Submitted by PMBqBM null (pmbqbm@ufba.br) on 2017-05-10T15:05:17Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Short Ferreira_PMBqBM-UFBA.pdf: 1518060 bytes, checksum: cccc6bd7647121b1ae8a81b5c9c1943a (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-03T15:02:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Short Ferreira_PMBqBM-UFBA.pdf: 1518060 bytes, checksum: cccc6bd7647121b1ae8a81b5c9c1943a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-03T15:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Short Ferreira_PMBqBM-UFBA.pdf: 1518060 bytes, checksum: cccc6bd7647121b1ae8a81b5c9c1943a (MD5) / FAPESB / Rutina é um flavonoide glicosilado que apresenta diversas atividades biológicas incluindo anti-inflamatória, antitumoral e efeitos farmacológicos promissores no sistema nervoso central (SNC). A morte neuronal induzida por excitotoxicidade glutamatérgica está presente em diversas doenças e envolve diversas alterações celulares, incluindo danos mitocondriais. Para prevenir a excitotoxicidade, o glutamato é removido pelos astrócitos e convertido em L-glutamina, através da ação da glutamina sintetase (GS). O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos neuroprotetores da rutina com vistas na proteção mitocondrial e modulação de proteínas envolvidas na detoxificação do excedente de glutamato pelos astrócitos.. Estudos de efeitos neuroprotetores foram realizados em dois modelos de estudo do SNC: culturas organotípicas de cérebro de ratos Wistar neonatos (P8) expostas ao glutamato (60 mM) por 24 h, concomitantemente a tratamento com rutina (0.5 – 1μM) e culturas primárias mistas de células isoladas do cerebelo de ratos Wistar (P8) expostas ao glutamato (10 mM) por 24 h e iniciado 4 h antes do tratamento com rutina (0,5 μM). A viabilidade celular e os níveis de expressão de GS, de GLAST e de GLT1 em cultura organotípica cortical foram avaliados por captação de Iodeto de Propídio (IP) e Western blotting, respectivamente. A viabilidade neuronal em culturas primárias de cerebelo foi avaliada por coloração com Fluoro-Jade B. Além disso, a proteção mitocondrial pela rutina foi avaliada através do potencial de membrana e análise de produção ERO, usando safranina O e Amplex Red como sondas, respectivamente, em mitocôndrias isoladas a partir do encéfalo de ratos Wistar adultos expostas à rotenona. Na cultura organotípica, os nossos resultados mostraram que o glutamato (60 mM) induziu o aumento da intensidade de fluorescência relativa ao IP incorporado, que foram reduzidos em tratamentos com 0,5 μM e 1 μM de rutina. Ainda, foi demonstrado que rutina induziu aumento na expressão de GS e GLAST em tratamentos concomitantes com glutamato. Em culturas primárias de cerebelo, os nossos resultados mostraram que o glutamato (10 mM) induziu o aumento no número de células Fluoro-Jade B positivas, que não foi reduzido por pós-tratamento com rutina (0,5 μM). Em mitocôndrias isoladas observamos que a rutina (10 μM) reduziu a dissipação do potencial de membrana e reduziu a produção de ERO. Conclui-se que a rutina é um agente neuroprotetor com potencial para prevenir a excitotoxicidade induzida por glutamato e sugere-se que esse efeito envolve proteção mitocondrial e regulação do metabolismo do glutamato por astrócitos. No entanto, mais estudos são cruciais, a fim de elucidar o mecanismo molecular de neuroproteção induzida por rutina contra danos causados por glutamato e compreender o papel das células gliais, especialmente astrócitos na bioatividade de rutina.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-05-26T15:08:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Rafael Short Ferreira.pdf: 1518060 bytes, checksum: cccc6bd7647121b1ae8a81b5c9c1943a (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-26T15:08:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Rafael Short Ferreira.pdf: 1518060 bytes, checksum: cccc6bd7647121b1ae8a81b5c9c1943a (MD5) / Rutina é um flavonoide glicosilado que apresenta diversas atividades biológicas incluindo anti-inflamatória, antitumoral e efeitos farmacológicos promissores no sistema nervoso central (SNC). A morte neuronal induzida por excitotoxicidade glutamatérgica está presente em diversas doenças e envolve diversas alterações celulares, incluindo danos mitocondriais. Para prevenir a excitotoxicidade, o glutamato é removido pelos astrócitos e convertido em L-glutamina, através da ação da glutamina sintetase (GS). O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos neuroprotetores da rutina com vistas na proteção mitocondrial e modulação de proteínas envolvidas na detoxificação do excedente de glutamato pelos astrócitos.. Estudos de efeitos neuroprotetores foram realizados em dois modelos de estudo do SNC: culturas organotípicas de cérebro de ratos Wistar neonatos (P8) expostas ao glutamato (60 mM) por 24 h, concomitantemente a tratamento com rutina (0.5 – 1 μM) e culturas primárias mistas de células isoladas do cerebelo de ratos Wistar (P8) expostas ao glutamato (10 mM) por 24 h e iniciado 4 h antes do tratamento com rutina (0,5 μM). A viabilidade celular e os níveis de expressão de GS, de GLAST e de GLT1 em cultura organotípica cortical foram avaliados por captação de Iodeto de Propídio (IP) e Western blotting, respectivamente. A viabilidade neuronal em culturas primárias de cerebelo foi avaliada por coloração com Fluoro-Jade B. Além disso, a proteção mitocondrial pela rutina foi avaliada através do potencial de membrana e análise de produção ERO, usando safranina O e Amplex Red como sondas, respectivamente, em mitocôndrias isoladas a partir do encéfalo de ratos Wistar adultos expostas à rotenona. Na cultura organotípica, os nossos resultados mostraram que o glutamato (60 mM) induziu o aumento da intensidade de fluorescência relativa ao IP incorporado, que foram reduzidos em tratamentos com 0,5 μM e 1 μM de rutina. Ainda, foi demonstrado que rutina induziu aumento na expressão de GS e GLAST em tratamentos concomitantes com glutamato. Em culturas primárias de cerebelo, os nossos resultados mostraram que o glutamato (10 mM) induziu o aumento no número de células Fluoro-Jade B positivas, que não foi reduzido por pós-tratamento com rutina (0,5 μM). Em mitocôndrias isoladas observamos que a rutina (10 μM) reduziu a dissipação do potencial de membrana e reduziu a produção de ERO. Conclui-se que a rutina é um agente neuroprotetor com potencial para prevenir a excitotoxicidade induzida por glutamato e sugere-se que esse efeito envolve proteção mitocondrial e regulação do metabolismo do glutamato por astrócitos. No entanto, mais estudos são cruciais, a fim de elucidar o mecanismo molecular de neuroproteção induzida por rutina contra danos causados por glutamato e compreender o papel das células gliais, especialmente astrócitos na bioatividade de rutina.

Orientador: Lília Freira Rodrigues de Souza Li / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_PaulaHespanholo_M.pdf: 1475049 bytes, checksum: f1ec759ca189c1e3404667fb1ce01abc (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A esclerose hipocampal está associada à epilepsia de lobo temporal medial (ELT) e causa expressão alterada de receptores tais como o Receptor Metabotrópico de Glutamato (mGluR1). Contudo, ainda há controvérsias se sua expressão está aumentada ou diminuída em ELT. O Receptor Sensor de Cálcio (CASR), outro receptor da mesma família do mGluR1, é expresso em hipocampo, mas seu papel no cérebro ainda é desconhecido. VILIP-1 é uma proteína sensora de cálcio neuronal (NCS) expressa predominantemente no cérebro e em humanos e sua expressão foi mapeada por imunoistoquímica na subpopulação de neurônios piramidais em CA1 e CA4 de hipocampo. Sugere-se também que a ativação de mGluR possa regular a expressão de VILIP-1 durante a plasticidade hipocampal. No entanto, não há estudos associando VILIP-1 e esclerose hipocampal. Nós hipotetizamos que além do mGluR1, o CASR e o VILIP-1 estão associados a esclerose hipocampal em ELT. O objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de expressão de VILIP-1, CASR e mGluR1, em hipocampo de pacientes com ELT submetidos a amigdalohipocampectomia. Nossos resultados demonstraram a presença de EH nos tecidos hipocampais de pacientes com ELT com redução no número de neurônios em CA1 e presença de intensa gliose. Pela análise da expressão dos transcritos VILIP-1, CASR e mGluR1 em hipocampo total utilizando PCR em tempo real não encontramos diferença na expressão dos RNAs mensageiros dos pacientes quando comparado com os controles. Entretanto, quando comparamos a expressão protéica em hipocampo de pacientes e controles, utilizando o método de imunoistoquímica, encontramos não somente redução significativa no número de neurônios presentes em CA1 de pacientes, mas também redução importante nos neurônios positivamente marcados para VILIP-1, CASR e mGluR1. Estes achados sugerem que não apenas mGluR1, mas também CASR e VILIP-1, estão associados à EH em pacientes com ELT / Abstract: Hippocampal sclerosis (HS) is associated to temporal lobe epilepsy (TLE) and cause altered expression of neurotransmitter receptors such as metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1). However, whether its expression level is increased or decreased in temporal lobe epilepsy is still controversial. Calcium-sensing receptor (CASR), another receptor from the same family of mGluR1, is expressed in hippocampus, but its role in brain is unknown. VILIP-1, a neuronal calcium sensing protein (NCS) is expressed predominantly in brain and in humans its expression was identified by immunohistochemistry in subpopulations of pyramidal neurons in CA1 and CA4 in hippocampus. Activation of mGluR1 is suggested that may regulates VILIP-1 expression during hippocampal plasticity. However, there are no studies associating VILIP-1 and hippocampal sclerosis. We hypothesized that not only mGluR1 but also VILIP and CASR is involved in hippocampal sclerosis in TLE patients. The objective of this study was to analyze the pattern of expression of VILIP-1, CASR and mGluR1 in hippocampal tissues from patients with TLE who underwent amygdalohippocampectomy. Our results demonstrated the presence of hippocampal sclerosis in hippocampal tissues in patients with TLE with reduction in the number of neurons in CA1 and gliosis. By the expression analysis of the transcripts of VILIP-1, CASR and mGluR1 in total hippocampus using real time PCR, we did not find differences on mRNAS expression of patients compared with controls. However, when we compared the protein expression from hippocampi from patients with controls, by immunohistochemistry, we not only found an important reduction on neuron cell number in patients, but also an important reduction on positively stained neurons for VILIP-1, CASR and mGluR1, suggesting that not only mGluR1, but also CASR and VILIP1 are associated to HS in patients with TLE / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Para um adequado funcionamento do SNC, são necessárias complexas interações entre os sistemas de neurotransmissão inibitório e excitatório. Desequilíbrios nos sistemas, e/ou na sua interação, podem acarretar comprometimentos neuropsiquiátricos. Várias etapas do desenvolvimento ontogenético cerebral, incluindo proliferação e migração neuronal, crescimento cerebral e mielinização, astrocitogênese e morte celular programada, são alteradas pela desnutrição protéica. Alterações no sistema glutamatérgico decorrentes de desnutrição, padrões de desenvolvimento afetados no sistema GABAérgico como a atividade da glutamato descarboxilase (GAD) e mRNA de subunidades de receptores GABAA , alterações nas reações a fármacos envolvendo o sistema GABAérgico, além de estudos epidemiológicos que apontam para a maior incidência de doenças neuropsiquiátricas em populações desnutridas precocemente e, ainda, os transtornos nas complexas interações entre células neuronais e gliais, que acompanham o desenvolvimento destas patologias, levantam questionamentos sobre as implicações da desnutrição sobre o metabolismo cerebral e parâmetros inibitórios e excitatórios sob condições de excitotoxicidade. Considerando estes aspectos, investigou-se a sensibilidade a drogas convulsivantes agindo sobre os sistemas glutamatérgico (ácido quinolínico) e GABAérgico (picrotoxina), assim como se procurou detectar interferências provocadas pela desnutrição protéica gestacional e pós-natal, e/ou drogas em um dos parâmetros, que, além da biossíntese, liberação, interação com receptores, determina uma neurotransmissão eficiente, qual seja: na inativação dos dois principais neurotransmissores excitatório e inibitório, glutamato e GABA, respectivamente, por meio da captação mediada por transportadores localizados nas membranas neuronais e gliais de córtex e hipocampo de ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A sensibilidade à picrotoxina foi avaliada ainda segundo parâmetros metabólicos, envolvendo o metabolismo da glicose e do acetato, procurando detectar interações neurônio-glia na resposta à droga, assim como a ocorrência de peroxidação lipídica, dado o seu envolvimento no processo convulsivante. Considerando que o acetato é metabolizado predominantemente pelos astrócitos, células que têm importante papel no fluxo de substratos energéticos aos neurônios, a sua oxidação foi avaliada em fatias de córtex cerebral de ratos adultos, frente a diferentes concentrações extracelulares de potássio. A desnutrição acarretou menor sensibilidade à ação convulsivante do ácido quinolínico, em ratos de 25 dias de idade, excluindo alterações na captação de glutamato como mecanismo envolvido, uma vez que este parâmetro não foi afetado pela desnutrição e/ou droga. Contrariamente, a desnutrição induziu maior sensibilidade à ação convulsivante da picrotoxina, em ratos de 25 dias, o que pode estar relacionado à maior captação de GABA por fatias de córtex cerebral e hipocampo evidenciadas no grupo desnutrido. A desnutrição alterou o perfil ontogenético da captação de GABA por fatias de córtex cerebral e também o perfil inibitório da β-alanina (inibidor de GAT-3), dando suporte à hipótese de que a maior captação de GABA em ratos desnutridos em desenvolvimento seja devida predominantemente a este transportador. A maior sensibilidade à picrotoxina no grupo desnutrido também foi evidenciada pelo maior estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex cerebral (que também é idade dependente) e peroxidação lipídica. Enquanto em ratos imaturos a administração de uma única dose de picrotoxina mostrou a maior susceptibilidade de ratos desnutridos, no procedimento de “kindling” químico pela picrotoxina em ratos em desenvolvimento, a susceptibilidade mostrou-se sexo e tratamento nutricional dependente. A picrotoxina estimulou a oxidação do acetato a CO2, mas não a da glicose em período precoce pós picrotoxina (24 horas) em fatias de córtex e hipocampo de ratos de 25 dias, indicando o envolvimento astrocitário na resposta ao agente convulsivante, independente do tratamento nutricional. A administração crônica de picrotoxina acarretou estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex de ratos desnutridos, mostrando efeito tempo e tratamento nutricional-dependente sobre o metabolismo da glicose, sem alteração da oxidação do acetato. Altas concentrações de potássio extracelular aumentaram a oxidação do acetato em fatias de córtex cerebral, em função da redução intracelular de sódio em ratos controle e desnutridos adultos; o agravamento do déficit nutricional exacerbou a oxidação do acetato em fatias de cerebelo. A desnutrição pré e pós-natal afeta respostas envolvendo os sistemas GABAérgico e glutamatérgico em situações de excitotoxicidade, provocada por antagonista de receptor GABAA, picrotoxina e por hiperestimulador do sistema glutamatérgico, ácido quinolínico, em ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A severidade da restrição nutricional é fator determinante da exacerbação do estímulo à oxidação do acetato. Além do mais, a desnutrição parece afetar a interação neurônio-glia em condições de excitotoxicidade.

Para um adequado funcionamento do SNC, são necessárias complexas interações entre os sistemas de neurotransmissão inibitório e excitatório. Desequilíbrios nos sistemas, e/ou na sua interação, podem acarretar comprometimentos neuropsiquiátricos. Várias etapas do desenvolvimento ontogenético cerebral, incluindo proliferação e migração neuronal, crescimento cerebral e mielinização, astrocitogênese e morte celular programada, são alteradas pela desnutrição protéica. Alterações no sistema glutamatérgico decorrentes de desnutrição, padrões de desenvolvimento afetados no sistema GABAérgico como a atividade da glutamato descarboxilase (GAD) e mRNA de subunidades de receptores GABAA , alterações nas reações a fármacos envolvendo o sistema GABAérgico, além de estudos epidemiológicos que apontam para a maior incidência de doenças neuropsiquiátricas em populações desnutridas precocemente e, ainda, os transtornos nas complexas interações entre células neuronais e gliais, que acompanham o desenvolvimento destas patologias, levantam questionamentos sobre as implicações da desnutrição sobre o metabolismo cerebral e parâmetros inibitórios e excitatórios sob condições de excitotoxicidade. Considerando estes aspectos, investigou-se a sensibilidade a drogas convulsivantes agindo sobre os sistemas glutamatérgico (ácido quinolínico) e GABAérgico (picrotoxina), assim como se procurou detectar interferências provocadas pela desnutrição protéica gestacional e pós-natal, e/ou drogas em um dos parâmetros, que, além da biossíntese, liberação, interação com receptores, determina uma neurotransmissão eficiente, qual seja: na inativação dos dois principais neurotransmissores excitatório e inibitório, glutamato e GABA, respectivamente, por meio da captação mediada por transportadores localizados nas membranas neuronais e gliais de córtex e hipocampo de ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A sensibilidade à picrotoxina foi avaliada ainda segundo parâmetros metabólicos, envolvendo o metabolismo da glicose e do acetato, procurando detectar interações neurônio-glia na resposta à droga, assim como a ocorrência de peroxidação lipídica, dado o seu envolvimento no processo convulsivante. Considerando que o acetato é metabolizado predominantemente pelos astrócitos, células que têm importante papel no fluxo de substratos energéticos aos neurônios, a sua oxidação foi avaliada em fatias de córtex cerebral de ratos adultos, frente a diferentes concentrações extracelulares de potássio. A desnutrição acarretou menor sensibilidade à ação convulsivante do ácido quinolínico, em ratos de 25 dias de idade, excluindo alterações na captação de glutamato como mecanismo envolvido, uma vez que este parâmetro não foi afetado pela desnutrição e/ou droga. Contrariamente, a desnutrição induziu maior sensibilidade à ação convulsivante da picrotoxina, em ratos de 25 dias, o que pode estar relacionado à maior captação de GABA por fatias de córtex cerebral e hipocampo evidenciadas no grupo desnutrido. A desnutrição alterou o perfil ontogenético da captação de GABA por fatias de córtex cerebral e também o perfil inibitório da β-alanina (inibidor de GAT-3), dando suporte à hipótese de que a maior captação de GABA em ratos desnutridos em desenvolvimento seja devida predominantemente a este transportador. A maior sensibilidade à picrotoxina no grupo desnutrido também foi evidenciada pelo maior estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex cerebral (que também é idade dependente) e peroxidação lipídica. Enquanto em ratos imaturos a administração de uma única dose de picrotoxina mostrou a maior susceptibilidade de ratos desnutridos, no procedimento de “kindling” químico pela picrotoxina em ratos em desenvolvimento, a susceptibilidade mostrou-se sexo e tratamento nutricional dependente. A picrotoxina estimulou a oxidação do acetato a CO2, mas não a da glicose em período precoce pós picrotoxina (24 horas) em fatias de córtex e hipocampo de ratos de 25 dias, indicando o envolvimento astrocitário na resposta ao agente convulsivante, independente do tratamento nutricional. A administração crônica de picrotoxina acarretou estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex de ratos desnutridos, mostrando efeito tempo e tratamento nutricional-dependente sobre o metabolismo da glicose, sem alteração da oxidação do acetato. Altas concentrações de potássio extracelular aumentaram a oxidação do acetato em fatias de córtex cerebral, em função da redução intracelular de sódio em ratos controle e desnutridos adultos; o agravamento do déficit nutricional exacerbou a oxidação do acetato em fatias de cerebelo. A desnutrição pré e pós-natal afeta respostas envolvendo os sistemas GABAérgico e glutamatérgico em situações de excitotoxicidade, provocada por antagonista de receptor GABAA, picrotoxina e por hiperestimulador do sistema glutamatérgico, ácido quinolínico, em ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A severidade da restrição nutricional é fator determinante da exacerbação do estímulo à oxidação do acetato. Além do mais, a desnutrição parece afetar a interação neurônio-glia em condições de excitotoxicidade.

Para um adequado funcionamento do SNC, são necessárias complexas interações entre os sistemas de neurotransmissão inibitório e excitatório. Desequilíbrios nos sistemas, e/ou na sua interação, podem acarretar comprometimentos neuropsiquiátricos. Várias etapas do desenvolvimento ontogenético cerebral, incluindo proliferação e migração neuronal, crescimento cerebral e mielinização, astrocitogênese e morte celular programada, são alteradas pela desnutrição protéica. Alterações no sistema glutamatérgico decorrentes de desnutrição, padrões de desenvolvimento afetados no sistema GABAérgico como a atividade da glutamato descarboxilase (GAD) e mRNA de subunidades de receptores GABAA , alterações nas reações a fármacos envolvendo o sistema GABAérgico, além de estudos epidemiológicos que apontam para a maior incidência de doenças neuropsiquiátricas em populações desnutridas precocemente e, ainda, os transtornos nas complexas interações entre células neuronais e gliais, que acompanham o desenvolvimento destas patologias, levantam questionamentos sobre as implicações da desnutrição sobre o metabolismo cerebral e parâmetros inibitórios e excitatórios sob condições de excitotoxicidade. Considerando estes aspectos, investigou-se a sensibilidade a drogas convulsivantes agindo sobre os sistemas glutamatérgico (ácido quinolínico) e GABAérgico (picrotoxina), assim como se procurou detectar interferências provocadas pela desnutrição protéica gestacional e pós-natal, e/ou drogas em um dos parâmetros, que, além da biossíntese, liberação, interação com receptores, determina uma neurotransmissão eficiente, qual seja: na inativação dos dois principais neurotransmissores excitatório e inibitório, glutamato e GABA, respectivamente, por meio da captação mediada por transportadores localizados nas membranas neuronais e gliais de córtex e hipocampo de ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A sensibilidade à picrotoxina foi avaliada ainda segundo parâmetros metabólicos, envolvendo o metabolismo da glicose e do acetato, procurando detectar interações neurônio-glia na resposta à droga, assim como a ocorrência de peroxidação lipídica, dado o seu envolvimento no processo convulsivante. Considerando que o acetato é metabolizado predominantemente pelos astrócitos, células que têm importante papel no fluxo de substratos energéticos aos neurônios, a sua oxidação foi avaliada em fatias de córtex cerebral de ratos adultos, frente a diferentes concentrações extracelulares de potássio. A desnutrição acarretou menor sensibilidade à ação convulsivante do ácido quinolínico, em ratos de 25 dias de idade, excluindo alterações na captação de glutamato como mecanismo envolvido, uma vez que este parâmetro não foi afetado pela desnutrição e/ou droga. Contrariamente, a desnutrição induziu maior sensibilidade à ação convulsivante da picrotoxina, em ratos de 25 dias, o que pode estar relacionado à maior captação de GABA por fatias de córtex cerebral e hipocampo evidenciadas no grupo desnutrido. A desnutrição alterou o perfil ontogenético da captação de GABA por fatias de córtex cerebral e também o perfil inibitório da β-alanina (inibidor de GAT-3), dando suporte à hipótese de que a maior captação de GABA em ratos desnutridos em desenvolvimento seja devida predominantemente a este transportador. A maior sensibilidade à picrotoxina no grupo desnutrido também foi evidenciada pelo maior estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex cerebral (que também é idade dependente) e peroxidação lipídica. Enquanto em ratos imaturos a administração de uma única dose de picrotoxina mostrou a maior susceptibilidade de ratos desnutridos, no procedimento de “kindling” químico pela picrotoxina em ratos em desenvolvimento, a susceptibilidade mostrou-se sexo e tratamento nutricional dependente. A picrotoxina estimulou a oxidação do acetato a CO2, mas não a da glicose em período precoce pós picrotoxina (24 horas) em fatias de córtex e hipocampo de ratos de 25 dias, indicando o envolvimento astrocitário na resposta ao agente convulsivante, independente do tratamento nutricional. A administração crônica de picrotoxina acarretou estímulo à oxidação da glicose em fatias de córtex de ratos desnutridos, mostrando efeito tempo e tratamento nutricional-dependente sobre o metabolismo da glicose, sem alteração da oxidação do acetato. Altas concentrações de potássio extracelular aumentaram a oxidação do acetato em fatias de córtex cerebral, em função da redução intracelular de sódio em ratos controle e desnutridos adultos; o agravamento do déficit nutricional exacerbou a oxidação do acetato em fatias de cerebelo. A desnutrição pré e pós-natal afeta respostas envolvendo os sistemas GABAérgico e glutamatérgico em situações de excitotoxicidade, provocada por antagonista de receptor GABAA, picrotoxina e por hiperestimulador do sistema glutamatérgico, ácido quinolínico, em ratos em desenvolvimento, assim como parâmetros ontogenéticos ligados ao transporte de GABA. A severidade da restrição nutricional é fator determinante da exacerbação do estímulo à oxidação do acetato. Além do mais, a desnutrição parece afetar a interação neurônio-glia em condições de excitotoxicidade.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Hiroaki Kihara / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2016. / Anóxia é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade neonatal, especialmente em neonatos pré-maturos, constituindo um importante problema de saúde pública devido às sequelas neurológicas permanentes em pacientes. A privação de oxigênio dispara uma série de cascatas, culminando em morte celular em regiões cerebrais mais vulneráveis, como o hipocampo. Neste processo de morte celular causada pela privação de oxigênio, o cálcio citosólico possui um papel crucial. Receptores intracelulares de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs) são importantes reguladores de níveis de deste cálcio, no entanto, não se sabe sobre sua função na anóxia. O objetivo deste estudo é analisar se os IP3Rs do tipo 1 (IP3R1) participam no processo de morte no hipocampo de ratos após a anóxia neonatal. A análise quantitativa de real-time PCR revelou uma diminuição da expressão gênica de IP3R1 24 horas após a anóxia neonatal. Na análise da distribuição de células IP3R1-positivas foi observada uma densidade de IP3R1 na região de CA1 em ambos os grupos, porém, não se observou diferença entre os grupos controle e anóxia. Interessantemente os animais anóxia apresentaram uma alta colocalização de IP3R1 e marcador de núcleo (DAPI), sugerindo que a anóxia causa uma translocação de IP3R1 para o núcleo nas células hipocampais. Além disso, o padrão de marcação mostrou diferentes tamanhos de clusters dos receptores, indicando uma organização diferente entre os grupos. Foi injetado 2-APB, um bloqueador de IP3R1, ou veículo, no hipocampo de forma bilateral após a anóxia. Foi utilizado metodologias de marcação de células degeneradas e foi visto que no grupo 2APB houve uma diminuição do número de células FJC-positivas e TUNEL-positivas em comparação ao grupo veículo anóxia. Porém, não foi observado nenhuma diferença de marcação entre os grupos na imunofluorescência de caspase-3 ativada. Não foi detectada nenhuma diferença entre os grupos no teste de labirinto de Barnes. No teste de campo aberto, observou-se que o grupo 2APB apresentam maiores níveis de ansiedade. Desta forma, este estudo pode contribuir com novas perspectivas na investigação de mecanismos de neurodegeneração ativadas pela privação de oxigênio. / Anoxia is one of the most prevalent causes of neonatal morbidity and mortality, especially in preterm neonates, constituting an important public health problem due to permanent neurological sequelae observed in patients. Oxygen deprivation triggers a series of simultaneous cascades, culminating in cell death mainly located in more vulnerable metabolic brain regions, such as the hippocampus. In the process of cell death by oxygen deprivation, cytosolic calcium plays crucial roles. Intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP3Rs) are important regulators of cytosolic calcium levels, although the role of these receptors in neonatal anoxia is completely unknown. This study focused on the functional role of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 (IP3R1) in rat hippocampus after neonatal anoxia. Quantitative real-time PCR analysis revealed a decrease of IP3R1 gene expression 24 hours after neonatal anoxia. Distribution analysis of IP3R-positive cells was performed and we observed higher IP3R1 pixels quantity in CA1 of both groups; however, we were not able to observe alterations between control and anoxia animals. Interestingly, we observed that anoxia animals present a higher colocalization of IP3R1 and nucleus marker (DAPI), suggesting that neonatal anoxia may cause IP3R1 translocation to the nucleus in hippocampal cells. Furthermore, puncta-labelling pattern showed different cluster sizes, larger in control group, indicating different organization between groups. We injected 2-APB, an IP3R1 blocker, or vehicle in hippocampus bilaterally after anoxia. Labelling techniques of degenerate cells was performed and we observed that 2APB group decrease the number of FJC-positive cells compared to vehicle anoxia group. In contrast, TUNEL labelling and active caspase-3 immunofluorescence showed no difference between groups. Barnes maze test showed no differences between 2APB group and anoxia vehicle group. On the other hand, the open field test showed that 2APB group presents higher anxiety levels than vehicle group. In this way, this study may contribute to new perspectives in the investigation of neurodegenerative mechanisms triggered by oxygen deprivation.

Orientadores: Fabio Rogério, Carlos Amilcar Parada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ignarro_RaffaelaSilvestre_M.pdf: 3644274 bytes, checksum: 6e13f812b2d525e18878656d3ec27815 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A injeção de ácido quinolínico (AQ), um agonista glutamatérgico do receptor N-metil-D-aspartato, no estriado de roedores induz morte seletiva de neurônios espinhosos médios, gliose reativa e neurogênese na zona subventricular, acompanhada da migração dos neurônios recém-gerados para o estriado lesado. Tais achados são também descritos na doença de Huntington (DH). Há indícios de que a via de sinalização JAK/STAT esteja envolvida no mecanismo de ação do AQ, bem como na patogênese da DH. A interação das citocinas da família da IL-6 com seus receptores desencadeia a ativação de enzimas da família das Janus-Quinases (JAKs), que por sua vez permitem o recrutamento e a ativação de fatores de transcrição da família das proteínas transdutoras de sinais e ativadoras da transcrição (STATs). Embora as principais características da DH sejam a presença da coréia e déficits na execução de movimentos voluntários, poucos testes são realizados abordando o comportamento locomotor dos animais no modelo de lesão por AQ. Neste trabalho, estudamos o efeito do AG490, um inibidor da JAK2, na gliose, perda neuronal e neurogênese no estriado de camundongos adultos C57BL/6J após a administração estereotáxica unilateral de AQ (30nmol). Imediatamente após a lesão, os animais receberam uma injeção subcutânea de AG490 (10mg/kg) ou veículo (PBS+DMSO), e injeções diárias por 6 dias adicionais. Além disso, investigamos o possível efeito da lesão por AQ na atividade física voluntária diária (AFVD) em rodas de atividade. A distância percorrida pelos camundongos foi monitorada por 28 dias após a injeção unilateral de QA (30nmol) ou PBS no estriado. Cortes coronais do cérebro (40?m) obtidos em criostato foram utilizados para quantificação de neurônios por estereologia e para a análise de expressão protéica, através de imunoistoquímica e Western Blotting para GFAP e doublecortina, marcadores de gliose e neuroblastos, respectivamente. A área total de células doublecortina-positivas (ACDP) e o número de neurônios (NN) no lado lesado (L) e contralateral à lesão (CL) foram avaliados. O Índice de Neurogênese (IN=ACDP(L)/ACDP(CL)) e o Índice de Sobrevivência Neuronal (ISN=NN(L)/NN(CL)) foram calculados. Após a administração de AQ, o estriado ipsilateral apresentou intensa gliose e células doublecortina positivas com características de células migratórias. O Western Blotting para GFAP mostrou uma redução ipsilateral de 19% nos animais tratados com AG490, em comparação aos animais do grupo tratado apenas com veículo (0.82±0.05; 1.010±0.06, n=9, p<0.05). O ISN foi 25% maior nos camundongos que receberam AG490 em comparação aos animais controles (0.75 ± 0.07; 0.60 ± 0.03; n=8, p<0.05). O IN mostrou uma diminuição de 21% no grupo AG490 em relação ao grupo de animais tratados apenas veículo de diluição (1.08±0.06; 1.37±0.09, n=5, p<0.05). A AFVD média, medida em quilômetros por dia, não se alterou nos animais que receberam injeção intra-estriatal de QA (30nmol) em comparação aos animais do grupo controle (3.97±0.34; 3.90±0.21, n=8, p>0.05). Portanto, nossos resultados suportam um papel para a JAK2 na morte neuronal, gliose, e neurogênese estriatais após lesão com AQ. O tratamento com o inibidor AG490 causou neuroproteção e diminuição da gliose, sugerindo que a reação astrocitária pode prejudicar a sobrevivência neuronal neste modelo experimental / Abstract: Injection of quinolinic acid (QA), a N-methyl-D-aspartate receptor agonist, in murine striatum induces death of medium spiny neurons, gliosis and neurogenesis in the subventricular zone with migration of newly synthesized neurons to damaged striatum. Such findings are also described in Huntington's disease (HD). The Janus-kinase (JAK) pathway would take part in QA mechanism of action and HD pathogenesis as well. The interaction of interleukin-6 family of cytokines with its receptor triggers the activation of enzymes of the family of JAKs, which in turn allow the recruitment and activation of transcription factors, known as signal transducers and activators of transcription (STATs). Although the main features of HD are the presence of chorea and deficits in performing voluntary movements, few tests are realized regarding locomotor behavioral on QA model. We studied the effect of AG490, an inhibitor of JAK isoform 2 (JAK2), on gliosis, neuronal loss and neurogenesis in the striatum of adult C57BL/6J mice after unilateral estereotaxic administration of QA (30 nmol). Immediately after injury, animals received a subcutaneous injection of AG490 (10 mg/kg) or vehicle (PBS + DMSO), and then once daily injections for 6 days. Furthermore, in a parallel experiment, we investigated the possible effect of the lesion by AQ on the voluntary daily physical activity (VDPA) in running wheels. The distance traveled by mice was monitored daily for 28 days after unilateral injection of QA (30 nmol) or PBS into the striatum. Frozen brain sections (40?m) were used for neuronal stereological quantification and immunohistochemical and Western Blotting analyses for GFAP and doublecortin, markers of gliosis and neuroblasts, respectively. The total area of doublecortin-positive cells (ADPC) and the number of neurons (NN) in the lesioned (L) and contralateral (CL) sides were evaluated. Neurogenesis index (NI = ADPC in L/ ADPC in CL) and neuronal survival ratio (NSR = NN in L/ NN in CL) were calculated. After QA administration, ipsilateral striatum showed intense gliosis and doublecortin-positive cells with few processes and ovoid bodies, morphological features corroborating a migratory activity. Western Blotting for GFAP showed an ipsilateral decrease of 19% in AG490- vs vehicle-treated animals (0.82 ± 0.05 vs 1.010 ± 0.06; n=9, p<0.05). NSR was 25% higher in mice given AG490 vs controls given vehicle (0.75 ± 0.07 vs 0.60 ± 0.03; n=8, p<0.05). NI showed a decrease of 21% in AG490- vs vehicle-treated mice (1.08 ± 0.06, 1.37 ± 0.09; n=5, p<0.05). The average VDPA, measured in kilometers per day for 28 days, has not changed in animals that received intrastriatal injection of QA (30nmol) compared to animals that received PBS (3.97 ± 0.34, 3.90 ± 0.21, n = 8, p> 0.05). In conclusion, our results support a role for JAK2 in striatal neuronal death, gliosis and neurogenesis determined by QA. AG490 caused neuroprotection and reduced gliosis suggesting that astrocytic reaction may impair neuronal survival in the present experimental model / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular