Die RNA-abhängige Proteinkinase (PKR) ist eine Interferon-induzierte Proteinkinase mit einer zentralen Rolle in der antiviralen Immunantwort. Die Aktivierung von PKR wird durch Bindung viraler RNA oder spezifischer Protein-Regulatoren ausgelöst und resultiert in der Inhibierung der Translation und Induktion von Transkriptionsfaktoren für die Produktion proinflammatorischer Zytokine. Trotz intensiver Forschung ist es bisher nicht gelungen, das gesamte Spektrum von PKR-Regulatoren und Adaptorproteinen aufzudecken. In der vorliegenden Arbeit wurde mithilfe von quantitativer Massenspektrometrie eine systematische Analyse von PKR Bindungspartnern im Kontext einer Influenzavirusinfektion durchgeführt. Dabei wurden 47 Proteine identifiziert, die nach Infektion mit einem Influenza A Virus spezifisch an PKR gebunden waren. Die Interaktion von PKR und einem Teil der Proteine wurde validiert und es konnte gezeigt werden, dass einige der gefundenen Proteine die PKR-Phosphorylierung verstärkten. Hierbei wurde das KH-Typ Splicing regulatorische Protein (KSRP) als neuer Regulator von PKR identifiziert.Die Aktivierung von PKR durch KSRP wurde dabei durch direkte Interaktion der Proteine über die N-terminale Domäne von PKR vermittelt, war jedoch unabhängig von der RNA-Bindungsfunktion. Immunfluoreszenzversuche zeigten, dass die Infektion mit einer Virusmutante zur Umlagerung beider Proteine in Stress-Granula führte. Verringerte KSRP-Level beeinträchtigten die PKR-Aktivierung, was zu einer 10-fachen Verbesserung der Replikation von mutierten Influenzaviren in Zellen mit verringerter IFN-beta-Expression führte. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass KSRP die antivirale Abwehr durch direkte Bindung an PKR und die damit verbundene Steigerung der PKR-Aktivität unterstützt. Zusammenfassend unterstreichen die Ergebnisse das Vermögen quantitativer Massenspektrometrie antivirale Mechanismen systematisch aufzuklären, um potenzielle Ziele für antivirale Therapien zu finden. / The RNA-dependent protein kinase (PKR) is an interferon induced protein kinase that plays a significant role in innate antiviral immunity. Activation of PKR can be triggered by binding of viral RNA or distinct protein regulators and results in inhibition of translation and the induction of transcription factors that lead to production of proinflammatory cytokines. Over the last decades, extensive research was conducted to identify the whole network of PKR regulators and adaptor proteins, but it is most likely that still some pieces are missing to complete our understanding of PKR functions. This thesis provides a systematic analysis of PKR binding partners in the context of influenza A virus infection by using quantitative mass spectrometry. In total, 47 proteins that bound specifically to PKR after influenza A virus infection were identified. The interaction between PKR and a subset of candidates was validated and it was shown that some of the identified proteins upon overexpression induced PKR phosphorylation. Hereby, the KH-type-splicing regulatory protein (KSRP) was identified as a novel protein regulator of PKR. Activation of PKR by KSRP was mediated by direct interaction of KSRP with the N-terminal domain of PKR, but was found to be independent from dsRNA binding. Immunofluorescence experiments showed that upon infection with an influenza A mutant virus, both proteins were redistributed to cytoplasmic stress granules. Knockdown of KSRP impaired PKR activation and consequently rescued viral replication of influenza A mutant viruses by one order of magnitude in cells with reduced IFN-beta levels. It was shown for the first time that KSRP is able to support antiviral signalling by enhancing PKR activation in a process that involves direct protein-protein-interaction. Taken together, this study demonstrates the aptitude of quantitative mass spectrometry for elucidation of cellular antiviral response pathways to reveal potential new targets for antiviral therapy.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung genetischer Faktoren, die das Plasmaproteom regulieren. Die Untersuchungen wurden im Modellsystem einer F2-Kreuzung zweier Inzucht-Mausstämme (FVB.LDLR-/-, C57BL/6.LDLR-/-) durchgeführt, die sich in ihrer Atheroskleroseausprägung unterscheiden. Von jedem der 453 Tiere der F2-Generation wurden Plasmaproteomprofile mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF) generiert. Diese Spektren wurden in zwei unabhängigen Datenanalysen ausgewertet und eine Kopplungsanalyse (QTL-Analyse, quantitative trait loci) der Phänotypen mit jeweils 192 genetischen Markern in jedem der F2-Tiere durchgeführt. So wurden die Datensätze von Proteom und Genom miteinander kombiniert, um Genorte, die mit unterschiedlich regulierten Proteinen in Verbindung stehen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist bisher in der Literatur nicht beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wird sowohl die Methodik der statistischen Auswertung als auch die weitere Analyse der generierten Daten beschrieben. Es wurden zahlreiche hochsignifikante Kopplungssignale gefunden, von denen zwei durch die Identifizierung von Proteinen verifiziert werden konnten. Es handelt sich hierbei um das Apo-A2 des HDL auf Chromosom 1 und Hämoglobin subunit alpha auf Chromosom 11. Eine Kolokalisation der gefundenen Proteine mit Loci der Atherosklerosedisposition konnte nicht identifiziert werden. Dieser Ansatz zeigt erstmals, dass eine hypothesenfreie Verbindung proteomischer und genomischer Daten möglich ist und zur Identifizierung genetisch regulierter Plasmaproteine beitragen kann.

Despite tremendous advances in mass spectrometry instrumentation and mass spectrometry-based methodologies, global protein profiling of organellar, cellular, tissue and body fluid proteomes in different organisms remains a challenging task due to the complexity of the samples and the wide dynamic range of protein concentrations. In addition, large amounts of produced data make result exploitation difficult. To overcome these issues, further advances in sample preparation, mass spectrometry instrumentation as well as data processing and data analysis are required. The presented study focuses as first on the improvement of the proteolytic digestion of proteins in in-gel based proteomic approach (Gel-LCMS). To this end commonly used bovine trypsin (BT) was modified with oligosaccharides in order to overcome its main disadvantages, such as weak thermostability and fast autolysis at basic pH. Glycosylated trypsin derivates maintained their cleavage specifity and showed better thermostability, autolysis resistance and less autolytic background than unmodified BT. In line with the “accelerated digestion protocol” (ADP) previously established in our laboratory modified enzymes were tested in in-gel digestion of proteins. Kinetics of in-gel digestion was studied by MALDI TOF mass spectrometry using 18O-labeled peptides as internal standards as well as by label-free quantification approach, which utilizes intensities of peptide ions detected by nanoLC-MS/MS. In the performed kinetic study the effect of temperature, enzyme concentration and digestion time on the yield of digestion products was characterized. The obtained results showed that in-gel digestion of proteins by glycosylated trypsin conjugates was less efficient compared to the conventional digestion (CD) and achieved maximal 50 to 70% of CD yield, suggesting that the attached sugar molecules limit free diffusion of the modified trypsins into the polyacrylamide gel pores. Nevertheless, these thermostable and autolysis resistant enzymes can be regarded as promising candidates for gel-free shotgun approach. To address the reliability issue of proteomic data I further focused on protein identifications with borderline statistical confidence produced by database searching. These hits are typically produced by matching a few marginal quality MS/MS spectra to database peptide sequences and represent a significant bottleneck in proteomics. A method was developed for rapid validation of borderline hits, which takes advantage of the independent interpretation of the acquired tandem mass spectra by de novo sequencing software PepNovo followed by mass-spectrometry driven BLAST (MS BLAST) sequence similarity searching that utilize all partially accurate, degenerate and redundant proposed peptide sequences. It was demonstrated that a combination of MASCOT software, de novo sequencing software PepNovo and MS BLAST, bundled by a simple scripted interface, enabled rapid and efficient validation of a large number of borderline hits, produced by matching of one or two MS/MS spectra with marginal statistical significance.

Innerhalb der Arbeit wurden mit Hilfe eines DC-Glimmplasmas im Vakuumbereich zwischen 100 und 400 Pa auf kathodisch geschalteten, metallischen Substraten mittels silicium- und bororganischen Verbindungen Schichten abgeschieden. Unter den gewählten Bedingungen war eine Abscheidung von amorphen Hartstoffschichten bei niedriger Substrattemperatur (ca. 200–450 °C), geringem apparativen Aufwand und hohen Abscheideraten (bis zu 2.5 µm min-1) möglich. Anhand der Abscheidung mit Hexamethyldisilazan (HMDSN) und unterschiedlichen Arbeitsgasen (Wasserstoff, Argon, Stickstoff, Ammoniak, Sauerstoff, bzw. ohne Arbeitsgas) wurde der grundlegende Einfluss der Beschichtungsparameter (Plasmaleistung, Prozessdruck, Precursorfluss und Substratgröße) auf unterschiedliche Schichteigenschaften (Mikrostruktur, Ele-mentgehalt, optische und mechanische Eigenschaften) sowie auf die Abscheiderate untersucht und diskutiert. Zudem wurde das Abscheideverhalten von zwei weiteren siliciumorganischen, zwei borsiliciumorganischen und einer bororganischen Verbindung untersucht. Um Aussagen zum Wachstumsmechanismus treffen zu können, wurden mit Hilfe der differentiell gepumpten Massenspektroskopie quantitative Untersuchungen an den Reaktionsprodukten durchgeführt. Weiterhin wurde ein Beitrag zur Anwendung der IR-Spektroskopie in Reflexion zur Charakterisierung der auf nichttransparenten Substraten abgeschiedenen Schichten geleistet. Mittels einer numerischen Simulation der Spektren konnte die Schichtdicke, die Brechzahl sowie das Spektrum der Absorptionskonstante zur quantitativen, strukturellen Charakterisierung der abgeschiedenen Schichten ermittelt werden.

In der vorliegenden Arbeit wird die Synthese und die Charakterisierung von Carbosiloxandendrimeren der 1. – 3. Generation, welche periphere Me2SiH, MeSiH2 bzw. SiH3 Gruppen besitzen, vorgestellt. Ausgehend von diesen Verbindungen konnte am Beispiel eines mit einer Dimethylvinylsilyl-Einheit funktionalisierten Titanocendichlorides gezeigt werden, dass sich durch die Hydrosilylierungsreaktion metallorganische Bausteine an SiH-funktionalisierte Carbosiloxandendrimere anbinden lassen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildeten Carbosilandendrimere. Eine neue Variante der Darstellung dieser Moleküle durch die konvergente Synthesemethode mit Hilfe von kettenverlängernden, 1 zu 2 bzw. 1 zu 3 verzweigten Bausteinen konnte partiell erfolgreich durchgeführt werden. Die Anbindung von cyclischen (12-Krone-4, 15-Krone-5, 18-Krone-6, Sila-8-Krone-3, Sila-11-Krone-4) und acyclischen (Triethylenglycolmonomethylether) Polyethern an dendritische Carbosilane der 1. und 2. Generation wird ebenfalls beschrieben. Hierzu wurden Carbosilandendrimere mit peripheren SiH-Einheiten durch Hydrosilylierung mit den entsprechenden allyl- bzw. vinylfunktionalisierten Ethern zur Reaktion gebracht. Die auf diesem Weg erhaltenen Dendrimere mit endständigen cyclischen bzw. linearen Polyethern wurden mit Alkalimetallionen (Li+, Na+, K+) umgesetzt und die entstandenen Komplexe massenspektrometrisch untersucht.

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The characterization of lipids is performed by mass spectrometry based on structure specific fragments or by accurate mass measurements of intact precursor ions. The latter method, termed ’top-down lipidomics’, is due to its robustness, simplicity and speed a valuable tool for medical research to elucidate the molecular background of lipid metabolic disorders. The current thesis aims to improve the established lipidomics methods. Therefore, a new top-down lipidomics method was introduced that increased the analysis throughput, lipidome coverage and accuracy of quantification, compared to previous approaches, by rapid successive acquisition of high resolution Fourier transform mass spectra in positive and negative ion modes. Furthermore, the characterization of molecular lipid species by utilizing high energy collisional dissociation was achieved on Orbitrap instruments. The mass accuracy of acquired MS/MS spectra increased the confidence in identification for unusual very-long chain polyunsaturated phosphatidylcholine species and a new lipid class, the maradolipids. Beyond that, effort was made to enhance the accuracy and comparability of MS/MS based bottom-up lipidomics data. In this respect, lipids with varying degree of unsaturation were analyzed and revealed discrete fragmentation properties. The technical refined lipidomics methods allowed insight into the lipid composition of lipoproteins and changes of the blood plasma induced by apheresis. Lipidomics screening of blood plasma uncovered an altered lipid pattern in consequence of impaired glucose metabolism and type 2 diabetes. The lipidomics characterization of islet allowed their quality assessment.

All cells are delimited by membranes that protect the cell from the surrounding environment. In eukaryotic cells the same principle applies at subcellular level where membranes delimit functional cell organelles. The membrane structure, properties and function are defined in part by their lipid composition. Lipidomics is the large‐scale study of pathways and networks of cellular lipids in biological systems. It involves the identification and quantitation of cellular lipid molecular species and their interactions with other lipids, proteins, and other metabolites. Lipidomics has been greatly facilitated by recent advances in ionization technology and mass spectrometric capabilities which have simplified the sample processing prior to analysis, giving rise to shotgun lipidomics. Shotgun lipidomics is fast, highly sensitive, and can identify hundreds of lipids missed by other methods. However, Glycosphingolipids are an important lipid family that was out of the scope of shotgun lipidomics due to the lack of suitable analytical tools. The aim of my thesis was two‐fold. The first aim was the establishment of Glycosphingolipid identification and quantification by shotgun approach. This allowed us to perform lipidomic studies with unprecedented comprehensiveness (~300 lipid species from 15 different lipid classes) from low sample amounts and with minimal sample processing. The second was the application of this technology in studies of the role of lipids in several processes like vesicular carrier formation, cell polarization, protein delivery to the plasma membrane and viral budding. This work resulted in several findings. We found that there is sorting of sphingolipids and sterols into plasma membrane targeted vesicular carriers in budding yeast. When kidney cells change from a mesenchymal to an epithelial morphology there is a profound remodeling of their lipidome, with the synthesis of longer, more saturated, more hydroxylated, and more glycosylated sphingolipids. When these sphingolipids and sterols are depleted in epithelial cells, the apical transport in epithelial cells is impaired. These data strongly support the idea that lipid rafts play an important role in sorting and delivery of lipid and protein cargo to the plasma membrane. Finally, we found that the envelopes of vesicular stomatitis virus and Semliki forest virus assert little specificity in the incorporation of lipids from the plasma membrane. This weak specificity seems to be related to a combination of virus lipid bilayer asymmetry and curvature.

Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war die Untersuchung von Sepsis-assoziierten Veränderungen des Arachidonsäure (AA)-Metabolismus und die Identifikation differentiell regulierter AA-Metabolite mit Prüfung ihres diagnostischen Potentials bei Patienten mit Sepsis unter Anwendung eines in-vitro Lipopolysaccharid (LPS) Vollblutaktivierungs-Modells. In Zellüberständen von nicht-aktiviertem und LPS-aktiviertem Heparinblut (25 Sepsis- Patienten, 15 Gesunde) wurden AA-Metabolite mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem- Massenspektrometrie analysiert. In einer unabhängigen Kohorte (10 Sepsis-Patienten, 3 Gesunde) wurden nach RNA-Isolation aus Zellmaterial zusätzlich Target-Gene des AAMetabolismus (Cyclooxygenase (COX)-2 und mikrosomale Prostaglandin-E-Synthase (mPGES)-1 mittels quantitativer Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Es konnte eine differentielle Freisetzung von AA, AA-Analoga und der COX-assoziierten Metabolite Prostaglandin (PG) E2, 11-Hydroxyeicosatetraensäure (HETE) und Thromboxan (TX) B2 zwischen Patienten und gesunden Kontrollpersonen gezeigt werden. Sepsis-Patienten wiesen dabei gegenüber Gesunden eine deutlich reduzierte Freisetzung von AA und den COXassoziierten Metaboliten 11-HETE und PGE2 auf. Das Ausmaß der reduzierten Mediatorenfreisetzung bei Sepsis-Patienten war mit der Schwere der Erkrankungssymptomatik und dem klinischen Outcome assoziiert. Auf Genexpressionsebene zeigte sich eine reduzierte Induzierbarkeit der COX-2 mRNA-Expression bei Sepsis-Patienten gegenüber Gesunden, jedoch eine erhaltene Induzierbarkeit auf der Ebene der mPGES-1.:I Bibliographische Beschreibung………………………………………………………2 II Abkürzungen……………………………..……………………………………………4 III Einleitung 1. Epidemiologie und Definition der Sepsis……………………………………………..…6 2. Pathophysiologie der Sepsis……………………………………………………………..7 3. Stellenwert und Limitationen labordiagnostischer Marker bei Sepsis…………………..8 4. Eicosanoide und Sepsis…………………………………………………………………10 5. In-vitro LPS Vollblutaktivierungs-Modell für die Prüfung der Eicosanoidantwort auf Genexpressions- und Mediatorenebene……………..................12 6. Bestimmung von Eicosanoiden mittels LC-MS/MS........................................................16 7. Zielstellung der Arbeit……………………………………………………………….....18 IV Publikation…………………………………………………………….......................19 V Zusammenfassung der Arbeit………………………………………………………29 VI Literatur……………………………………………………………………………...32 VII Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit.………..…………….....35 VIII Lebenslauf………………………………………………………………………........36 IX Spezifizierung des wissenschaftlichen Beitrages zur Publikation...........................38 X Danksagung………………………………………………………………………......39

Diese Dissertation legt den Grundstein für eine neue experimentelle Technik zur Untersuchung einzelner Nanopartikel in der Gasphase, durch Kombination von Nanopartikel-Massenspektrometrie (NPMS) mit Photodissoziations-Wirkungsspektroskopie. Zu diesem Zweck wurde ein neues NPMS Experiment entworfen, konstruiert und charakterisiert. NPMS, ist eine Technik bei der die absolute Masse eines einzelnen Nanopartikels in einer Paul-Falle optisch und daher zerstörungsfrei bestimmt wird. Die wesentliche Neuerung des aktuellen Aufbaus, und Kernelement dieser Arbeit, ist eine neue Tieftemperatur-Ionenfalle, mit verbessertem optischen Zugang, Temperaturkontrolle (8 to 350 K) und elektrischem Potential im Vergleich zu bisher verwendeten Modellen. / This doctoral thesis lays the foundations for a novel experimental technique, combining nanoparticle mass spectrometry (NPMS) with photodissociation action spectroscopy, to investigate single nanoparticles in the gas phase. To this end, a new NPMS setup was designed, constructed and characterized. NPMS , currently used in only a few laboratories worldwide, is a technique where the absolute mass of a single nanoparticle, trapped in a quadrupole ion trap (QIT), is determined non-destructive by optical means. The essential novelty of the current setup, and core element of this thesis, is a new cryogenic split-ring electrode trap (SRET) design, with improved optical access, temperature control (8 to 350 K) and trapping potential compared to previously used versions.