridynium groups was increased, following the same tendency as above. The behavior of the cis (3P2cMe) and trans (3P2tMe) isomers didn\'t follow the general tendency for the other derivatives in a series, such that the binding constants of the cis isomers were always about twice higher than for the trans, which were much higher than predicted by the general behavior. This means that they can associate more strongly and penetrate deeper in the membrane than the more charged porphyrin derivatives. In particular, the cis species is amphiphilic, i.e. possess an adequate structure for that interaction. The results presented in this thesis showed conclusively that the two series of meso-phenylpyridylporphyrins are adequate for the investigation of the effect of the stereochemistry on the bonding ability and photodynamic properties of those photosensitizers. This is particularly true due to the possibility of modulating the ratio between hydrophobicitylhydrophylicity and the stereochemistry without influencing significantly the quantum yield for 1O2 generation. The meta- series showed an advantage over the conventionally used para- series of methylpyridynium porphyrins because it is more soluble and shows lesser tendency to aggregate. In condusion, the amphiphilic 3P2cMe is the species with the highest potentiallity as por sensitizer because of its high binding constants, low tendency to associate and high ΦΔ.

Apesar dos avanços dos últimos anos, a reposição de cardiomiócitos permanece como um dos maiores desafios da medicina regenerativa. A comprovação da existência de mecanismos endógenos de proliferação cardíaca nos impulsionou a buscar o entendimento dos eventos moleculares envolvidos na proliferação de cardiomiócitos na vida pós-natal. Neste trabalho foi testada a hipótese da influência do metabolismo energético mitocondrial na cardiomiogênese, e seu impacto na regeneração cardíaca. No primeiro momento, foi descrito pela primeira vez o modelo de ressecção apical cardíaca em ratos neonatos. Demonstrou-se que há um período restrito as primeiras 24 horas de vida em que o animal é capaz de regenerar o tecido cardíaco, formando novos cardiomiócitos e permitindo a manutenção da função cardíaca na vida adulta. Esta capacidade é perdida 7 dias após o nascimento, havendo apenas reparo com tecido fibroso e prejuízo à função cardíaca. De maneira interessante, os dados apontaram para hipoperfusão da região apical em ambos os animais ressectados. Isso possivelmente acarretou em dano mitocondrial na vida adulta, sem influenciar a função cardíaca. De maneira a investigar os eventos moleculares da regeneração cardíaca neonatal foi realizado o sequenciamento de RNA dos corações de ratos neonatos de 1 e 7 dias de vida, ressectados e sham, pela técnica de RNASeq, que apontou a relevância da idade nas diferenças de expressão de genes relacionados ao metabolismo, sendo que a intervenção da ressecção pouco influenciou o perfil de expressão gênica. Os resultados mostraram a troca de expressão de isoformas da via glicolítica com a maturação pós-natal, e a hiper-regulação da expressão de genes das vias da ?-oxidação, fosforilação oxidativa e ciclo do ácido tricarboxílico durante o mesmo período. Entretanto, os dados funcionais da atividade metabólica do tecido cardíaco e cultura de cardiomiócitos neonatais mostraram que tanto a glicólise anaeróbia quanto o consumo de oxigênio relacionado à oxidação mitocondrial estiveram elevados no neonato de 1 dia, e foram reduzidos com o desenvolvimento cardíaco. As elevadas taxas de consumo de oxigênio nas culturas de cardiomiócitos de 1 dia de vida foram relacionadas principalmente à produção de ATP. Esses cardiomiócitos foram capazes de proliferar em cultura na presença de soro como estimulador. Assim sendo, as análises de expressão gênica sozinhas pareceram ser indicadores parciais do estado funcional do metabolismo. A inibição não letal da fosforilação oxidativa evidenciou a importância do metabolismo mitocondrial na capacidade proliferativa dos cardiomiócitos na vida pós-natal. Os dados sugerem que o primeiro dia após o nascimento abrange uma alta demanda energética tanto para a diferenciação terminal quanto para a última fase robusta de proliferação de cardiomiócitos na vida pós-natal, e assim evidenciam a importância do metabolismo mitocondrial no processo regenerativo / Despite advances in recent years, the replacement of cardiomyocytes remains one of the biggest challenges in regenerative medicine. The existence of endogenous mechanisms of cardiac proliferation prompted us to seek the understanding of molecular events involved in cardiomyocyte proliferation in postnatal life. In this study, we investigated the influence of mitochondrial energy metabolism in cardiomyogenesis, and its impact on cardiac regeneration. At first, it was described for the first time the model of heart apical resection in neonatal rats, where there is a limited period the first 24 hours of life that animal is able to regenerate cardiac tissue, forming new cardiomyocytes and allowing the maintenance cardiac function in adulthood. This ability is lost seven days after birth, when repair is basically by fibrotic tissue and consequent impairment for heart function. Interestingly, data showed hypoperfusion of the apical region in both resected animals, which possibly resulted in mitochondrial damage in adulthood without affecting heart function. In order to investigate the molecular events of neonatal cardiac regeneration was performed RNA sequencing of hearts from newborn rats with 1 and 7 days of life, resected and sham, which pointed out the importance of age in the different expression of genes related to metabolism, and the intervention of resection had little influence on this. The results showed exchange of expression of enzymes isoforms from glycolytic pathway and hyperregulation of genes from beta-oxidation, oxidative phosphorylation and tricarboxylic acid cycle pathways, during postnatal maturation. However, the functional data of the metabolic activity of cardiac tissue and culture of neonatal cardiomyocytes showed that both anaerobic glycolysis and oxygen consumption related to mitochondrial oxidation were higher in 1-day-old newborns, and were reduced with cardiac development. The high rates of oxygen consumption in 1-day-old cardiomyocytes were related mainly to ATP production. These 1-day-old cardiomyocytes were able to proliferate in culture by serum stimulation. Therefore, the analysis of gene expression alone appeared to be a partial indicator of functional state of metabolism. The non-lethal inhibition of oxidative phosphorylation highlighted the importance of mitochondrial metabolism in the proliferative capacity of cardiomyocytes in postnatal life. Data suggest that the first day after birth covers a high energy demand for both terminal differentiation of cardiac cells and last robust phase of cardiomyocyte proliferation in postnatal life, and show the importance of mitochondrial metabolism in the regenerative process

Entre todos os cânceres de pele, o melanoma está entre os menos comuns, mas é responsável pela maior parte das mortes. No caso da doença metastática, não há um tratamento satisfatório capaz de prolongar a vida do paciente. Isso leva à necessidade de novas estratégias e de novos tratamentos que possam reverter a quimiorresistência do tumor. Entre as proteínas que têm seu perfil de expressão modificado no melanoma está a proibitina, cuja expressão aumenta durante a progressão tumoral. Proibitina é uma chaperona mitocondrial pertencente a uma família de proteínas que possuem um resíduo hidrofóbico SPFH, que confere a ela uma capacidade de ancoragem e de organização de espaços em membranas. Além disso, no compartimento nuclear, é um inibidor da família de fatores de transcrição E2F, juntamente com a proteína retinoblastoma (Rb). Em melanomas, proibitina localiza-se no citoplasma, associada à mitocôndria, e no núcleo. No citoplasma, proibitina faz parte da resposta a diversas drogas, como cisplatina, dacarbazina, temozolamida, vimblastina e tunicamicina pode estar relacionado com o aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS), já que essas drogas podem de alguma forma induzir ROS intracelular. O aumento de expressão de proibitina, nesse contexto, poderia fazer parte de uma resposta protetora da mitocôndria, o que em última análise protegeria a célula contra a morte celular, já que a inibição de proibitina sensibiliza a célula ao tratamento com cisplatina ou tunicamicina. Além disso, o estresse provocado pela privação de soro fetal bovino em linhagens de melanoma leva ao aumento de expressão de proibitina e é acompanhado pela indução de ROS. No núcleo, proibitina esta colocalizada com MCM5 e MCM7, mas não MCM2. A inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de metaloproteinases de matriz extracelular, não só em melanomas, mas também em linhagens de câncer de mama e de câncer de pulmão. Ainda, proibitina parece estar relacionada com o fenômeno da transição epitélio mesênquima, já que a inibição de proibitina leva ao aumento de expressão de marcadores mesenquimais como N-caderina e vimentina e a perda de expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina. Outras funções controladas por E2F1 que proibitina pode estar modulando são a capacidade de E2F1 induzir reparo de DNA devido a lesões causadas por radiação UVB e a indução de senescência. A inibição de proibitina em linhagem de câncer de pulmão protegeu a célula contra o dano genotóxico causado pela radiação UVB, pelo aumento da proteína de reparo de DNA Gadd45a, que é induzida por E2F1. Ainda, a inibição de proibitina diminuiu a quantidade de células senescência induzida por adriamicina em linhagens de melanoma. Ainda, a expressão de proibitina responde a fatores do microambiente tumoral como TGF?, IL4 e LPS juntamente com INF? e, além disso, têm sua expressão diminuída durante a maturação de macrófagos. Esses resultados mostram que proibitina pode atuar protegendo o tumor ou bloqueando vias importantes para seu desenvolvimento, dependendo da sua compartimentalização subcelular / Among all skin cancers, melanoma is the least common, but is responsible for most deaths. In metastatic disease, no satisfactory treatment can prolong the patient\'s life. This leads to the need for new strategies and new treatments that may reverse tumor chemoresistance. Among proteins that have their expression profile altered in melanoma is prohibitin whose expression increases during tumor progression. Prohibitin is a mitochondrial chaperone belonging to a family of proteins which possess a hydrophobic residue SPFH, which gives it a capacity for anchorage and organization in membrane regions. Furthermore, in the nuclear compartment, prohibitin is an inhibitor of the E2F transcription factor family, together with the retinoblastoma protein (Rb). In melanomas, prohibitin is located in the cytoplasm, associated to the mitochondria, and inside the nucleus. In the cytoplasm, prohibitin is part of the response to various drugs such as cisplatin, dacarbazine, temozolomide, vinblastine and tunicamycin and may be associated with increased reactive oxygen species (ROS), since these drugs can somehow induce intracellular ROS. Prohibitin overxpression in this context could be part of a protective response of the mitochondria, which ultimately protect cells against death, as prohibitin inhibition sensitizes cells to cisplatin or tunicamycin treatment. Moreover, the stress caused by deprivation of fetal bovine serum in melanoma cell lines leads to prohibitin overexpression and is accompanied by ROS induction. In the nucleus, prohibitin is colocalized to MCM5 and MCM7, but not to MCM2. Inhibition of prohibitin leads to increased expression of matrix metalloproteinases, not only on melanomas but also on breast cancer and lung cancer cell lines. Further, prohibitin appears to be related to the phenomenon of epithelial mesenchymal transition, since prohibitin inhibition leads to increased expression of mesenchymal markers such as N-cadherin and vimentin and loss of expression of epithelial markers, such as E-cadherin. Other functions controlled by E2F1 that are modulated by prohibitin include be the ability of E2F1 to induce DNA repair against UVB radiation and the induction of cellular senescence. Inhibition of prohibitin in lung cancer cell line protected against genotoxic damage caused by UVB radiation, due to DNA repair protein Gadd45a overexpression, which is induced by E2F1. Also, prohibitin inhibition decreased the amount of cell senescence induced by adriamycin in melanoma cell line. Further, prohibitin expression is triggered by tumor microenvironmental factors such as TGF?, IL4, and LPS together with INF? and, in addition, prohibitin expression decreases during macrophages maturation. These results show that prohibitin may act protecting the tumor or blocking pathways important for its development, depending on its subcellular compartment distribution

INTRODUÇÃO: A lesão de isquemia/reperfusão hepática ocorre durante cirurgias hepáticas de grande porte, transplante de fígado e no trauma abdominal. A lesão de isquemia/reperfusão hepática ocasiona lesões no fígado e pode desencadear uma síndrome inflamatória sistêmica com lesões de órgãos a distância. Estudos anteriores demonstraram que o diazóxido protege outros órgãos (coração, rins, cérebro) da lesão de isquemia/reperfusão destes órgãos. OBJETIVO: Investigar o efeito da administração do diazóxido na lesão de isquemia/reperfusão hepática. MÉTODOS: Ratos Wistar machos foram divididos em 3 grupos. Em 2 grupos, os animais foram submetidos à isquemia hepática parcial realizada por clampeamento do pedículo dos lobos mediano e lateral anterior esquerdo durante uma hora sob ventilação mecânica. Grupo Salina (n=26): ratos receberam solução salina e Grupo Diazóxido (n=26): ratos receberam diazóxido EV ( 3.5mg/kg ) 15 minutos antes da reperfusão hepática. No terceiro grupo, Grupo Controle (n = 22 ), os ratos foram submetidos apenas à anestesia e manipulação cirúrgica. Quatro e 24 horas após os procedimentos, amostras de sangue foram recolhidas para determinações de AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10, de nitrito/nitrato, creatinina. Amostras teciduais do fígado foram analisadas para dosagem do malondialdeído (MDA), para o estudo das funções oxidativas e fosforilativas mitocondriais, e para a análise histológica. Pela coleta de tecido pulomonar, a permeabilidade vascular pulmonar e a atividade da mieloperoxidade (MPO) também foram determinados. RESULTADOS: Quatro horas após, a reperfusão o Grupo Diazóxido apresentou elevações de AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10 e níveis séricos de nitrito/nitrato significativamente menores que o Grupo Controle (p < 0,05). Observou-se uma redução significativa da disfunção mitocondrial hepática no Grupo Diazóxido em comparação com o Grupo Controle (p < 0,05). Não foram observadas diferenças no conteúdo de MDA fígado, na creatinina sérica e na permeabilidade vascular pulmonar, e na atividade da MPO entre os grupos. Vinte e quatro horas após, a reperfusão o Grupo Diazóxido registrou uma redução de AST, ALT quando comparado ao Grupo Controle (p < 0,05). CONCLUSÃO: O Diazóxido mantém a função mitocondrial do fígado, aumenta a tolerância fígado à lesão de Isquemia/Reperfusão e reduz a resposta inflamatória sistêmica. Esses efeitos requerem comprovações adicionais para o uso na prática clínica / INTRODUCTION: Significant liver ischemia/reperfusion injury can occur during hepatic surgeries, liver transplantation and abdominal trauma. Hepatic ischemia/reperfusion can trigger a local and systemic inflammatory syndrome. Previous studies have shown that diazoxide protects other organs (heart, kidneys, brain) from ischemia/reperfusion injury. AIM: To investigate the effect of diazoxide administration on liver ischemic/reperfusion injury. METHODS: Wistar male rats were divided into 3 groups. In two groups the rats underwent partial liver ischemia performed by clamping the pedicle from medium and left anterior lateral segments during an hour under mechanical ventilation. Saline Group (n=26): rats received saline and Diazoxide Group (n=26): rats received IV diazoxide (3.5mg/kg) 15 minutes before liver reperfusion. The third group, the Control Group (n=22) the rats underwent only anesthesia and surgical manipulation. Four and 24 hours after the procedure blood were collected for determinations of AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10, nitrite/nitrate, creatinine. Liver tissues were assembled for mitochondrial oxidation and phosphorylation, malondialdehyde (MDA) content, and histologic analysis. Pulmonary vascular permeability and myeloperoxidade (MPO) were also determined. RESULTS: Four hours after reperfusion Diazoxide Group presented elevation of AST, ALT, TNF-alfa, IL-6, IL-10 and nitrite/nitrate serum levels significantly lower than Control Group (p < 0.05). A significant reduction on liver mitochondrial dysfunction were observed in Diazoxide Group compared to Control Group (p < 0.05). No differences in liver MDA content,serum creatinine and in pulmonary vascular permeability and MPO activity were observed between groups. Twenty four hours after reperfusion Diazoxide Group showed a reduction of AST, ALT and TGF?1 serum levels when compared to Control group (p < 0.05). CONCLUSION: Diazoxide maintains liver mitochondrial function, increases liver tolerance to I/R injury, and reduces systemic inflammatory response. These effects require further evaluations for using in a clinical setting

The rapid pace of conversion of natural areas to agronomic systems is a matter of great concern, and the consequences for conservation and pest management are not yet fully understood. We examined mitochondrial (COI and Cytb) and nuclear (ITS1) gene regions of 21 Euschistus heros populations to investigate the genetic diversity, genetic structure, and the demographic history of this emerging pest of soybean crops in South America. Two deep divergent lineages that separated in the Pliocene (4.5 My) have been found over a wide area. The northern lineage is older, more diverse, and prevalent in the Amazon and Caatinga, while the southern lineage is younger, less diverse, and prevalent in the Atlantic Forest and Chaco biomes. The secondary contact is occurring mainly in the Cerrado, an important agriculture frontier. Euschistus heros populations are expanding in size and range, but are strongly affected by environment variables. Historical changes during the Plio-Pleistocene created significant genetic differentiation between E. heros populations, which differentiated further in several biomes. The present populations are expanding at different rates, mixing highly diverse populations with less-diverse populations in regions of intensive farming. This, individuals adapted to different environmental conditions and to large monocultures might currently be combining into a panmictic and hard-to-control pest population. / O ritmo acelerado da conversão de áreas naturais em sistemas agronômicos é motivo de grande preocupação e as consequências para conservação e manejo de pragas ainda não são totalmente compreendidas. Examinamos regiões de genes mitocondriais (COI e Cytb) e nucleares (ITS1) de 21 populações de Euschistus heros para investigar a diversidade genética, a estrutura genética e a história demográfica dessa praga emergente de soja na América do Sul. Duas linhagens profundamente divergentes que se separaram no Plioceno (4.5 My) foram encontradas amplamente distribuidas na América do Sul. A linhagem norte é mais antiga, mais diversificada e predomina na Amazônia e Caatinga, enquanto a linhagem sul é mais jovem, menos diversificada e prevalente nos biomas da Mata Atlântica e Chaco. O contato secundário está ocorrendo principalmente no Cerrado, uma importante fronteira agrícola. As populações de E. heros estão se expandindo em tamanho e área, mas são fortemente afetadas pelas variáveis ambientais. As mudanças históricas durante o Plio-Pleistoceno criaram significativa diferenciação genética entre as populações de E. heros, que se encontram estruturadas nos biomas. As populações atuais estão se expandindo em diferentes taxas, misturando populações altamente diversas com populações menos diversas em regiões de agricultura intensiva. Assim, indivíduos adaptados a diferentes condições ambientais e grandes monoculturas podem combinar-se em uma população de pragas panmítica e difícil de controlar.

As plantas, assim como outros organismos, possuem a capacidade de se defenderem contra ataque de patógenos. Uma das respostas desencadeadas pelo reconhecimento do patógeno pelas células vegetais é a reação de hipersensibilidade (RH), que envolve a morte imediata das células do sítio primário de infecção, oferecendo resistência ao crescimento do patógeno. Muitas evidências sugerem a participação da mitocôndria neste processo de morte celular programa. O nim (Azadirachta indica) é conhecido devido as suas propriedades medicinais e inseticidas, sendo que os estudos sobre a ação inseticida dessa planta restringem-se a análise de seus mecanismos de ação sobre insetos e também de seus efeitos sobre trabalhadores rurais que fazem uso de produtos a base de nim. Entretanto não há na literatura pesquisada, trabalhos de seus impactos sobre o sistema vegetal. A partir dos resultados previamente obtidos em nosso laboratório e com as análises dos dados da literatura, consideramos de grande importância dar continuidade a esse estudo do efeito do nim como elicitor, avaliando quais mecanismos que levam ao fenômeno de resistência vegetal. O extrato de nim (EB) foi preparado a partir das sementes, sendo caracterizado bioquimicamente pela quantificação de compostos fenólicos, açúcares e proteínas. A atividade antioxidante foi avaliada sendo possível observar que o extrato das sementes de nim possui forte atividade antioxidante de maneira dose-dependente com IC50 de 14,85 mg/mL. Para os ensaios biológicos foi utilizado EB nas concentrações de 0,1 a 5 mg/mL isolado ou em associação com AS a 1 µmol/L ou 1 mmol/L. Para determinação da morte celular foi observado o efeito do EB nas concentrações de 5 e 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L nos tempos de 0 a 8 horas. Diante dos resultados foi observado que o EB na concentração de 0,1 mg/mL isolado ou em associação com AS 1 µmol/L foi capaz de causar morte celular em células de Rubus fruticosus de forma mais significativa do que o EB isolado ou em associação com AS na concentração de 5 mg/mL. No tempo de 8 horas, foi observado uma porcentagem de morte celular de 64 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL isolado e 71 % para células elicitadas com EB 0,1 mg/mL em associação com AS. A diminuição da produção de EROs e da produção de AS endógeno bem como o aumento da produção de compostos fenólicos foi observado em células intactas elicitadas com EB isolado. No entanto quando a células foram elicitadas com EB em associação com AS observamos uma diminuição da produção de compostos fenólicos com o aumento da produção de AS endógeno. Em mitocôndrias isoladas foi avaliado o consumo de oxigênio, o potencial de membrana e a produção de EROs com o EB isolado e sua associação com AS 1 mmol/L. Foi observado que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir a velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória sendo este efeito mais acentuado quando o nim foi administrado juntamente com AS, onde a porcentagem de inibição da velocidade de consumo de oxigênio pela cadeia respiratória na presença de EB em associação com AS foi de 79 % no estado 3 da respiração e 62 % no estado 4. Sobre o potencial de membrana observamos que o EB isolado ou em associação com AS foi capaz de diminuir o potencial de membrana, porém de forma pouco significativa. Para a produção de EROs observamos que o EB isolado foi capaz de diminuir a produção de EROs em mitocôndrias isoladas em cerca de 55 a 20 % na presença de antimicina A e 39 a 10 % na presença de rotenona, porém quando o EB foi administrado juntamente com AS observamos uma diminuição da produção de EROs somente para o EB nas concentrações de 0,5; 1 e 5 mg/mL. Com os resultados apresentados neste trabalho e os resultados obtidos anteriormente em nosso laboratório é possível sugerir que o extrato das sementes de nim possui um efeito protetor sobre células de Rubus fruticosus. / Plants, like other organisms, have the capacity to defend themselves against attack by pathogens. One of the responses triggered by pathogen recognition by plant cells is the hypersensitive response (HR), which involves the immediate death of cells in the primary site of infection, providing resistance to the pathogen growth. In this regard, it has been well established that mitochondria are involved in cell death. The neem tree (Azadirachta indica) is known due to its medicinal and insecticidal properties; studies on the insecticidal action of this plant had been restricted to the analysis of their action mechanisms on insects and their effects on rural workers who use neem-based products. However, its impact on plant systems has not been addressed. Considering previous results from our laboratory and literature data we assessed the effects of neem as elicitor, particularly the mechanisms leading to the phenomenon of plant resistance. The neem extract (EB) was prepared from the seeds, characterized biochemically by quantification of phenolic compounds, sugars and proteins. The extract showed strong dose-dependent antioxidant activity (IC50 of 14.85 mg/mL). EB concentrations of 0.1-5 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L or 1 mmol/L SA (salicylic acid), were used for the biological assays. For cell death assays, EB was employed in concentrations of 0.1 and 5.0 mg/mL, alone or in association with 1 mol/L SA, during 0-8 hours. EB (0.1 mg/mL), alone or in association with 1 mol/L SA, induced Rubus fruticosus cell death more efficiently than EB alone or in association with 5 mg/mL SA. After 8 hours, a 64% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB and 71% of death of cells elicited with 0.1 mg/mL EB in association with SA, was observed. Decrease in ROS generation and production of endogenous SA, as well as increased production of phenolic compounds, was observed in intact cells elicited with EB alone. However, when cells were elicited with EB in association with SA, a decreased production of phenolic compounds and an increased production of endogenous SA, was observed. In isolated mitochondria, it was measured oxygen consumption, membrane potential and ROS production for EB alone or in association with 1 mmol/L SA. In either conditions, EB decreased oxygen consumption by the respiratory chain, an effect more pronounced in association with SA: ~79 % inhibition for state 3 and ~ 62 % for state 4 respiration. Also, either neem alone or in association with SA decreased mitochondrial membrane potential, as well as ROS generation to an extent of 55-20% in the presence of antimycin A and 39-10% in the presence of rotenone; in association with SA, EB decreased ROS at 5, 1 and 0.5 mg/mL. Together with our previous study, these results suggest that neem seeds extract has a protective effect on Rubus fruticosus cells by scavenging, via phenolic compounds, reactive oxygen species generated by SA, thereby decreasing its action as cell death inducer.

Os esteroides anabolizantes androgênicos (EAA) como o decanoato de nandrolona (ND) são hormônios sintéticos derivados da testosterona. Sabe-se que um dos efeitos mais marcantes da administração abusiva destes esteroides é o aumento do comportamento agressivo. Evidências indicam que altas doses de EAA alteram a morfologia e causam hiperativação de sinapses glutamatérgicas, o que se correlaciona com um fenótipo agressivo exacerbado. Fisiologicamente o glutamato é considerado o principal neurotransmissor excitatório no cérebro de mamíferos, entretanto, em níveis elevados, pode causar hiperexcitabilidade neuronal mediada pelos receptores glutamatérgicos ionotrópicos do tipo N-metil-d-aspartato (NMDAr) e, consequentemente alterações no metabolismo mitocondrial. A terminação da sinalização excitatória glutamatérgica é realizada majoritariamente por transportadores existentes em astrócitos. Neste sentido, o transportador astrocitário de glutamato GLT-1 é responsável por mais de 90% da remoção do glutamato da fenda sináptica, contribuindo significativamente, para a manutenção da homeostasis da sinalizacão glutamatérgica. A administração do antibiótico β-lactâmico ceftriaxona (CEF) aumenta a expressão de GLT-1 e diminui a hiperexcitabilidade glutamatérgica, o que poderia potencialmente contrapor mecanismos cerebrais associados ao aumento do fenótipo agressivo induzidos pelo decanoato de nandrolona (ND). Entretanto, estas possíveis interacões moleculares e comportamentais ainda não foram exploradas. Assim, o objetivo primário deste trabalho foi investigar se o aumento da expressão do transportador astrocitário GLT-1 modula mecanismos glutamatérgicos envolvidos na agressividade induzida pelo ND, e a atividade mitocondrial. Para tanto, camundongos CF-1 machos de 60 dias de idade foram divididos em 4 grupos: veículo oleoso (VEH), nandrolona (ND), ceftriaxona (CEF) e nandrolona+ceftriaxona (ND/CEF). A nandrolona foi injetada por via subcutânea (15mg/Kg) por 19 dias. A ceftriaxona (200mg/Kg) ou solução salina foram administradas intraperitonealmente por 5 dias. Após a última injeção foi avaliada a latência para o primeiro ataque e o número de ataques no teste do intruso. Os animais foram sacrificados logo após o teste, e homogeneizados de córtex foram utilizados para imunoquantificação do GLT-1 e da fosforilação da subunidade pNR2Bser1232 do NMDAr. A atividade mitocondrial foi avaliada em sinaptossoma de cérebro total. Os níveis de glutamato foram medidos no líquido cefalorraquidiano. Comparado com o veículo, o tratamento com ND diminuiu significativamente a expressão do GLT-1, aumentou os níveis de glutamato e a expressão da subnidade pNR2Bser1232 o que foi mecanisticamente associado ao aumento do fenótipo agressivo; diminuicão da latência e aumento do número de ataques ao intruso. Ainda, a ND diminuiu o controle respiratório mitocondrial. A administração de CEF aumentou significativamente a expressão do GLT-1 e diminuiu os níveis de glutamato em relação ao grupo ND, enquanto que os níveis de pNR2Bser1232 e a agressividade foram similar ao grupo controle. No grupo ND/CEF o immunoconteúdo de GLT-1 e de pNR2Bser1232, os níveis de glutamato e o fenótipo agressivo, foram significativamente menores que no grupo ND, e similares ao grupo controle. Ainda, a CEF foi capaz de atenuar o prejuízo no controle respiratório mitocondrial causado pela ND. Nossos resultados demonstram que a interação bidirecional entre o transportador astrocitário GLT-1 e a subunidade pNR2Bser1232 neuronal mediada pelo glutamato, exercem um impacto regulatório no fenótipo agressivo induzido pela ND, e no controle respiratório mitocondrial. Desta maneira, este modelo reforça a importância da homeostasia funcional da sinapse tripartide glutamatérgica no fenótipo agressivo. / Anabolic androgenic steroids (AAS) such as nandrolone decanoate (ND) are synthetic hormones derived from testosterone. It is known that one of the most important adverse effects of abusive administration of these steroids is the increase in aggressive behavior. Evidence indicates that high doses of AAS alter morphology and cause hyperactivation of glutamatergic synapses which correlates with an aggressive exacerbated phenotype. Physiologically, glutamate is considered the main excitatory neurotransmitter in the mammalian brain. At high glutamate levels, occurs neuronal hyperexcitability mainly trhough the ionotropic N-methyl-d-aspartate (NMDAr) type of glutamatergic receptors and, consequently, changes in mitochondrial metabolism. Existing transporters in astrocytes predominantly perform the termination of glutamatergic excitatory signaling. In this sense, the GLT-1 glutamate astrocytic transporter is responsible for more than 90% of glutamate removal from the synaptic cleft, contributing significantly to the maintenance of glutamatergic signaling homeostasis. Administration of the β-lactam antibiotic ceftriaxone (CEF) increases GLT-1 expression and decreases glutamatergic hyperexcitability, which could potentially counteract brain mechanisms associated to increased aggressive phenotype mediated by nandrolone decanoate (ND). However, a possible molecular and behavioral interaction has not yet been explored in context. Thus, the primary objective of this work was to investigate whether increased expression of the GLT-1 astrocyte transporter modulates the glutamatergic mechanisms involved in ND-induced aggressive phenotype, and mitochondrial activity. Sixty-day-old male CF-1 mice were divided into 4 groups: oil vehicle (VEH), nandrolone (ND), ceftriaxone (CEF) and nandrolone + ceftriaxone (ND / CEF). Nandrolone was injected subcutaneously (15mg / kg) for 19 days. Ceftriaxone (200mg / kg) or saline solution were administered intraperitoneally for 5 days. After the last injection, the latency for the first attack and the number of attacks on the intruder test were evaluated. The animals were sacrificed after the test, and homogeinized cortex were used for immunoquantification of GLT-1 and phosphorylation of the NMDAr pNR2Bser1232 subunit. Mitochondrial activity was evaluated in total brain sinaptossomes. Glutamate levels were measured in the cerebrospinal fluid. Compared to the vehicle group, treatment with ND significantly decreased the expression of GLT-1, increased glutamate levels and expression of the pNR2Bser1232 which was mechanistically associated with an increase in the aggressive phenotype; decrease in the latency and increase in the number of attacks. Also, ND decreased mitochondrial respiratory control. Administration of CEF significantly increased GLT-1 expression and decreased glutamate levels relative to the ND group, whereas pNR2Bser1232 levels and aggressive phenotype were similar to the control group. In the ND / CEF group the expression of GLT-1 and pNR2Bser1232, glutamate levels and aggressive phenotype were significantly lower than in the ND group, and similar to the control group. Furthermore, CEF was able to attenuate the alteration in the mitochondrial respiratory control caused by ND. Our results demonstrated that the levels of glutamate astrocytic transporter GLT-1 and pNR2Bser1232 are important mechanism behind the increased aggressive phenotype induced by ND, and decreased mitochondrial respiratory control. Also, this model reinforces the importance of glutamate levels and astrocytic molecular targets in the regulation of the aggressive phenotype.

O gene nuclear GAL1 de Saccharomyces cerevisiae codifica uma galactoquinase induzida por galactose e reprimida por glicose. Três evidências indicam que a transcrição de GAL1 é dependente da atividade mitocondrial. Linhagens petite, com deleção no DNA da organela (&#961;-) ou rompimento em gene nuclear, que codifica a farnesil transferase mitocondrial, são incapazes de induzir GAL1. Os inibidores de respiração antimicina-A e azoteto de sódio (NaN3), que atuam, respectivamente, nos complexos III e IV da cadeia de transporte de elétrons, impedem a indução de GAL1. Em células crescidas em glicose ou glicerol, o oligômero formado pela proteína URF13, na presença de metomil, produz um poro na membrana mitocondrial interna que reduz o potencial de membrana &#916;&#936; e os níveis do mRNA de GAL1. A regulação dependente da atividade da mitocôndria ocorre a nível transcricional, pois o gene repórter GUS, sob controle de GAL1, não é induzido na presença de galactose, após tratamento prévio das células com antimicina-A ou NaN3. Mig1p é um repressor que atua diretamente no promotor de GAL1 e inibe a transcrição da galactoquinase. Os resultados obtidos indicam que Mig1p media a repressão da indução de GAL1, na presença do inibidor da cadeia respiratória antimicina-A. / The nuclear gene GAL1 of Saccharomyces cerevisiae encodes a galactokinase induced by galactose and repressed by glucose. Three lines of evidence indicate that expression of GAL1 transcript is dependent on mitochondrial activity. Petite strains in which mitochondrial DNA was partialy deleted (&#961;-) or cells containing a disruption in the nuclear gene COX10, which encodes the mitochondrial farnesil transferase, are unable to induce GAL1. Respiratory inhibitors such as antimycin-A or sodium azide (NaN3), that inhibit complexes III and IV of the electron transport chain, respectively, affect GAL1 induction. Functional expression of the maize protein URF13, which is translocated to the mitochondrial inner membrane, forming a pore that leads to a reduction of the mitochondrial membrane potential &#916;&#936; and reduces the leveis of GAL1 transcripts. Experiments using a heterologous gene fusion showed that the inhibition of GAL1 expresion, by treatment of cells with antimycin-A or NaN3, controls the expression of GAL1 at the transcrptional level. Mig1p is a repressor that binds GAL1 promoter. Our results indicate that Mig1p mediates the represion of GAL1 induction, observed in the presence of the mitochondrial inhibitor antimycin-A.

Nesta tese serão discutidos alguns aspectos químicos, fotoquímicos e fotofísicos importantes no desenvolvimento de fotossensibilizadores para aplicação em terapia fotodinâmica (TFD). Os estudos abrangeram a investigação de 29 espécies, sendo que 20 delas continham um anel porfirínico convencional e 9 eram porfirinas duplamente N-confusas. As primeiras foram sintetizadas para apresentarem diferentes números e tipos de substituintes catiônicos coordenados à posição meso do anel porfirínico, mais especificamente as meso(N-4-piridil)fenilporfirinas e as meso(N-3-piridil)fenilporfirinas contendo um, dois (em trans), dois (em cis), três e quatro grupos [Ru(bipy)2Cl]+ ou CH3+ (figura 1). Em contraste com as porfirinas convencionais. as outras 9 estruturas consistiram das formas protonadas, neutras e desprotonadas de porfirinas que exibem dois anéis pirrólicos adjacentes voltados para fora do anel porfirínico, mais especificamente a base livre (H2N2CP) e os respectivos complexos de prata (AgHN2CP) e de cobre (CuHN2CP). Esta peculiaridade estrutural permite coordenar metais de transição por meio de dois átomos de carbono e dois de nitrogênio, estabilizando fortemente íons metálicos em estados de oxidação anormalmente elevados como Ag3+ e Cu3+. Os dois nitrogênios pirrólicos externos ao anel são susceptíveis tanto a protonação quanto a desprotonação, possibilitando a modulação das propriedades eletrônicas desses compostos por simples alteração no pH do meio. De um modo geral, a acidificação das amostras perturbou mais significativamente suas propriedades fotoquímicas que a desprotonação. Em especial, as espécies neutras metaladas apresentaram bandas bastante intensas na região fototerapêutica de 600 a 750 nm, além de um elevado rendimento quântico de formação de oxigênio singlete (&#934;&#916; &#62; 0,90 para o complexo Ag(III)). Todavia, um processo de fotodecomposição atribuído ao ataque do 1O2 formado, também foi observado. Ambos os processos, &#934;&#916; e fotodecomposição, parecem ser modulados pelo metal coordenado no centro do anel. Tanto a coordenação de Ag(lII) como Cu(lII) aumentou o &#934;&#916;, provavelmente devido ao efeito do metal pesado sobre o cruzamento interssistema. Todavia, verificou-se que o derivado AgHN2CP é muito menos reativo que o CuHN2CP e a base livre. Os motivos deste comportamento ainda não são completamente compreendidos, mas é evidente que o complexo de Ag(lII) apresenta melhores propriedades fotodinâmicas que as demais. Em comparação com as porfirinas duplamente N-confusas, as demais 20 porfirinas catiônicas são muito mais solúveis em água. Neste caso, o enfoque dos experimentos foi direcionado às aplicações biológicas propriamente ditas. Assim, além das propriedades fotofísicas associadas à formação de oxigênio singlete (1O2), também foram exploradas a influência do número dos substituintes periféricos sobre a ligação e danos fotooxidativos provocados em eritrócitos, lipossomos, mitocôndrias e células cancerígenas. Os resultados de &#934;&#916; mostraram ser inversamente proporcionais ao número de cargas positivas, para as porfirínas contendo grupos N-4metilpiridíniom. Estas diferenças foram consistentes com os efeitos de agregação, causados pela formação de dímeros ou oligômeros, no caso das espécies mais hidrofóbicas. Os coeficientes de partição em n-octanol/água (logPOA) corroboraram estes resultados, apresentando uma dependência inversamente proporcional ao número de cargas positivas ou proporcional ao número de resíduos fenila. As eficiências de ligação à bicamada lipídica mitocondrial, lipossomal e celular e os processos de peroxidação lipídica fotoinduzidos mostraram uma dependência proporcional aos valores de logPOA, exceto para as porfirinas contendo complexos de rutênio. O comportamento não linear neste último caso pode estar associada a dissociação da ligação rutênio-porfirina, devido a elevada força iônica das soluções fisiológicas utilizadas. Neste caso, a descoordenação dos complexos periféricos deve promover uma drástica diminuição da solubilidade do composto. Por este motivo os experimentos foram conduzidos somente com as espécies metiladas. No caso, de mitocôndrias isoladas verificou-se que a interação também apresenta uma razoável participação do potencial de membrana. De fato, quando a mitocôodria estava energizada foi observado um acréscimo de 15% no acúmulo da 3P2cMe em comparação com à mitocôndria desacoplada. Para as demais porfirinas houve um menor acúmulo com o aumento do número de resíduos N-3-metilpirídínio. Em todos os experimentos, um comportamento diferenciado foi observado no caso dos isômeros dicatiônicos. A espécie com cargas dispostas nas posições cis (3P2cMe) apresentou praticamente o dobro de eficiência que o correspondente isômero trans (3P2tMe). Este comportamento parece consistente com uma maior penetração da primeira espécie na bicamada lipídica, proporcionado pelo caráter antipático de sua estrutura química. Os resultados apresentados neste estudo mostraram que estas séries de meso-porfirinas catiônicas constituem sistemas bastante interessantes para a compreensão dos efeitos estruturais envolvidos na ação fotodinâmica dos compostos sobre membranas lipídicas, devido à possibilidade de modulação da relação hidrofilicidade/lipofilicidade, sem alterar significativamente a eficiência na formação de 1O2. Além disso, a disposição espacial das cargas positivas na estrutura do fotossensibilizador demonstrou ser extremamente crítica no processo de ancoragem do mesmo na membrana celular ou mitocondrial e consequentemente em causar efeitos fotooxidativos mais eficientemente. As porfirinas contendo grupos 3-metilpiridínio apresentam vantagens sobre as 4-metilpiridínio, normalmente estudas, por serem mais hidrofílicas, terem menor tendência de agregação e possuírem similar atividade fotodinâmica. Em especial, a estrutura anfipática da 3P2cMe associada a sua elevada formação de 1O2 e estabilidade lhe conferem uma interessante potencialidade como agente fototerapêutico. / In this thesis the chemical, photochemical and photophysical relevant aspects for the development of new photosensitizers for photodynamic therapy applications are discussed. 20 conventional porphyrins species and 9 doubly Nconfused porphyrins species were investigated. The first series contains variable number (1 to 4) of cationic groups, [Ru(bipy)2CI]+ or CH3+ (figure 1), bound to the meta or para-pyridil N-atoms of meso-phenylpyridylporphyrins. On the other hand, the protonated, neutral and deprotonated doubly N-confused porphyrins possess two rotated adjacent pyrrol rings, such that they have two coordinating camon atoms. Consequently, transition metal ions in unusually high oxidation states such as Ag(lII) and Cu(lII) can be stabilized by this structure, while the outer pyrrol N-atoms are susceptible to protonation and deprotonation reactions, allowing the modulation of their electronic properties simply by controlling the pH of the solution. In general, the protonation perturbed more significantly the photochemical properties than the deprotonation. The neutral species exhibit intense absorption bands in the phototherapeutical range (600 to 750 nm), associated with a high singlet oxygen sensitization quantum yield (&#934;&#916;&#62; 0,90 for the Ag(lII) complex). Furthermore, a photodecomposition process due to the reaction with 1O2 was also identified. Both &#934;&#916; and photodecomposition are influenced by the metal ion coordinated to the doubly N-confused porphyrin ring. The coordination of Ag(lIl) and Cu(lII) increased &#934;&#916;, probably due to the enhancement of intersystem crossing quantum yield associated with the heavy atom effects. However, AgHN2CP is much more stable than CuHN2CP or the free-base, but the reasons are not clear and should be further investigated. The above results clearly evidence the superior properties of the Ag(lIl) complex as photosensitizer for PDT applications. The 20 cationic pyridylporphyrin derivatives are much soluble in water and experiments directed to biological applications could be carried out. Accordingly, in addition to the quantum yield for singlet oxygen generation(1O2), the effect of the stereochemistry and number and position of the electrically charged substituents on the binding constants and photooxidative damage on erythrocytes, lipossomes, mitochondria and HeLa cells were evaluated. The &#934;&#916; values were constant in the case of the N-3-methylpyridinium derivatives but inversely proportional to the number of positive charges for the N-4-methylpyridinium derivatives. This was assigned to an increase of aggregation of the sensitizers as the number of meso-phenyl rings and the lipophylicity increase. The partition coefficients in n-octanol/water (logPOA) corroborate that assertion showing a linear correlation with increasing of the number of phenyl groups. The binding efficiency towards the mitochondrial, lipossomal and cellular membrane and the photo-induced lipidic peroxidation processes were directly proportional to the logPOA, except for the ruthenated porphyrins. This last behavior may be associated with the dissociation reactions of the rutheniumpyridylporphyrin bond in the physiologic solution. Accordingly, those experiments were carried out only with the methylpyridynium derivatives. For the first time, we showed inequivocally that the interaction of the methyllated porphyrins with mitochondria are significantly influenced by the membrane potential. In fact, when the mitochondria was energized a 15% increase was observed in the binding constants of 3P2cMe in comparison with teh results with decoupled mitochondria. Also, the amount of bond porphyrin sensitizer decreased as the number of methylpyridynium groups was increased, following the same tendency as above. The behavior of the cis (3P2cMe) and trans (3P2tMe) isomers didn\'t follow the general tendency for the other derivatives in a series, such that the binding constants of the cis isomers were always about twice higher than for the trans, which were much higher than predicted by the general behavior. This means that they can associate more strongly and penetrate deeper in the membrane than the more charged porphyrin derivatives. In particular, the cis species is amphiphilic, i.e. possess an adequate structure for that interaction. The results presented in this thesis showed conclusively that the two series of meso-phenylpyridylporphyrins are adequate for the investigation of the effect of the stereochemistry on the bonding ability and photodynamic properties of those photosensitizers. This is particularly true due to the possibility of modulating the ratio between hydrophobicitylhydrophylicity and the stereochemistry without influencing significantly the quantum yield for 1O2 generation. The meta- series showed an advantage over the conventionally used para- series of methylpyridynium porphyrins because it is more soluble and shows lesser tendency to aggregate. In condusion, the amphiphilic 3P2cMe is the species with the highest potentiallity as por sensitizer because of its high binding constants, low tendency to associate and high &#934;&#916;.

Muitos estudos demonstram que a abertura de canais de K+ mitocondriais sensíveis à ATP (mitoKATP) previnem contra danos promovidos por isquemia/reperfusão em coração. Em geral, esta proteção envolve mudanças no estado redox mitocondrial. Em cérebro, sabe-se que agonistas farmacológicos de mitoKATP também protegem em modelo de isquemia/reperfusão. Entretanto, os mecanismos envolvidos na prevenção de danos em cérebro ainda não estão claros. O objetivo principal deste trabalho é compreender os efeitos de canais de K+ mitocondriais ATP-sensíveis em tecido cerebral e os mecanismos pelos quais a sua ativação pode proteger contra danos promovidos por excitotoxicidade, uma das principais conseqüências de um evento isquêmico em cérebro. Neste contexto, demonstramos a proteção pelo mitoKATP em modelo de excitotoxicidade induzida pela ativação direta de receptores NMDA, utilizando cultura de células granulosas de cerebelo. Paralelamente a essa proteção, verificamos que a ativação de mitoKATP reduz a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Em mitocôndrias isoladas, observamos que ROS geradas pela mitocôndria ativam mitoKATP cerebral, resultando em um aumento da captação de K+ para a matriz, medida através da técnica de inchamento mitocondrial. Em condições de baixa geração de ROS, a adição de H2O2 exógeno ativa o inchamento mitocondrial em resposta à entrada de K+ de modo prevenido por catalase, assim, confirmando que a atividade desses canais é redox-sensível. A ativação de mitoKATP por agonistas farmacológicos, como diazóxido, também é maior na presença de alta geração de ROS, conforme indicado por uma leve diminuição no potencial de membrana mitocondrial. Interessantemente, a adição de um redutor tiólico, 2-mercaptopropionilglicina (MPG) previne a ativação de mitoKATP. A ativação de mitoKATP não alterou a capacidade de captar Ca2+ pela mitocôndria, demonstrando que este não é o mecanismo pelo qual esses canais previnem morte celular excitotóxica. Não foram observados efeitos desses canais em modelo de excitotoxicidade in vivo e em modelo de doença neurodegenerativa, acidose metilmalônica. Juntos, nossos resultados demonstram que mitoKATP cerebrais agem como sensores de ROS mitocondrial, que quando ativados reduzem a liberação de ROS por um leve desacoplamento, prevenindo morte neuronal por excitotoxicidade NMDA-induzida / Several studies have shown that mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening prevents ischemia/reperfusion injuries in heart, in a manner involving changes in redox state. In brain, mitoKATP agonists also protect against ischemia/reperfusion. However, the exactly mechanism that mitoKATP protects the brain is still unclear. The purpose of this work is to understand the effects of mitochondrial ATP-sensitive K+ channels in brain and how this channel can protect against excitotoxic cell death, the main consequence of a cerebral ischemia. In this context, we demonstrate that mitoKATP protects against excitotoxicity promoted by NMDA receptor activation in cultured cerebellar granule cells. In paralell, we verified that mitoKATP activation also decreases reactive oxygen species (ROS). In isolated mitochondria, we observed that mitochondrially-generated ROS can activate brain mitoKATP, resulting in enhanced K+ uptake into the matrix, measured as swelling of the organelle. Under conditions in which mitochondrial ROS release is low, exogenous H2O2 activated swelling secondary to K+ entrance, in a manner prevented by catalase, confirming that the activity of this channel is redox-sensitive. Activation of mitoKATP channels by the pharmacological agonist diazoxide was also improved when endogenous mitochondrial ROS release was enhanced, as indicated by mild decreases in mitochondrial membrane potentials. Interessantly, mitoKATP activation was preveted by the thiol reductant 2-mercaptopropionylglycine (MPG). Mitochondrial Ca2+ uptake was not modified by opening mitoKATP, suggesting that this is not the mechanism through which this channel prevents excitotoxic cell death. In an in vivo excitotoxicity model and also neurodegenerative disease model, methylmalonic acidemia, the effects of mitoKATP agonists were not observed. Together, our results demonstrate that brain mitoKATP acts as a mitochondrial ROS sensor, which, when activated, prevents ROS release by mildly uncoupling respiration from oxidative phosphorylation, decreasing excitotoxic cell death