Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T14:40:02Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoexpressaoProteinaPten.pdf: 721291 bytes, checksum: 03e5ed9580eb970d3aead1e730a43890 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-11T15:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoexpressaoProteinaPten.pdf: 721291 bytes, checksum: 03e5ed9580eb970d3aead1e730a43890 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T15:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ImunoexpressaoProteinaPten.pdf: 721291 bytes, checksum: 03e5ed9580eb970d3aead1e730a43890 (MD5) Previous issue date: 2016-06-03 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Carcinoma de Células Escamosa Oral (CCEO) é a neoplasia maligna mais comum que afeta a cavidade oral, sendo responsável por mais de 90% dos casos diagnosticados neste sítio anatômico. Apesar dos recentes avanços no tratamento, a taxa de sobrevivência de 5 anos ainda gira em torno de 30-50%. Mecanismos moleculares que esclarecem a agressividade de lesões ajudam na identificação de quimioterápicos que possam ser utilizados para melhorar a taxa de sobrevida. O objetivo deste estudo foi investigar a imunoexpressão da proteína PTEN através da técnica de imuno-histoquímica (IHC) em amostras de pacientes com carcinoma epidermoide de boca (CEB) e relacioná-la com características clínico-patológicas, grau histológico e sobrevida e, ao lado disso, avaliar a presença de deleção alélica através da técnica de FISH. Nossos resultados mostraram que em um total de 119 casos de carcinoma epidermoide, 31 casos foram negativos para expressão de PTEN e 88 casos foram positivos, sendo 15 (17,05%) bem diferenciados, 43 (48,86%) moderadamente diferenciados e 30 (34,09%) pouco diferenciados. Considerando as características clinico-patológicas não foram encontradas correlações estatísticas significantes com a expressão de PTEN por IHC. Em relação à sobrevida foi observado que pacientes com infiltração linfononal (N) = 2 ou 3 cm tem risco 4 vezes maior de ir a óbito do que um paciente com N = 0 ou 1 cm. Por fim, houve associação significativa entre expressão por IHC negativa e o resultado da técnica de FISH no que diz respeito a deleção e entre expressão por IHC positiva e o resultado da técnica de FISH não deletado. / Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is the most common malignant neoplastic that affects the oral cavity, accounting for 90% of all cases diagnosed in this anatomic site. Despite the recent advances in the treatment, the survival rate varies from 30 to 50%. Molecular mechanisms which elucidates the agressive behaviour of these lesions help to identify new chemotherapeutics that might be used in the treatment in order to improve the survival rates. The aim of this study was investigating the imunoexpression of PTEN protein through the immunohistochemical technique (IHC) in CEB samples and relate them with clinicopathological features, histological grades and survival and in addition, evaluate the presence of allelic deletion through the Fluorescent In Situ Hybridization technique (FISH). Our results showed that a total from 119 cases of CEB, 31 cases were negative to expression of protein PTEN and 88 cases were positive for PTEN, from which 15 (17,05%) were well differentiated, 43 (48,86%) moderately differentiated and 30 (34,09%) were poorly differentiated. Considering the clinicophatological features, there were not statistically significant correlations with the IHC expression of PTEN. Regarding the survival rates, it was observed that patients presenting lymph node infiltration (N) = 2 or 3 has 4 times greater risk of dying than those presenting N = 0 or 1. Finally, there was a significant association between expression by IHC negative and the result of FISH technique regarding the deletion, and between the positive PTEN expression and the non-deleted result of FISH technique.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4644.pdf: 10384990 bytes, checksum: c8ab8c109d1671b477c700f556bd68bc (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / The thioredoxin peroxidase (Tpx) is a group of antioxidant proteins that has been widely studied due to its role in the decomposition of different peroxides such as H2O2, peroxynitrite and organic peroxides. The ability of peroxide decomposition by Tpx is related to the presence of a conserved cysteine called peroxidatic cysteine (CysP). Most Tpx has a second cysteine (resolving cysteine - CysR) which forms a disulfide with CysP after peroxide decomposition. In addition to the peroxidase activity, some Tpx have molecular chaperone activity and are also involved in signaling of cell growth induced by hydroperoxides. It has been demonstrated that the Tpx cytosolic isoform of Schizosaccharomyces pombe is able to interact directly with MAPK (Sty1) via mixed disulfide, which is stabilized when the CysR is replaced by a serine residue. Saccharomyces cerevisiae have a nuclear isoform of Tpx (nTPx) and review of the literature shows the importance of this protein in maintaining the telomere silencing and decomposition of organic peroxides in the nucleus. Scale proteomic studies using mass spectrometry and two-hybrid indicate the nTPx association with MAP kinases. However, despite its location and participation in biological processes of relevance, works related to nTPx are scarce. Scale proteomics studies reported the physical interaction between nTPx and Mec3, Gts1, Pc1 and Dog2. These proteins are related to cell signaling or maintenance of telomeric silencing. However, no specific studies were performed to confirm these interactions and if they are established by mixed disulfides. This study aimed to evaluate the interactions previously described in the literature between nTPx and Mec3, Pcl1, Dog2 and Gts1 through the expression and purification of these proteins and in vitro evaluation of interactions as well as in vivo tests using two-hybrid. Several efforts were made with different approaches, nevertheless it was impossible overexpression of Mec3, Pcl1, Dog2, indicating a toxic effect of these proteins on the strains used. Furthermore, we found great success in overexpression of nTPx and nTpxC112S (8 mg and 10 mg per liter of cell culture) in Eschericchia coli strain BL21 (DE3) C43. This is the first time that these proteins were expressed in native form. It was also possible to overexpress the Gts1 protein in the same strain. These results could lead for new approaches in future studies in order to determine these threedimensional structures, by methods such as X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance (NMR). Finally, the results obtainedusing the technique of two-hybrid yeast confirmed the interaction in vivo among nTPx and Mec3, Gts1, Dog2. However, opposing the results described in the literature, no interaction was detected between nTPx and PCL1, emphasizing the necessity of specific experiments in addition to the large-scale ones. / As tiorredoxinas peroxidases (TPx), constituem um grupo de proteínas antioxidantes que vêm sendo bastante estudadas pela sua atuação na decomposição de diversos tipos peróxidos, como o H2O2, peroxinitritos e peróxidos orgânicos. A capacidade de decomposição de peróxidos pelas TPx está relacionada a presença de uma cisteína conservada denominada de cisteína peroxidásica (CysP). A maioria das TPx possuem uma segunda cisteína (cisteína de resolução - CysR) a qual forma um dissulfeto com CysP após a decomposição de um peróxido. Adicionalmente, à atividade peroxidásica, algumas TPx possuem atividade de chaperona molecular e também estão envolvidas em processos de sinalização de crescimento celular induzidos por hidroperóxidos. Já foi demonstrado que a isoforma citosólica de TPx de Schizosaccharomyces pombe é capaz de interagir diretamente com uma MAPK (Sty1) através da formação de um dissulfeto misto entre as proteínas, que é estabilizado quando a CysR é substituída por um resíduo de serina. Entretanto, nenhuma interação deste tipo foi descrita para outros organismos. Em Saccharomyces cerevisiae ocorre uma isoforma de TPx no núcleo (nTPx) e a revisão da literatura demonstra a relevância desta proteína na manutenção do silenciamento dos telômeros e decomposição de peróxidos orgânicos no núcleo. Estudos em escala proteômica utilizando espectrometria de massa e duplo híbrido indicam a associação de nTPx com MAP quinases, entretanto, apesar de sua localização e participação em processos biológicos de relevância, trabalhos relacionados com nTPx são escassos. Estudos em escala proteômica relataram a interação física entre nTPx e as proteínas Mec3, Gts1, Pcl1 e Dog2 relacionadas a sinalização celular ou manutenção do silenciamento telomérico. No entanto, não foram efetuados estudos pontuais visando confirmar estas interações como também averiguar a possibilidade das interações entre nTPx e as proteínas supracitadas serem estabelecidas através de dissulfetos mistos. Este trabalho teve por objetivo a avaliação de interações previamente descritas na literatura entre nTPx e Mec3, Pcl1 e Dog2 por meio da expressão e purificação destas proteínas e avaliação in vitro de interações como também in vivo através de ensaios de duplo híbrido. Diversos esforços com diferentes abordagens foram efetuados, entretanto não foi possível a superexpressão de Mec3, Pcl1, Dog2, indicando um efeito tóxico destas proteínas sobre as linhagens utilizadas. Por outro lado, obtivemos grande sucesso na superexpressão de nTPx e nTpxC112S (8 mg e 10 mg por litro de cultura de células) em linhagens de Eschericchia coli BL21 (DE3) C43, o que representa a primeira vez que estas proteínas foram expressas sem trucamentos. Também foi possível expressar na mesma linhagem a proteína Gts1. Estes resultados abrem a possibilidade de estudos posteriores visando a determinação de suas estruturas tridimensionais, por metodologias como cristalografia de raios-X ou ressonância magnética nuclear (RMN). Por fim, os resultados de interação in vivo utilizando a técnica de duplo híbrido em levedura, confirmaram a interação entre nTPx e Mec3, Gts1 e Dog2. Entretanto ao contrario dos resultados descritos na literatura, não foi detectada interação entre nTPx e Pcl1, reforçando que experimentos pontuais são necessários em adição aos experimentos de larga escala.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4434.pdf: 2956570 bytes, checksum: f54aa91fcb424a121affb3c9674f546e (MD5) Previous issue date: 2012-08-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The aim of this work was to perform differential proteomic analysis of the periplasmic protein profiles of the genome strains A, B and C of Xanthomonas spp, which differ in pathogenicity and host range of citrus. The strain Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the most virulent and infects all types of citrus, while the strain B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) is less virulent and the strain C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) has a unique citrus-host. The comparative proteomic analysis of Xau-B and Xau-C in relation to Xac can reveal genes and proteins involved in pathogenicity and host range of citrus, respectively. The strains A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) and C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) were grown in XAM-1, which is known to be a pathogenicity-inducing medium for Xac, and in a non-inducing pathogenicity (Nutrient Broth, NB). Proteins from both types (grown in triplicate using both media), were separated by bidimensional electrophoresis (2DPAGE) and the gels were stained using Coomassie Brilliant Blue R-250 and documented. A comparative analysis of the protein profiles of Xac and Xau-B, and Xac and Xau-C, grown in the same culture medium, was performed using ImageMaster Platinum software (GE Healthcare). Statistical analysis (ANOVA) revealed a large number of periplasmic proteins that presented type-specific or differential expression between the two bacteria. For the comparison between Xac and Xau-B we used the twodimensional Xau-B gels of periplasmic proteins obtained by Carnielli (2011). The differential spots between Xac and Xau-C, Xac and Xau-B that showed a significant differential expression (p <0.05) were isolated from gels and identified by ESI-QUADTOF mass spectrometry (LNBio, Campinas-SP), employing Xac, Xau-B and Xau-C databases. Several differentially expressed proteins between strains were identified for the different conditions studied, showing that some of them were strain-specific (approximately 10) while others were expressed in all strains, differing only in intensity. Those proteins potentially related to pathogenicity and citrus host were quantified using the software Scaffold v. 3.0, for the mass spectrometry data.The results showed that Xac, Xau-B, and Xau-C had remarkable differences between the periplasm protein profiles for both conditions, even under conditions of no induction of pathogenicity. The proteomics approach showed that even though the strains showed a different pattern of protein expression, the sequences of genes related to the differential proteins are present in all strains. Based on the proteomic analysis, proteins that showed remarkable differential expression between the genome strainswere selected, and its expression was evaluated by Western blot in periplasmic fraction of the bacteria. The data obtained in the the comparative proteomic analysis for the superoxide dismutase corroborated most quantitative results generated by the software Scaffold. This work showed that the proteomic analysis, combined with quantitative analysis tools, is an important tool that comes to complement genomic investigations designed to differentiate the species of Xanthomonas spp. / O presente trabalho teve por objetivo a análise proteômica comparativa da fração periplasmática das estirpes-genoma A, B e C de Xanthomonas spp, as quais diferem em patogenicidade e gama de citros hospedeiros. A estirpe A (Xanthomonas citri subsp. citri, Xac) é a mais virulenta e infecta todos os tipos de citros, enquanto que a estirpe B (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-B) é menos virulenta e a estirpe C (Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, Xau-C) possui um único hospedeiro cítrico. Estas estirpes foram cultivadas em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN). Após a extração de proteínas da fração periplasmática em triplicata, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. A análise proteômica comparativa de Xau-B e Xau-C relativamente à Xac pode nos levar a genes e proteínas envolvidas com patogenicidade e espectro de hospedeiro cítrico, respectivamente. Assim, Xac e Xau-C foram cultivadas em triplicata em meio XAM-1, conhecido como sendo um meio indutor de patogenicidade para Xac, e em meio não indutor de patogenicidade (Caldo Nutriente, CN), sendo as células coletadas ao final da fase exponencial de crescimento, segundo curvas previamente realizadas. Após a extração de proteínas periplasmáticas, as mesmas foram separadas por eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250 e documentados. Uma análise estatística das diferenças observadas nas intensidades dos spots nos géis 2D foi realizada entre Xau-C e Xac e entre Xau-B e Xac (nos mesmos meios de cultura) utilizando o software Image Master 2D-Platinum (GE Healthcare). Para esta última comparação foram utilizados os géis bidimensionais de proteínas periplasmáticas de Xau-B obtidos por Carnielli (2011). As proteínas diferenciais entre Xac e Xau-C e entre Xac e Xau-B que apresentaram uma expressão diferencial significativa (p<0,05) foram isoladas a partir dos géis e identificadas por espectrometria de massas (LNBio, Campinas-SP) após pesquisa em banco de proteínas anotadas a partir do genoma de cada uma das linhagens. Inúmeras proteínas diferencialmente expressas entre as linhagens foram identificadas para as diferentes condições estudadas, demonstrando que algumas foram estirpe-específicas (10 aproximadamente) enquanto outras foram expressas em todas as linhagens, diferindo na sua intensidade. Aquelas proteínas que indicaram alguma potencialidade em relação à patogenicidade e hospedeiro cítrico foram quantificadas com o uso do software Scaffold v. 3,0, a partir de dados provenientes da espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstram que Xac, Xau-B e Xau-C apresentam perfis proteicos marcadamente diferentes na fração de periplasma, mesmo em condições de não indução da patogenicidade. A abordagem proteômica evidenciou que embora as estirpes apresentem um padrão de expressão protéica muito distinto na fração rica em proteínas periplasmáticas, as sequências dos genes relacionados às proteínas diferenciais (superóxido dismutase e fosfoglicomutase) estão presentes em todas as estirpes. Com base na análise proteômica, foram selecionadas proteínas que apresentaram expressão diferencial acentuada entre as linhagens-genomas, nas condições estudadas, sendo sua expressão avaliada por Western blot contra extrato protéico periplasmático das três linhagens- genomas, após cultivo das mesmas em meio CN e XAM-1 Os dados obtidos para a superoxido dismutase corroboraram a maioria dos resultados quantitativos gerados pelo software Scaffold. Este trabalho evidenciou que a análise proteômica, aliada às ferramentas de análises quantitativas, é um recurso que vem complementar as investigações genômicas destinadas a diferenciar as diferentes espécies de Xanthomonas spp. Sob os aspectos biotecnológicos a busca e identificação de proteínas biomarcadoras, em especial aquelas relacionadas com patogenicidade e especificidade à hospedeiro, são importantes alvos para produção de drogas no combate ao cancro cítrico.