Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-03-06T13:14:08Z No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Lucas Frederico de Almeida.pdf: 7866748 bytes, checksum: c6c7f11d9447181d9a6b3340df160336 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-03-23T12:36:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Lucas Frederico de Almeida.pdf: 7866748 bytes, checksum: c6c7f11d9447181d9a6b3340df160336 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-23T12:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Med_ Lucas Frederico de Almeida.pdf: 7866748 bytes, checksum: c6c7f11d9447181d9a6b3340df160336 (MD5) / NIH;FAPESB / Estudos prévios têm demonstrado um papel para os genes de cura de lesão na resolução das lesões cutâneas causadas por espécies de Leishmania em camundongos e humanos, incluindo o gene FLI1 (Friend leukemia vírus integration 1). O alto grau de metilação de ilhas CpG na região promotora do gene FLI1 é conhecido por tornar o gene transcricionalmente inativo. Redução da expressão de FLI1 resulta na regulação positiva dos genes COL1A1 (collagen type I alpha 1) e COL1A2 (collagen type I alpha 2), e, inversamente, na regulação negativa do gene MMP1 (matrix metallopeptidase 1). Ambos, colágeno do tipo 1 e metaloproteinase de matriz 1, desempenham um importante papel nas condições fisiológicas normais e patológicas de muitas doenças, e estão envolvidos no reparo de lesões. Adicionalmente, em estudo prévio, foi mostrada uma associação entre leishmaniose e um polimorfismo regulatório no gene IL6 (interleukin 6), e dados na literatura sugerem uma interação funcional entre IL6 e FLI1. Para entender melhor o papel desta via na leishmaniose, nós avaliamos o polimorfismo dos genes COL1A1, COL1A2 e MMP1 e sua possível associação com a leishmaniose tegumentar americana na população de Corte de Pedra, Bahia, assim como também avaliamos a expressão gênica de COL1A1, COL1A2, MMP1, FLI1, e o grau de metilação em ilhas CpG da região promotora deste último gene em biópsias de pele e em culturas de macrófagos infectados por Leishmania braziliensis. No estudo de associação genética, FBAT (Family-based association tests) mostrou uma forte associação entre os marcadores COL1A1_rs1061237 (P = 0,002) e COL1A1_rs2586488 (P = 0,027) e o fenótipo leishmaniose cutânea. O estudo com biópsias de pele revelou que a porcentagem de DNA metilado na região promotora de FLI1 foi mais baixa (P = 0,001) em biópsias de lesão de leishmaniose cutânea comparadas com biópsias de pele normal. A expressão gênica de FLI1 e de COL1A1 não diferiu entre as biópsias de lesão e as biópsias de pele normal, enquanto a expressão de COL1A2 foi menor (P = 0,033) e a expressão de MMP1 foi maior (P = 0,0002) nas biópsias de lesão de leishmaniose cutânea. Por fim, a análise da expressão gênica em macrófagos infectados mostrou que a expressão de FLI1 induzida pela infecção por Leishmania braziliensis teve um pico com 24 horas de infecção (P < 0,0001), e foi maior (P = 0,005) e teve um pico mais tardio (48 horas) na presença de IL-6. A expressão de genes de colágeno do tipo 1, COL1A1 e COL1A2, foi baixa em macrófagos infectados, e não foi detectável em macrófagos tratados com IL-6. A expressão de MMP1 foi fortemente induzida (P = 0,007) após infecção de macrófagos, mas não foi facilmente detectável em macrófagos tratados com IL-6 até 72 horas de infecção, quando o efeito da IL-6 na expressão de FLI1 diminuiu. MMP1 quebra o colágeno do tipo 1 intersticial, que é essencial para a migração de queratinócitos e o processo de re-epitelização. Porém, em lesões ativas de leishmaniose cutânea, baixos níveis de colágeno do tipo 1 junto com a exagerada expressão de MMP1 indica que o MMP1 está contribuindo para o dano tecidual em vez de levar ao reparo. Similarmente, foi observado que níveis exagerados de MMP1 contribuem para a destruição do tecido e progressão para a doença na tuberculose, levando outros autores a destacar o MMP1 como potencial alvo terapêutico. Nossos dados sugerem que a modulação desta via pode também ser relevante no tratamento da leishmaniose cutânea.

To explore the potential mechanisms of tendon degeneration, we investigated the role of c-Jun N-terminal Kinase (JNK) activation and the regulation of matrix metalloproteinase 1 (MMP1) in tendon matrix degradation under oxidative stress. JNK and MMP1 activity in samples from normal and ruptured human supraspinatus tendons were evaluated by immunohistochemistry. Real-time quantitative PCR was utilized to evaluate MMP1 mRNA expression and western blotting for MMP1 and JNK protein detection. JNK activation and increased MMP1 activity were found in the torn human supraspinatus tendon tissue, as well as in human tendon cells under in vitro oxidative stress. Inhibition of JNK prevented MMP1 over-expression in oxidative stressed human tendon cells. Results from the current study indicated that stress activated JNK plays an important role in tendon matrix degradation, possibly through upregulating of MMP1.

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L’arthrose (OA) est la maladie articulaire la plus répandue dans le monde faisant l’objet de nombreux travaux de recherche en raison de son lourd impact socioéconomique. Plusieurs travaux dans ce domaine ont pour objectif de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans sa physiopathologie. Plusieurs travaux ont appuyés l’implication de la prostaglandine (E2) PGE2 dans sa physiopathologie, contrairement à la prostaglandine (D2) (PGD2) dont le rôle reste à déterminer. C’est pourquoi, nous nous sommes penchés dans cette thèse à l’étude de cette dernière molécule. Dans la première partie de nos travaux, nous avons montré que la PGD2 diminue au niveau du cartilage articulaire et au niveau niveau des explants de cartilage humains, la production des métalloprotéases-1(MMP-1) et MMP-13 induites par (Interleukine-1β) l’IL-1β. Cette diminution de la production protéique est accompagnée d’une diminution de l’expression au niveau de l’ARNm, et d’une diminution de l’activité du promoteur de MMP-1 et MMP-13. Cet effet est exercé via le récepteur D prostanoïde (DP1), bien que le Chemoattractant receptor expressed on Th2 cells (CRTH2) soit également exprimé chez les chondrocytes humains, mais ne semble pas être impliqué dans l’effet observé. Cette action inhibitrice se fait via la voie DP1/AMPc/protéine kinase A (AMPc/PKA). Dans la suite de nos travaux, nous avons montré pour la première fois l’expression des prostaglandines D-synthases responsables de la biosynthèse de la PGD2 au niveau des chondrocytes humains par immunohistochimie, avec des niveaux d’expression de l’ARNm plus élevés de la L-PGDS au niveau du cartilage OA comparativement au cartilage normal. L’IL-1β pourrait être responsable de cette augmentation via l’activation de la voie JNK et p38 MAPK, ainsi que par la voie NF-κB. L’ensemble de ces données indiquent que la modulation des niveaux de la PGD2 au niveau de l’articulation pourrait être pourvue d’un important potentiel thérapeutique. La L-PGDS pour sa part semble avoir un rôle important dans la physiopathologie de l’OA. / Osteoarthritis (OA) is the most common joint disease world wide, because of its higher socioeconomic impact it is one of the most studied joint diseases. The aims of these studies was to determine the molecular mechanisms involved in the pathophysiology of osteaarthritis. Previous studies have mainly focused on the involvement of prostaglandin (E2) PGE2 in contrast to PGD2 in the pathogenesis osteoarthritis as such the role of PGD2 remains unclear. In this thesis we examined the involvment of PGD2 in the pathogenesis of OA. In the first part of our work, we showed that in a dose dependent manner PGD2 decreased the interleukin-1β (IL-1β)–induced mettalloproteases (MMP-1) and MMP-13 expression both at protein and mRNA levels by supression of their promoter activity. The inhibitory effect was exerted via the D prostanoid receptor (DP1) and mediated through the cAMP/protein kinase A (PKA) signalling pathway. Although human chondrocytes do express the Chemoattractant Receptor Expressed on Th2 cells (CRTH2) the latter were not implicated in the inhibiton of MMP-1 and MMP-13. In the second part of our work, we showed the expression of prostaglandin D synthases (PGDS) responsible for the biosynthesis of PGD2 in human chondrocytes, with higher levels of mRNA expression of lipocaline type prostaglandin D-synthase (L-PGDS) in OA cartilage compared to normal cartilage. IL-1β may be responsible for this increase via the activation of Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 mitogen activated protein kinase (MAPK), as well as the nuclear factor-κB (NF-κB). Together, these data indicate that modulation of the levels of PGD2 at the joint may be provided with an important therapeutic potential. L-PGDS in turn seems to have an important role in the pathogenesis of OA.

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