Eukaryotic messenger RNA (mRNA) synthesis catalyzed by the RNA Polymerase II is the central and critical process for the regulation of gene expression. Several decades of research unearthed many details about this essential process of high complexity and dynamic. The mediator complex turned out to be crucial for the regulation of Pol II mediated transcription, especially the process of initiation. It functions as an interface between the general transcription machinery and multiple DNA binding transcriptional regulators. Binding these regulators via its tail module and binding the polymerase II via its head module, the mediator forms a bridge between upstream activating sequences and the core promotor and initiates the assembling of the Pre-Initiation complex consisting of the polymerase II and the general transcription factors. However, particularly the last years of research suggest the mediator complex within many other functions including transcription elongation, gene looping and chromatin remodeling. Considering the facts, that the mediator (a) consist of 25 subunits, which are partially flexible associated, (b) shows a flexible intrinsic structure and (c) is highly and dynamically phosphorylated it becomes easy to imagineplausible that the mediator complex meets all this functions, by serving as a transcriptional platform. In context of this thesis, and it was possible to “illustrate” the mediator within its versatile tasks and functions by presenting the most comprehensive analysis of the Mediator complex interactome to date. By optimizing the conditions of cell lysis and co-immunoprecipitation it was possible to preserve even transient and labile protein-protein interactions. The use of metabolic labeling (15N) in the control experiment, allowed us to distinguish between specific and non-specific captured proteins. In combination with high performance mass spectrometry, more than 400 proteins and even complete protein complexes interacting with the mediator complex could be identified, naming RNA-Polymerase II, all general transcription factors the SAGA complex, chromatin remodeling complexes and highly acetylated histones. Furthermore, many candidates where identified playing a role in co-transcriptional processes of mRNA, such as splicing, mRNA-decapping, mRNA transport and decay. This analysis not only confirmed several interactions , already can be found in the literature, but furthermore provide clear evidence, that mediator complex interacts not only with the RNA-Polymerase II, but also with the RNA Polymerase I and III. Next to the high numbers of potential known and unknown interacting proteins, it could be shown, that the interactome is highly dynamic and sensitive to detergent. / Die Synthese der mRNA durch die RNA-Polymerase II ist der zentrale und kritische Prozess im Rahmen der Transkriptionsregulation Protein-kodierender Gene. Viele Jahrzehnte der intensiven Erforschung brachten viele Details über diesen Mechanismus zu Tage, der von einer unglaublichen Komplexität und Dynamik geprägt ist. Dabei stellte sich heraus, dass der Mediatorkomplex eine zentrale Rolle bei der Regulation der Polymerase II-abhängigen Transkription spielt, im Besonderen der Initiation. In der Funktion einer Schnittstelle verknüpft er die allgemeine Transkriptionsmaschinerie mit den Gen- spezifischen Transkriptionsregulatoren. Durch die Interaktion des Schwanzmoduls mit diesen Regulatoren und der Interaktion des Kopfmoduls mit der Polymerase II verbindet er wie eine Brücke die oberhalb des Promotors liegenden Aktivatorsequenzen mit dem Kernpromotor und initiiert so die Ausbildung des Pre-Initiationskomplexes. Darüber hinaus mehren sich gerade in den letzten Jahren die Hinweise darauf, dass der Mediator auch noch an anderen Prozessen der Transkription beteiligt ist. Zu diesen gehören z.B. die Elongation, die Ausbildung von Genschlaufen oder auch der Umbau der Chromatinstruktur. In Anbetracht der Tatsachen, dass der Mediator (a) aus bis zu 25 Untereinheiten mit flexibler Zusammensetzung besteht, (b) eine flexible Struktur besitzt und (c) umfassend und dynamisch über posttranslationale Modifikationen modifiziert ist, erscheint es durchaus möglich, dass der Mediator all diese Funktionen ausfüllt und die Rolle einer allgemeinen Transkriptionsplattform einnimmt. Im Zusammenhang mit dieser Dissertationsschrift ist es gelungen, den Mediator innerhalb all dieser Funktionen „abzubilden“ und die bisher umfassendste Interaktomanalyse dieses Komplexes zu präsentieren. Durch die optimierten Bedingungen der Zelllyse und Co-Immunopräzipitation, gelang es auch transiente Interaktionspartner zu isolieren. Durch das metabolische Markieren der Wildtypkontrolle konnten außerdem unspezifische und spezifische Interaktionen eindeutig voneinander unterschieden werden. Über 400 Proteine wurden als signifikante Interaktionspartner des Mediators identifiziert. Viele dieser Proteine konnten als vollständige Komplexe zusammengefasst werden, z.B die RNA-Polymerase II, alle allgemeinen Transkriptionsfaktoren, der SAGA-Komplex, viele Komplexe des Chromatin Remodelings und stark acetylierte Histone. Viele weitere Interaktionspartner spielen zudem eine Rolle bei der co-transkriptionalen Prozessierung der mRNA, wie z.B dem Splicing, dem mRNA-decapping oder Abbau. Darüber hinaus gibt es starke Hinweise darauf, dass der Mediator auch mit der Polymerase I und III interagiert und an der ribosomalen Biogenese beteiligt ist. Weitere Analysen zeigten, dass das Interaktom zudem hochdynamisch ist

In den letzten Jahrzehnten wurde das Konzept der grünen und nachhaltigen analytischen Chemie immer wichtiger. Ein wesentlicher Bestandteil besteht darin Chemikalien zu reduzieren und analytische Prozesse zu miniaturisieren. Das Ergebnis ist die Nutzung von kleinen Probenvolumina, welche oft zu Problemen in der Handhabung führen können. Besonders physikalische oder chemische Oberflächeneffekte und Kontaminationen stellen eine Herausforderung dar. Die akustische Levitation ist eine Möglichkeit der berührungslosen Probenhandhabung, d.h. Verunreinigungen und Oberflächenreaktionen sind ausgeschlossen, da die Probe nur mit der umgegebenen Gasphase interagiert. Hier ist eine Kopplung mit analytischen Methoden besonders erstrebenswert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Implementierung von akustischer Levitation in die massenspektrometrische Analyse. Eine Kombination aus einem akustischen Levitator als kontaktloser Probengeber, Infrarot-Laser Desorption und Ionisierung mittels chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) ermöglichte die quantitative Analyse von verschiedensten pharmazeutischen Wirkstoffen im nanomolaren Bereich. Dieser grundlegende Aufbau wurde in der Folge weiterentwickelt und optimiert, sodass am Ende ein breites Spektrum an Analyten detektiert werden konnte. Zusätzlich wurde ein Trypsin Verdau miniaturisiert und kontaktlos im akustischen Levitator durchgeführt und massenspektrometrisch analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Trypsinverbrauch gesenkt werden konnte bei gleichzeitiger Verringerung der Reaktionszeit und Verbesserung der Ausbeuten im Vergleich zum Standard-Verfahren. / In recent decades, the concept of green and sustainable analytical chemistry has become increasingly relevant. The main idea is reducing chemicals and miniaturizing analytical processes. The result is the utilization of small sample volumes, which can often lead to handling problems. Especially physical or chemical surface effects and corresponding contaminations are a major challenge. Acoustic levitation is a possibility for non-contact sample handling, i.e. contamination and surface reactions are excluded, since the sample interacts only with the surrounding gas phase. Here, coupling with analytical methods is particularly desirable. The present work describes the implementation of acoustic levitation in mass spectrometric analyses. A combination of an acoustic levitator as a contactless sample supply, infrared laser desorption and post-ionization via atmospheric pressure chemical ionization (APCI) enabled the quantitative analysis of a wide variety of pharmaceutical agents in the nanomolar range. This basic setup was subsequently further developed and optimized so that a wide range of analytes could be detected. Additionally, a trypsin digestion was miniaturized and performed contactless in the acoustic levitator and analyzed by mass spectrometry. The results demonstrated that trypsin consumption could be reduced while simultaneously reaction time decreased and reaction yields increased compared to the tube method.

Das Problem des Missbrauchs von Erythropoietin (EPO) als Dopingsubstanz zur Steigerung der Ausdauerleistung wurde schlagartig weltweit durch den Skandal zur Tour de France 1998 bekannt. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) führte ab 1992 Erythropoietin explizit auf der Liste der verbotenen Wirkstoffe auf, ohne des es möglich war zwischen den rekombinantem und dem körpereigene Erythropoietin zu unterscheiden. Bei der im Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Kreischa durchgeführten Arbeit wurden zwei generelle Strategien verfolgt: zum einen ein indirekter Nachweis des rhEPO, basisierend auf dessen Auswirkungen auf die Erythropoese, und zum anderen der direkte Nachweis des Unterschieds zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin. In der ersten durchgeführten Populationsuntersuchung von 229 Leistungssportlern konnte bei der Auswertung der Daten lediglich eine signifikante Erhöhung des löslichen Transferrinrezeptors (sTfR) bei den Ausdauerathleten gefunden werden, während sich die hämatologischen Parameter nicht unterschieden. In der anschließenden Verlaufsuntersuchung von Ausdauerathleten des Deutschen Leichtathletikverbandes wurden zusätzlich zu den bereits in der Populationsstudie untersuchten Parametern erstmalig von Hochleistungs-athleten Retikulozyten und deren Reifeparameter untersucht. Bei den Hochleistungs-sportlern konnten, insbesondere für die Retikulozyten-parameter, über den Zeitraum der Studie konstante Werte gefunden werden. Die Untersuchung der zirkadianen Rhythmik zeigte lediglich für den Parameter Erythropoietin einen signifikante Veränderung mit einem Maximum in den späten Abendstunden (20:00 bis 23:00 Uhr) erreichte. Die Untersuchung der Variation der indirekten Parameter über den Zeitraum eines Jahres zeigte, dass im Gegensatz zu der Verlaufsuntersuchung der DLV-Athleten, bei der der längste Untersuchungs-zeitraum sechs Monate betrug, eine Veränderung aller Parameter, mit Ausnahme von Erythropoietin, bestand. Bei der Auswertung der Belastungsstudien wurde für die gut trainierten Athleten nur ein geringer Einfluss auf die hämatologischen Parameter gefunden, während bei einigen Retikulozytenparametern signifikante Erhöhungen durch die Belastung festgestellt werden konnten. Mit der Etablierung der direkten Nachweismethode für EPO im Urin und der Anpassung der ursprünglichen Methode an das neue Präparat ARANESP, ein modifiziertes EPO, änderte sich die Aufgabenstellung für die indirekten Parameter, da es ab sofort möglich war eine große Anzahl Proben unter Verwendung von niedrigeren Grenzwerten zu screenen. Anhand der Werte der weltbesten Ausdauerathleten wurden allgemein gültige Grenzwerte und eine globale Strategie für ein Screening aufgestellt. Bei einem auffälligen Befund würde in jedem Fall die korrespondierende Urinprobe mittels der direkten Methode untersucht und erst mit dem Nachweis des rekombinanten Erythropoietins als positiv bewertet werden. Zusätzlich zu den indirekten Parametern wurden Untersuchungen hinsichtlich des direkten Nachweis, d. h. der Anreicherung von Erythropoietin und einer massenspektrometrischen Analyse einzelner Glykanketten, durchgeführt, bei denen mit der Kombination Nanospray und TOF-MS die notwendigen Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass ausgewählter Blutparameter sehr gut geeignet sind, um als Screeningmethode für erythropoesesteigernde Substanzen zu dienen. Im Gegensatz zur Methode des direkten Nachweises von EPO im Urin, die durch die Verfügbarkeit der Referenzsubstanzen limitiert ist, bietet der indirekte Nachweis über Blutparameter den Vorteil, Veränderungen des erythropoetischen Systems, verursacht durch neue Substanzen oder Methoden, erfassen zu können.

Sowohl in der Klinischen Labormedizin, der Klinischen Mikrobiologie als auch in der Pathologie ist die Massenspektrometrie (MS) ein bedeutender Bestandteil der Diagnostik geworden. Der Fortschritt in der Gerätetechnik ermöglicht in kurzer Zeit viele, hochaufgelöste Spektren zu generieren. Diese Informationsvielfalt macht die manuelle Auswertung durch den Anwender sehr kompliziert bis unmöglich. Aus diesem Grund ist die Unterstützung durch bioinformatische Programme notwendig. Für die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und die Qualitätskontrolle ist es essentiell, dass die verwendeten Algorithmen transparent und die Programme als Open Source Software (OSS) frei verfügbar sind (Aebersold and Mann, 2003). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von MALDIquant, einer unter der GNU General Public License (GPL) stehenden, flexiblen OSS, die für die o.g. Anwendungsbereiche modernste Algorithmen für die komplette Analyse bietet und in der freien Programmiersprache R (R Core Team, 2014) geschrieben ist. Im Zusammenspiel mit dem dazugehörigen Paket MALDIquantForeign ist MALDIquant in der Lage die üblichen Dateiformate der verschiedenen MS-Geräte zu verarbeiten. Dadurch ist MALDIquant hersteller- und geräteunabhängig und eignet sich nicht nur für MALDI/TOF, sondern für alle zweidimensionalen MS-Daten. Angefangen vom Datenimport über die Prozessierung bis hin zur Analyse der Spektren bietet MALDIquant eine komplette Analyse-Pipeline und implementiert state-of-the-art Methoden. Neben weit verbreiteten Verfahren zur Baseline Correction und Peak Detection zeichnet sich MALDIquant besonders durch ein hervorragendes Peak Alignment aus. Dieses ist sehr genau und aufgrund des Fokus auf die Peaks schneller als die meisten anderen Verfahren und weitestgehend unabhängig von der Qualität der Intensitätenkalibrierung. Eine weitere Stärke von MALDIquant ist die Möglichkeit, eigene Algorithmen zu integrieren, sowie den Ablauf der Analyse den individuellen Bedürfnissen anzupassen. In der beispielhaften Analyse der Daten von Fiedler et al. (2009) konnten durch MALDIquant Peaks gefunden werden, die Patienten mit Pankreaskarzinom von nicht erkrankten Probanden unterscheiden. Einige dieser Peaks wurden bereits in anderen Publikationen beschrieben. Neben diesem Beispiel hat MALDIquant seine Nützlichkeit bereits in verschiedenen Anwendungsbereichen und Publikationen bewiesen, wie etwa in Ouedraogo et al. (2013) oder Jung et al. (2014).:Bibliographische Beschreibung (III) Abbildungsverzeichnis (V) Tabellenverzeichnis (VII) Abkürzungsverzeichnis (IX) 1 Einleitung (1) 1.1 Intention (1) 1.2 Eigene Beiträge (2) 1.3 Übersicht (3) 2 Hintergrund (5) 2.1 Proteomik (5) 2.2 Massenspektrometrie (6) 2.3 Bioinformatik (7) 3 Methoden (9) 3.1 Überblick (9) 3.2 Import der Rohdaten (9) 3.3 Transformation der Intensitäten (11) 3.4 Korrektur der Grundlinie (11) 3.5 Kalibrierung der Intensitäten (13) 3.6 Identifizierung von Merkmalen (15) 3.7 Kalibrierung der m/z-Werte (17) 3.8 Nachbearbeitung (19) 4 Ergebnisse (23) 4.1 Implementierung (23) 4.2 Anwendungsbeispiel Fiedler et al. 2009 (23) 4.3 Vorbehandlung der Daten aus Fiedler et al. 2009 mit MALDIquant (24) 4.4 Multivariate Analyse (24) 4.5 Mögliche Biomarker (26) 5 Diskussion (29) 6 Zusammenfassung (31) 7 Literaturverzeichnis (35) A Publikation (45) B Übersicht Codeumfang (49) C Analyse Fiedler et al. 2009 (51) D Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit (69) E Lebenslauf (71) F Danksagung (75)

Das Problem des Missbrauchs von Erythropoietin (EPO) als Dopingsubstanz zur Steigerung der Ausdauerleistung wurde schlagartig weltweit durch den Skandal zur Tour de France 1998 bekannt. Das Internationale Olympische Komitee (IOC) führte ab 1992 Erythropoietin explizit auf der Liste der verbotenen Wirkstoffe auf, ohne des es möglich war zwischen den rekombinantem und dem körpereigene Erythropoietin zu unterscheiden. Bei der im Institut für Dopinganalytik und Sportbiochemie Kreischa durchgeführten Arbeit wurden zwei generelle Strategien verfolgt: zum einen ein indirekter Nachweis des rhEPO, basisierend auf dessen Auswirkungen auf die Erythropoese, und zum anderen der direkte Nachweis des Unterschieds zwischen rekombinantem und humanem Erythropoietin. In der ersten durchgeführten Populationsuntersuchung von 229 Leistungssportlern konnte bei der Auswertung der Daten lediglich eine signifikante Erhöhung des löslichen Transferrinrezeptors (sTfR) bei den Ausdauerathleten gefunden werden, während sich die hämatologischen Parameter nicht unterschieden. In der anschließenden Verlaufsuntersuchung von Ausdauerathleten des Deutschen Leichtathletikverbandes wurden zusätzlich zu den bereits in der Populationsstudie untersuchten Parametern erstmalig von Hochleistungs-athleten Retikulozyten und deren Reifeparameter untersucht. Bei den Hochleistungs-sportlern konnten, insbesondere für die Retikulozyten-parameter, über den Zeitraum der Studie konstante Werte gefunden werden. Die Untersuchung der zirkadianen Rhythmik zeigte lediglich für den Parameter Erythropoietin einen signifikante Veränderung mit einem Maximum in den späten Abendstunden (20:00 bis 23:00 Uhr) erreichte. Die Untersuchung der Variation der indirekten Parameter über den Zeitraum eines Jahres zeigte, dass im Gegensatz zu der Verlaufsuntersuchung der DLV-Athleten, bei der der längste Untersuchungs-zeitraum sechs Monate betrug, eine Veränderung aller Parameter, mit Ausnahme von Erythropoietin, bestand. Bei der Auswertung der Belastungsstudien wurde für die gut trainierten Athleten nur ein geringer Einfluss auf die hämatologischen Parameter gefunden, während bei einigen Retikulozytenparametern signifikante Erhöhungen durch die Belastung festgestellt werden konnten. Mit der Etablierung der direkten Nachweismethode für EPO im Urin und der Anpassung der ursprünglichen Methode an das neue Präparat ARANESP, ein modifiziertes EPO, änderte sich die Aufgabenstellung für die indirekten Parameter, da es ab sofort möglich war eine große Anzahl Proben unter Verwendung von niedrigeren Grenzwerten zu screenen. Anhand der Werte der weltbesten Ausdauerathleten wurden allgemein gültige Grenzwerte und eine globale Strategie für ein Screening aufgestellt. Bei einem auffälligen Befund würde in jedem Fall die korrespondierende Urinprobe mittels der direkten Methode untersucht und erst mit dem Nachweis des rekombinanten Erythropoietins als positiv bewertet werden. Zusätzlich zu den indirekten Parametern wurden Untersuchungen hinsichtlich des direkten Nachweis, d. h. der Anreicherung von Erythropoietin und einer massenspektrometrischen Analyse einzelner Glykanketten, durchgeführt, bei denen mit der Kombination Nanospray und TOF-MS die notwendigen Nachweisgrenzen erreicht werden konnten. Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass ausgewählter Blutparameter sehr gut geeignet sind, um als Screeningmethode für erythropoesesteigernde Substanzen zu dienen. Im Gegensatz zur Methode des direkten Nachweises von EPO im Urin, die durch die Verfügbarkeit der Referenzsubstanzen limitiert ist, bietet der indirekte Nachweis über Blutparameter den Vorteil, Veränderungen des erythropoetischen Systems, verursacht durch neue Substanzen oder Methoden, erfassen zu können.

Histone post-translational modifications (PTMs), as the histone code assumes, are related with regulation of gene transcription, an important mechanism of cells in the differentiation process. Many PTMs are simultaneously present in histone proteins, and changes in the PTM stoichiometric ratios can have several effects, like changes in the chromatin structure leading to a transcriptionally active or repressive state. Significant progresses were made to map variations of histone PTMs by mass spectrometry (MS), and although many protocols were developed there are still some drawbacks. Incomplete and side reactions were identified, which can directly affect the quantification of histone PTMs, because both (incomplete and side reactions) can be misinterpreted as endogenous histone post translational modifications. Therefore, a protocol for derivatization of histones with no noticeable undesired reactions (<10%) was required. In this thesis a new chemical modification methodology is presented, which allows the improvement of sequence coverage by acylation with propionic anhydride of lysine residues and N-terminal (free ε- and α- amino groups) and trypsin digestion. more than 95% of complete reaction was achieved with the new derivatization methodology. This strategy (chemical derivatization of histones), in combination with bottom-up MS approach, allows the quantification of lysine methylation (Kme) and acetylation (Kac) in histones from Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae), mouse embryonic stem cells (mESCs) and human cell lines. The results showed histone H3 PTM pattern as the most variable profile regarding histone Kme and Kac across the three different organisms and experimental conditions. Therefore, it was concluded that quantification of H3 PTM pattern can be used to examine changes in chromatin states when cells are subjected to any kind of perturbation.

Als Totalanalysesysteme (TAS) werden Geräte bezeichnet, welche komplette chemische Analysen eigenständig ausführen. Die Einführung solcher Systeme ermöglicht einen effizienteren Arbeitsablauf in Analyselaboren, da beispielsweise die Probenmanipulation, Aufreinigung und die physikalisch-/chemische Analyse automatisiert in einem Arbeitsgang durchgeführt werden können. Die speziellen Mikrototalanalysesysteme benötigen geringere Probemengen im $\mu$L- Bereich. Durch Kontamination, Agglomeration oder einem Verschluss etwaiger Kanäle in mikrofluidischen Totalanalysesystemen kann es zu einem kompletten Systemausfall kommen. Eine Alternative bildet die akustische Levitation, um derartige Störfälle durch gänzlichen Verzicht auf Gefäße und Wandkontakte gezielt zu reduzieren. Damit die akustische Levitation erfolgreich in Mikrototalanalysesystemen Anwendung finden kann, bedarf es der technischen Weiterentwicklung von Analysemethoden und Kopplungstechniken. In der vorliegenden Arbeit wird das Hauptaugenmerk auf die Kopplung von Levitationstechnik und Massenspektrometrie gelegt. Darüber hinaus wurden spektroskopische Experimente durchgeführt, welche auf Totalreflektionen innerhalb der Tropfen beruhen. Die besonders gute Reflektion hängt damit zusammen, dass sich die Phasengrenze zwischen Luft und Flüssigkeit im Schwebezustand durch molekulare Wechselwirkungen ständig erneuert und keine produktionsbedingte raue Oberfläche aufweist. Die Kombination aus automatischer Tropfengenerierung, Spektroskopie sowie der entwickelten Methode zur Ionenerzeugung aus dem Probevolumen und der massenspektrometrischen Analyse bilden die Grundlage eines neuartigen Mikrototalanalysesystems für geringe Probemengen. / As a total analysis system (TAS) an instrument is called which carries out complete chemical analysis procedures independently. The introduction of such systems offers a more efficient workflow in analytical laboratories because the sample manipulation, purification and the actual automated analysis can be carried out in one single operation. Specialized and already existing micro total analysis systems require currently a small amount of sample in the $\mu$L range. Owing to contamination, agglomeration and thus cross-secion reduction of incorporated channels in micro fluidics total analysis systems it can lead to a complete system interruption. Hence, the implementation of acoustic levitation in these systems is interessting alternative in order to avoid such kind of problems by abandoning vessels and wall contacts completely. To ensure acoustic levitation in micro total analysis systems can be successfully applied, technical development of analytical methods and coupling techniques is required. In the present work, the coupling of levitation technology and mass spectrometry is the prioritized topic but, in addition, spectroscopic experiments based on total reflections within the levitated droplet are as well realized in order to gain process insights. The particularly good reflection at the freely levitated droplet's circumference is due to the fact that the phase boundary between air and liquid is renewed by molecular interactions constantly and has no production-related rough surface. The combination of automated droplet generation, spectroscopy as well as the developed method for ion generation from the sample volume and mass spectrometry forms the basis of a novel micro total analysis system for small sample quantities.

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Bdellovibrionaceae sind außergewöhnliche Bakterien, da sie als die kleinsten bekannten räuberischen Organismen gelten. Seit ihrer Entdeckung in Bodenproben im Jahr 1962 durch Stolp und Starr konnte eine weite Verbreitung in der Natur nachgewiesen werden. Besonderes Interesse erlangten Bdellovibrionaceae durch ihre Fähigkeit bakterielle Erreger wie Escherichia coli, Salmonella und Yersinia zu attackieren. Der bestuntersuchte Vertreter der Familie Bdellovibrionaceae ist Bdellovibrio bacteriovorus. Er durchläuft einen komplexen Lebenszyklus, der nur partiell verstanden ist. In der Attack-Phase werden durch einen noch nicht aufgeklärten Mechanismus potentielle Beutebakterien erkannt und der interzelluläre Kontakt hergestellt. Nachdem eine Pore in der Zellwand der ausschließlich Gram-negativen Beutebakterien erzeugt wurde, dringt B. bacteriovorus in den periplasmatischen Raum ein. Nach etwa 30 Minuten ist der Invasionsprozess abgeschlossen und man kann die Ausbildung sphärischer Bdelloblasten beobachten. Im Beutebakterium verdaut B. bacteriovorus makromolekulare Bestandteile des Wirtes und wächst zu einem langen spiralförmigen Stäbchen aus. Es setzt schließlich die Zellteilung ein bei der 5 bis 30 Tochterzellen in Abhängigkeit zur Größe des Beutebakteriums freiwerden. Mit der Reproduktion ist der parasitäre Lebenszyklus nach etwa 3 Stunden beendet. Die komplexe Regulation der Expression von Proteinen konnte für die einzelnen Wachstumsphasen durch ein- sowie zweidimensionale Gelelektrophorese nachgewiesen werden. In der Vergangenheit haben verschiedene Studien die Komplexität der Wechselwirkung mit den Beutebakterien belegt. Hierbei wurde, neben dem offensichtlichen Abbau makromolekularer Bestandteile der Beutebakterien, ein Recycling und Einbau von Membranbestandteilen wie Lipopolysacchariden (LPS) und Outer Membrane Proteine (OmP) in das Membransystem von B. bacteriovorus diskutiert. Die biologische Interpretation dieses Phänomens ist eine erhöhte Effizienz in der Reproduktion von B. bacteriovorus wenn es Bestandteile des Wirtsbakteriums wiederverwertet im Gegensatz zur Eigensynthese. Trotz der morphologischen Ähnlichkeit und des ungewöhnlichen Lebensstils wurde festgestellt, dass die Familie der Bdellovibrionaceae phylogenetisch sehr heterogen ist. Es werden zur Zeit zwei Gattungen unterschieden Bdellovibrio und Bacteriovorax. Aufgrund von 16S rRNA Untersuchungen konnten auch innerhalb der Gattungen eine Vielzahl von phylogenetisch distinkten Arten nachgewiesen werden. In der Literatur wird eine regulierende Wirkung auf pathogene Gram-negative Bakterien für aquatische Systeme durch Bdellovibrionaceae beschrieben. Weiterhin konnten sie bei verschiedenen Nutztieren im Verdauungstrakt mikrobiologisch nachgewiesen werden. Ein positiver Einfluss auf die Gesundheit der Tiere wurde bei Vorkommen von B. bacteriovorus festgestellt. Für eine Charakterisierung von Umweltisolaten werden in der vorliegenden Arbeit genetische Methoden vorgestellt. Hierfür wurden Hybridisierungsmethoden und PCR-methoden entwickelt, die es ermöglichen aus der Umwelt isolierte Bdellovibrionaceae phylogenetisch einzuordnen. Es konnte gezeigt werden, das sowohl B. bacteriovorus als auch Bacteriovorax stolpii im Verdauungstrakt von Nutztieren vorkommen. Es ist weiterhin gelungen eine PCR-methode für Kotproben zu entwickeln, die einen direkten Nachweis ermöglicht ohne mikrobiologische Anzucht. B. bacteriovorus ist ein Gram-negatives Bakterium, allein dieser Sachverhalt spiegelt die Schwierigkeit wider, wenn der enzymattische Abbau von Zellwandbestandteilen der Beutebakterien Ziel der Untersuchung ist, da auch die Beutebakterien Gram-negativ sind. Es ergibt sich aufgrund eines ähnlichen Zellwandaufbaus ein immenses analytisches Problem die makromolekularen Bestandteile von Wirtsbakterium und Jäger zu trennen. Um dem Lebensstil angepasst Modifikationen von B. bacteriovorus zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit LPS, charakteristischer Bestandteil der Äußeren Membran, von Wildtypstamm B. bacteriovorus HD100 und seiner wirtsunabhängigen Mutante HI100 isoliert und das Lipid A strukturell aufgeklärt. Die Isolation gelang durch die Ausnutzung unterschiedlicher Fällungseigenschaften des LPS von B. bacteriovorus HD100 gegenüber des E. coli K-12 LPS aus dem Extraktionsmittel. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, das B. bacteriovorus S-Form LPS besitzt. Die außergewöhnliche Struktur des Lipid A von B. bacteriovorus wurde im Detail mit massenspektrometrischen Methoden, ein- und zweidimensionalen NMR Methoden sowie mikrochemischer Methoden in Kombination mit der GC/MS charakterisiert. Der Fettsäureanker besteht aus a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. Dies stellt eine neuartige Struktur dar, da an allen bisher bekannten Lipid A´s sich Brönstedtsäuren am hydrophilen Fettsäureanker befinden, die in physiologischer Lösung durch Protonenabgabe negative Ladungen tragen. Im Lipid A von B. bacteriovorus sind diese Substituenten durch den Neutralzucker Mannose ersetzt. Weiterhin wurden als Fettsäuren nur 3-Hydroxyfettsäuren nachgewiesen, wobei sich auf die 6 gebunden Fettsäuren etwa 1,5 Doppelbindungen verteilen. Dieses Lipid A zeigt eine wesentlich reduzierte endotoxische Aktivität im Vergleich zu E. coli Lipid A und weist als biophysikalische Besonderheit eine erhöhte Fluidität über einen weiten Temperaturbereich auf. Die vorgestellte 16S rRNA Analyse und die Strukturanalyse des Lipid A von B. bacteriovorus belegen seine besondere Stellung in der Welt der Bakterien. / Bdellovibrionaceae are extraordinary bacteria known as the smallest predatory organism so far. Since their discovery in soil samples by Stolp and Starr 1963 they have been detected in a wide range of other natural habitats. Bdellovibrionaceae became the focus of attention concerning their ability to attack pathogens like Escherichia coli, Salmonella and Yersinia. For Bdellovibrio bacteriovorus the most detailed studies are available. The up to now only partially understood lifecycle consists of several complex phases. In the attack phase B. bacteriovorus is motile possessing flagella and the preys are recognized by an unknown mechanism. After attachment on the cell wall within 15 to 30 minutes a pore is formed which is used as entrance to the periplasmatic space of the Gram-negative prey bacteria. The completion of the invasion process can be observed by the change of the prey s shape to spherical bdelloblasts. Inside of the prey B. bacteriovorus degrades macromolecular compounds and transforms into a long spirally shaped rod. At the end of the lifecycle the rod divides yielding 5 up to 30 daughter cells depending on the size of the prey bacteria. This reproduction phase is completed within 3 hours. The complex regulation of expression of a certain number of proteins was observed by one and two dimensional gelelectrophoresis. The complexity of the interaction between predator and prey were examined in several studies. Besides the obvious degradation of macromolecular compounds of the prey, reutilising of lipopolysaccharides (LPS) and Outer Membrane Proteins (OmP) into the membrane system of B. bacteriovorus was discussed. The biological interpretation of such behaviour was that it is more efficient for reproduction to recycle components of the prey than to perform de novo synthesis. Unexpectedly, despite the unique predatory lifecycle and common morphological features, Bdellovibrionaceae show a great phylogenetical diversity based on 16S rRNA analyses. Bdellovibrionaceae are divided into the three species Bdellovibrio bacteriovorus, Bacteriovorax stolpii, Bacteriovorax starrii and some strains yet to be assigned. In two studies Bdellovibrionaceae were found as part of regulation processes for decreasing the number of pathogenic Gram-negative bacteria in aquatic systems. Furthermore, B. bacteriovorus were found in the intestinal tract of several domestic animals showing a positive influence on the state of health. For the phylogenetic characterization of environmental isolates techniques were developed based on hybridisation methods and the PCR. In this work we detected B. bacteriovorus and B. stolpii strains in the gut of animals. Furthermore, a PCR method for direct detection of Bdellovibrionaceae in fecal samples was developed. B. bacteriovorus are Gram-negative bacteria. This fact complicates the study of the degradation of the prey s cell wall as it possesses the architecture of Gram-negative bacteria also. Furthermore, the search for important modifications of the cell wall of B. bacteriovorus concerning the predatory lifestyle becomes an analytical problem. In this study we isolated LPS of the wild type strain B. bacteriovorus HD100 and its host independent mutant strain HI100. For the isolation of pure B. bacteriovorus HD100 S-form LPS we took advantage of different precipitation properties in the extraction solvent of E. coli K-12 LPS and the predator s LPS. The structure of the lipid A was examined in detail by mass spectrometric methods, one- and two-dimensional NMR and chemical analytical techniques. The novel structure consists of backbone built of a-D-ManpII-(1(R)4)-ß-D-GlcpN3NII-(1(R)6)-ß-D-GlcpN3NI-(1(R)1)-a-D-ManpI. This is the first known natural lipid A without negatively charged substituents in physiological solution. The lipid A of B. bacteriovorus carries the neutral sugar mannose instead of Brönstedt acids. Furthermore, the lipid A exclusively consists of 3-hydroxy fatty acids with approximately 1.5 double bounds distributed on six bounded fatty acids. This lipid A shows a significant decreased endotoxic activity in comparison to E. coli lipid A and revealed increased fluidity over broad temperature range as further remarkable biophysical property. The 16S rRNA analysis and the structural analysis of the lipid A of B. bacteriovorus document the unique position in the world of bacteria.

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