Matrix remodeling could be an important mode of action of multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) in extracellular matrix (ECM) disease, but knowledge is limited in this respect. As MSC are well-known to adapt their behavior to their environment, we aimed to investigate if their mode of action would change in response to healthy versus pathologically altered ECM. Human MSC-derived ECM was produced under different culture conditions, including standard culture, culture on Matrigel-coated dishes, and stimulation with the pro-fibrotic transforming growth factor-1 (TGF1). The MSC-ECM was decellularized, characterized by histochemistry, and used as MSC culture substrate reflecting different ECM conditions. MSC were cultured on the different ECM substrates or in control conditions for 2 days. Culture on ECM increased the presence of surface molecules with ECM receptor function in the MSC, demonstrating an interaction between MSC and ECM. In MSC cultured on Matrigel-ECM and TGF1-ECM, which displayed a fibrosis-like morphology, gene expression of collagens and decorin, as well as total matrix metalloproteinase (MMP) activity in the supernatant were decreased as compared with control conditions. These results demonstrated that MSC adapt to their ECM environment, which may include pathological adaptations that could compromise therapeutic efficacy.

Functional impairment of the bone marrow (BM) niche has been suggested as a major reason for prolonged cytopenia and secondary graft failure after allogeneic hematopoietic cell transplantation (alloHCT). Because mesenchymal stromal cells (MSCs) serve as multipotent progenitors for several niche components in the BM, they might play a key role in this process. We used collagenase digested trephine biopsies to directly quantify MSCs in 73 patients before (n = 18) and/or after alloHCT (n = 65). For the first time, we demonstrate that acute graft-versus-host disease (aGvHD, n = 39) is associated with a significant decrease in MSC numbers. MSC reduction can be observed even before the clinical onset of aGvHD (n = 10). Assessing MSCs instantly after biopsy collection revealed phenotypic and functional differences depending on the occurrence of aGvHD. These differences vanished during ex vivo expansion. The MSC endotypes observed revealed an enhanced population of donor-derived classical dendritic cells type 1 and alloreactive T cells as the causing agent for compartmental inflammation and MSC damage before clinical onset of aGvHD was ascertained. In conclusion, MSCs endotypes may constitute a predisposing conductor of alloreactivity after alloHCT preceding the clinical diagnosis of aGvHD.

[ES] Actualmente la insuficiencia cardiaca es una de las principales causas de mortalidad y co-morbilidad a nivel mundial sobre todo en países desarrollados. Este tipo de patología a su vez, se desglosa en un gran abanico de posibles agentes que perturban el funcionamiento del músculo cardiaco en función de su causa. Uno de los problemas más importantes a niveles de afectación cardiaca se centra en pacientes que sufren algún tipo de cáncer y son tratados con antraciclinas. Estas drogas ampliamente usadas en el mundo de la oncología, tienen una serie de efectos secundarios entre los cuales destaca su posible efecto cardiotóxico. Este trabajo ahonda sobre este proceso y sobre la existencia de un perfil de paciente con una susceptibilidad a sufrir este tipo de episodios de toxicidad cardiaca. En este sentido, se investiga una serie de miRNAs que se encuentran diferencialmente expresados en pacientes que sufren este tipo de episodios frente a los que no. Una vez se detectan estos miRNA generamos un algoritmo predictor mediante el cual somos capaces de predecir si un paciente sufrirá cardiotoxicidad en función de la cantidad de ciertos miRNAs presentes en suero. Una vez descubiertos estos miRNAs nos centramos en la búsqueda de una posible opción terapéutica para esta serie de eventos. Para ello usamos las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células mesenquimales estromales (MSC), unas células que han demostrado tener un alto potencial terapéutico y de gran seguridad. Se evaluó su capacidad terapéutica en el daño inducido por doxorrubicina y posteriormente se amplió el estudio añadiendo el daño por isquemia reperfusión en diferentes frentes como puede ser la regeneración cardiaca, inhibición de la fibrosis o neoangiogénesis. Aunque es necesario un estudio más exhaustivo de los perfiles de cardiotoxicidad y de los mecanismos de acción tanto de los miRNAs como de las EVs, esta tesis demuestra la capacidad de ambos como una potente herramienta tanto de diagnóstico como terapéutica. / [CA] Actualment la insuficiència cardíaca és un dels principals causes de mortalitat i co-morbiditat a nivell mundial sobretot en països desenvolupats. Aquest tipus de patologia al seu torn, es desglossa en un gran ventall de possibles agents que pertorben el funcionament de l'múscul cardíac en funció de la seva causa. Un dels problemes més importants a nivells d'afectació cardíaca se centra en pacients que pateixen algun tipus de càncer i són tractats amb antraciclines. Aquestes drogues àmpliament usades en el món de l'oncologia, tenen una sèrie d'efectes secundaris entre els quals destaca el seu possible efecte cardiotòxic. Aquest treball aprofundeix sobre aquest succés i sobre ha un perfil de pacient amb una susceptibilitat a patir aquest tipus d'episodis de toxicitat cardíaca. En aquest sentit s'investiga una sèrie de miRNAs que es troben diferencialment expressats en pacients que pateixen aquest tipus d'episodis enfront dels que no. Un cop es detecten aquests miRNA generem un algoritme predictiu mitjançant el qual, som capaços de predir si un pacient patirà cardiotoxicitat en funció de la quantitat de certs miRNAs presents en sèrum. Un cop descoberts aquests miRNAs ens centrem en la recerca d'una possible opció terapèutica per a aquesta sèrie d'esdeveniments. Per a això fem servir les vesícules extracelulres derivades de cèl·lules mesesnquimales, unes cèl·lules que han demostrat tenir un alt potencial terapèutico i de gran seguretat. Es testen la seva capacitat terapèutica en el dany per doxurbicina i posteriorment s'amplia l'estudi afegint el dany per isquèmia reperfusió en diferents fronts com pot ser la regeneració cardíaca, inhibició de la fibrosi o neoangiogènesi. Encara que és necessari un estudi més exhaustiu dels perfils de cardiotoxicitat i dels mecanismes d'acció tant dels miRNAs com de les EVs, aquesta tesi demostra la capacitat de tots dos com una potent eina tant de diagnòstic com terapèutica. / [EN] Heart failure is currently one of the main causes of mortality and co-morbidity worldwide, especially in developed countries. This type of pathology, can be broken down into a wide range of possible agents that disturb the functioning of the cardiac muscle depending on its cause. One of the most important problems in terms of cardiac involvement is centered on patients who suffer from some type of cancer and are treated with anthracyclines. These drugs, widely used in the world of oncology, have a series of side effects, among which their possible cardiotoxic effect stands out. This work delves into this event and into the existence of a patient profile with a susceptibility to suffer this type of episodes of cardiac toxicity. In this sense, we investigate a series of miRNAs that are differentially expressed in patients who suffer this type of episodes versus those who do not. Once these miRNAs were detected, we generated a predictive algorithm by which we are able to predict whether a patient will suffer cardiotoxicity based on the amount of certain miRNAs present in serum. Once these miRNAs were discovered, we focused on the search for a possible therapeutic option for this series of events. For this we used extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal cells (MSC), cells that have been shown to have a high therapeutic potential and high safety. We tested their therapeutic capacity in doxorubicin injury and later extended the study by adding ischemia reperfusion injury on different fronts such as cardiac regeneration, inhibition of fibrosis or neoangiogenesis. Although a more exhaustive study of the cardiotoxicity profiles and mechanisms of action of both miRNAs and EVs is needed, this thesis demonstrates the capacity of both as a powerful diagnostic and therapeutic tool. / Sánchez Sánchez, R. (2021). Estudio del papel de los miRNAs y las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales en la patología cardiaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177178

[ES] Las células mesenquimales estromales (MSC) poseen una serie de cualidades inmunológicas, pro-angiogénicas y regenerativas que las convierten en un excelente candidato para el tratamiento de diversas patologías. A pesar de las pruebas contundentes obtenidas en modelos preclínicos que demuestran la actividad terapéutica de las MSC, los ensayos clínicos no han podido mostrar hasta ahora un beneficio consistente, probablemente debido a deficiencias metodológicas y a la falta de estandarización, así como a la variabilidad genética intrínseca a los estudios en humanos. Debido a ello, ha sido necesario profundizar en los mecanismos responsables del beneficio terapéutico y rediseñar las estrategias clínicas. En los últimos años, se ha observado que la reparación tisular mediada por las MSC se produce de forma paracrina, y se ha constatado que las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por las MSC (EVMSC) son capaces de recapitular las propiedades inmunosupresoras de las células parentales. Además, las estrategias terapéuticas basadas en vesículas tienen grandes ventajas en términos de bioseguridad y producción en condiciones de grado clínico, reduciendo significativamente el coste de dichas terapias. Sin embargo, la dosis efectiva en grandes mamíferos, incluidos los humanos, es bastante elevada y la producción industrial de EVs se ve dificultada en parte, por la senescencia proliferativa que afecta a las MSC durante la expansión celular masiva. En este trabajo hemos intentado solventar los principales escollos de la terapia con EVs incrementando su potencial inmunosupresor y reduciendo por tanto la dosis efectiva. Este incremento se ha conseguido gracias a la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1-alpha y al desarrollo de un medio de acondicionamiento en cultivo basado en citoquinas. Además, la inmortalización de las células secretoras mediante la transducción del gen de la telomerasa humana ha permitido tanto la estandarización del producto como su producción a gran escala. La eficacia de estas EVs ha sido testada en diferentes poblaciones celulares in vitro: linfocitos T, monocitos, células Natural Killer, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos; y en dos modelos de ratón: hipersensibilidad retardada y colitis aguda inducida por TNBS. En conclusión, hemos desarrollado una fuente de EVs de larga duración que secreta grandes cantidades de vesículas con mayor capacidad inmunosupresora y antiinflamatoria, facilitando un producto terapéutico más estándar y fácil de producir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. / [CA] Les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) posseeixen una sèrie de qualitats immunològiques, pro-angiogèniques i regeneratives que les converteixen en un excel·lent candidat per al tractament de diverses patologies. Tot i les proves contundents obtingudes en models preclínics que demostren l'activitat terapèutica de les MSC, els assaigs clínics no han pogut mostrar fins ara un benefici consistent, probablement degut a deficiències metodològiques i a la manca d'estandardització, així com a la variabilitat genètica intrínseca als estudis en humans. A causa d'això, ha calgut aprofundir en els mecanismes responsables del benefici terapèutic i redissenyar les estratègies clíniques. En els últims anys, s'ha observat que la reparació tissular intervinguda per les MSC es produeix de forma paracrina, i s'ha constatat que les vesícules extracel·lulars (EVs) secretades per les MSC (EVMSC) són capaços de recapitular les propietats immunosupressores de les cèl·lules parentals. A més, les estratègies terapèutiques basades en vesícules tenen grans avantatges en termes de bioseguretat i producció en condicions de grau clínic, reduint significativament el cost d'aquestes teràpies. No obstant això, la dosi efectiva en grans mamífers, inclosos els humans, és bastant elevada i la producció industrial de les EVs es veu dificultada en part, per la senescència proliferativa que afecta les MSC durant l'expansió cel·lular massiva. En aquest treball hem intentat solucionar els principals esculls de la teràpia amb EVs incrementant el seu potencial immunosupressor i reduint per tant la dosi efectiva. Aquest increment s'ha aconseguit gràcies a la sobreexpressió del factor induïble per hipòxia 1-alpha i a el desenvolupament d'un mitjà de condicionament en cultiu basat en citoquines. A més, la immortalització de les cèl·lules secretores mitjançant la transducció del gen de la telomerasa humana ha permès tant l'estandardització del producte com la seva producció a gran escala. L'eficàcia d'aquestes EVs ha estat testada en diferents poblacions cel·lulars in vitro: limfòcits T, monòcits, cèl·lules Natural Killer, macròfags, cèl·lules endotelials i fibroblasts; i en dos models de ratolí: hipersensibilitat retardada i colitis aguda induïda per TNBS. En conclusió, hem desenvolupat una font de EVs de llarga durada que secreta grans quantitats de vesícules amb major capacitat immunosupressora i antiinflamatòria, facilitant un producte terapèutic més estàndard i fàcil de produir per al tractament de malalties inflamatòries inmunomediades. / [EN] Mesenchymal stromal cells (MSC) possess several immunological, pro-angiogenic and regenerative qualities that make them an excellent candidate for the treatment of various pathologies. Despite compelling evidence from preclinical models demonstrating the therapeutic activity of MSCs, clinical trials have so far failed to show consistent benefit, probably due to methodological shortcomings and lack of standardisation, as well as the genetic variability intrinsic to human studies. As a result, it has been necessary to further investigate the mechanisms responsible for therapeutic benefit and to redesign clinical strategies. In recent years, it has been observed that MSC-mediated tissue repair occurs in a paracrine pathway, and it has been confirmed that extracellular vesicles (EVs) secreted by MSC (EVMSC) are able to recapitulate the immunosuppressive properties of the parental cells. Moreover, vesicle-based therapeutic strategies have great advantages in terms of biosafety and production under clinical-grade conditions, significantly reducing the cost of such therapies. However, the effective dose in large mammals, including humans, is quite high and the industrial production of EVs is hampered in part by the proliferative senescence that affects MSC during massive cell expansion. In this work, we have attempted to overcome the main challenges of EVs therapy by increasing their immunosuppressive potential and thus reducing the effective dose. This increase has been achieved by overexpression of hypoxia-inducible factor 1-alpha and the development of a cytokine-based culture conditioning medium. In addition, immortalization of secretory cells by transduction with the human telomerase gene has allowed both product standardisation and large-scale production. The efficacy of these EVs has been tested in different cell populations in vitro: T lymphocytes, monocytes, Natural Killer cells, macrophages, endothelial cells and fibroblasts; and in two mouse models: delayed-type hypersensitivity and TNBS-induced acute colitis. In conclusion, we have developed a long-lasting source of EVs that secretes large amounts of vesicles with enhanced immunosuppressive and anti-inflammatory capacity, providing a more standard and easier-to-produce therapeutic product for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. / Gómez Ferrer, M. (2022). Terapias innovadoras basadas en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales modificadas genéticamente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182560

Mesenchymale Stromazellen (MSC) unterstützen die endogene Geweberegeneration und sind kaum immunogen. Die Mechanismen der Immunmodulation sind kaum bekannt. Diese Arbeit untersucht, ob MSC in die Interaktion von Dendritischen Zellen (DC), Natürlichen Killer (NK) und T Zellen eingreifen, indem sie die DC-Reifung beeinflussen. Das Netzwerk ist wichtig für die Differenzierung naïver T Zellen zu Typ 1 T Helferzellen (Th1). Abhängig vom DC-Subtyp und dem Zeitpunkt des Aufeinandertreffens, beeinflussten Knochenmark-MSC (BM-MSC) die in vitro DC-Reifung verschieden. Sie inhibierten die Differenzierung, aber nicht die Reifung humaner von Monozyten-abgeleiteter DC (moDC). BM MSC hatten keinen klaren Einfluss auf die Reifung plasmazytoider DC (pDC), während sie in aktivierten CD1c+ myeloiden DC (mDC) einen tolerogenen Phänotyp induzierten, charakterisiert durch eine geringere CCR7-abhängige Migration und ein tolerogenes Zytokinprofil. Daraus resultierend, wiesen BM-MSC-geprägte mDC aufgrund der veränderten IL 12/IL 10 Sekretion eine geringere Fähigkeit zur Stimulation der IFNγ Produktion in NK Zellen auf und induzierten weniger Th1 Differenzierung naïver T Zellen. Placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD) erzielten ähnliche Ergebnisse. Es konnte keine Alloimmunogenität in Patienten mit kritischer Ischämie der Extremitäten (CLI), die im Rahmen einer Phase I klinischen Studie allogene PLX PAD erhalten hatten, nachgewiesen werden. Keiner der Patienten entwickelte eine signifikante Gedächtnis T Zellantwort spezifisch für das Zellprodukt, was durch unsere in vitro Beobachtungen erklärbar sein könnte. Es ist schwierig MSC im Gewebe nachzuweisen, da Markerkombinationen notwendig sind. CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC konnten mithilfe einer neuen Multiplex-Immunhistologie-Technik (Chipzytometrie) in humanen Plazentaschnitten detektiert werden. Für die Zukunft könnte damit die Interaktion injizierter MSC mit Immunzellen in Biopsien untersucht werden. / Mesenchymal stromal cells (MSC) support endogenous tissue regeneration and seem to be low immunogenic, allowing application across MHC barriers. But little is known about the mechanisms for their immunomodulation. Hence, the main goal of this study was to understand if MSC interfere with the crosstalk between dendritic cells (DC), natural killer (NK) and T cells by influencing DC maturation. This network is important for efficient priming of naïve T cells into type 1 helper T cells (Th1). Bone marrow-derived MSC (BM-MSC) had diverse effects on DC maturation in vitro, depending on the DC subset and the time of interaction. BM MSC inhibited differentiation but not maturation of monocyte-derived DC (moDC). They did not have a clear effect on maturation of plasmacytoid DC (pDC), whereas they induced a tolerogenic phenotype in activated CD1c+ myeloid DC (mDC), characterized by an impaired CCR7-dependent migration and a tolerogenic cytokine profile. Consequently, BM-MSC-licensed mDC displayed a reduced ability to induce IFNγ production in NK cells due to their altered IL 12/IL 10 secretion. BM MSC-licensed mDC also induced less efficiently Th1 lineage commitment of naïve T cells. Similar results were observed with placenta-derived mesenchymal-like adherent stromal cells (PLX PAD). Samples from critical limb ischemia (CLI) patients treated with MHC-unmatched PLX-PAD within a phase I clinical trial were analysed for alloimmunogenicity. None of the patients developed a significant memory T cell response specific to the allogeneic cells, which might be explainable by our in vitro observations. MSC are difficult to detect in tissues because a set of lineage markers is needed. Here, CD73+CD90+CD105+CD45-CD34-CD14-CD19- MSC could be identified in human placenta cryosections using a novel multiplex-immunohistology technique (chipcytometry), offering the possibility to investigate the crosstalk between injected MSC and attracted immune cells in patient biopsies in the future.

Endothelzell-basierte Therapien vermitteln regenerative Effekte hinsichtlich der Revaskularisierung von ischämischen Geweben. Doch ist die Verfügbarkeit von autologen Endothelzellen aufgrund einer krankheitsbedingt reduzierten Frequenz im peripheren Blut oder einer verminderten Integrität der endogenen Endothelzell-Populationen eingeschränkt. Hingegen ist es möglich, allogene endotheliale Vorläuferzellen aus der Nabelschnur in zelltherapeutisch relevanten Mengen zu isolieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die Eigenschaften allogener humaner Nabelschnur (NS)-abgeleiteter sog. Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) mit denen von venösen NS-abgeleiteten Endothelzellen verglichen. Aufgrund der nachgewiesenen Immunogenität von allogenen ECFCs wurde eine weiterführende Strategie zur Reduktion dieser immunogenen Eigenschaften durch die Koapplikation mit Mesenchymalen Vorläuferzellen (MSCs) verfolgt. Humane ECFCs wurden mit MSCs desselben Spenders kombiniert und in funktionellen in vitro- und in vivo-Assays untersucht. Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass IFNγ-stimulierte ECFC/MSC-Kokulturen eine reduzierte Expression von HLA-Molekülen zeigen. Entsprechend induzierten spezifische CD8+ T-Zellen eine reduzierte Lyse der kokultivierten ECFCs und MSCs. Die Kokultur von ECFCs und MSCs mit allogenen Immunzellen führte zu einer nahezu vollständigen Inhibition der T-Zell-Proliferation. Um die reduzierte Immunogenität von ECFC und MSC in vivo zu verifizieren, wurden die Zellen in immundefiziente Mäuse injiziert, welche nachfolgend mit humanen PBMCs rekonstituiert wurden. So konnte nachgewiesen werden, dass die Koapplikation von ECFCs und MSCs nicht nur die Entstehung von stabilen Gefäßnetzwerken begünstigt, sondern zudem in den Transplantaten zu einer verringerten Immunzell-Infiltration führte. Die Koapplikation von ECFCs mit MSCs könnte daher eine klinische Nutzung dieser allogenen Quelle für die therapeutische Unterstützung der Vaskularisierung ermöglichen. / Endothelial cell-based therapies promote tissue regeneration and vascularization after ischemic damage. The availability of autologous endothelial progenitor cells is restricted in diseased patients, however therapeutically relevant numbers of allogeneic Endothelial Progenitor Cells can be isolated from an umbilical cord (UC). In the present study, the immunogenic properties of these Endothelial Colony Forming Cells (ECFCs) were first compared to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Both cytokine-treated endothelial cells induced CD4+ and CD8+ T cell proliferation after coculture with allogeneic immune cells. So far, the potential interactions between ECFCs and Mesenchymal Stem/Progenitor Cells (MSCs) concerning their immunological features is poorly understood, but we hypothesize that MSCs might improve the immune compatibility and vessel building characteristics of ECFCs. Therefore, human UC-derived ECFC and MSC cocultures from the same donor were analyzed using various functional in vitro and in vivo assays. Stimulation of these cocultures with IFNγ caused strongly reduced expression levels of HLA-molecules compared to ECFC monocultures. The decreased molecular density on the cocultured ECFCs resulted in reduced cytotoxic CD8+ T cell-mediated lysis. Further, during IFNγ stimulation, the combination of ECFCs with MSCs prevented initiation of allogeneic T cell proliferation. To verify this concept in vivo, ECFCs and MSCs were co-transplanted in a humanized allograft mouse model in immunodeficient mice in order to effectively induce stable microvessels. These experiments demonstrate that when MSCs are co-applied with ECFCs, they not only support the formation of stable blood vessels, but also lead to fewer HLA-DR+ human vascular structures and fewer infiltrating human leukocytes. The data presented indicate that crosstalk between UC-derived ECFCs and MSCs might lower the risk of allogeneic ECFC rejection.

[ES] Las intervenciones actuales utilizadas en el ámbito clínico durante el infarto agudo de miocardio (IAM) se centran en la revascularización de la zona isquémica. Entre dichas estrategias, la angioplastia coronaria, procedimiento por el cual se utiliza un catéter para desobstruir la arteria ocluida, es el método más utilizado. Sin embargo, se ha descrito este proceso (conocido como reperfusión) desencadena un daño adicional en el miocardio, por lo que la combinación de dicha intervención con moléculas cardioprotectoras resulta de gran interés para tratar de reducir el tamaño del infarto. El presente trabajo propone dos nuevas moléculas con el fin de precondicionar el área isquémica antes de la reperfusión en el contexto del IAM. La primera estrategia propuesta se ha basado en el aporte de un ácido graso (diDHA) en la zona isquémica antes de la reperfusión para tratar de reducir el estrés de los cardiomiocitos y el número de células muertas antes de la reperfusión. Además, se han sintetizado nanoconjugados basados en la unión covalente de diDHA a un unido covalentemente a un esqueleto polimérico (ácido poli-L-glutámico, PGA) con el fin de incrementar la estabilidad del diDHA y conseguir una liberación controlada de la molécula. Los resultados obtenidos mostraron que la formulación PGA-diDHA6.4 fue la más optimizada, mostrando un mejor efecto en el precondicionamiento de los cardiomiocitos antes de la reperfusión en términos de reducción de apoptosis, generación de especies reactivas de oxígeno y mantenimiento de la función mitocondrial in vitro. Además, dicho nanoconjugado también mostró un modesto efecto terapéutico cuando se administró en modelos in vivo de isquemia-reperfusión en ratas y cerdos, reduciendo el tamaño final de infarto respecto a los grupos control. La segunda estrategia terapéutica propuesta se ha centrado en aumentar el potencial terapéutico de las vesículas celulares de pequeño tamaño (SEV o exosomas) procedentes de medio condicionado de células madre estromales (MSC). Numerosos estudios han descrito el papel terapéutico de factores paracrinos secretados por las MSC, donde se incluyen tanto factores solubles como vesículas extracelulares (EV) y, en especial, SEV. Diversas estrategias, como la modificación genética o precondicionamiento de estas células, han sido utilizadas para aumentar el potencial terapéutico de las mismas. En este trabajo se ha propuesto la modificación genética de las MSC con el objetivo de enriquecer las SEV en proteínas de interés que pudiesen potenciar el efecto terapéutico de las SEV nativas. En base a estudios previos, donde se ha visto que la oncostatina-M (OSM) podría jugar un papel anti-fibrótico en el contexto del IAM, se decidió incorporar dicha proteína en la superficie de las SEV derivadas de MSC mediante su fusión con proteínas presentes de forma natural en la superficie de las SEV, con el objetivo de desencadenar una respuesta en las células diana. La modificación de la secuencia de la OSM y su fusión con la tetraspanina CD81 permitieron cargar de manera efectiva la OSM en la superficie de las SEV, y los resultados preliminares en fibroblastos ventriculares cardíacos mostraron un efecto funcional beneficioso con respecto a los SEV control y los enriquecidos en CD81, reduciendo la tasa de proliferación de las células en condiciones de ayuno, y modificando la expresión y la liberación de la proteína telo-Col1α1 en las células después de ser estimuladas con TGFβ-1, α-dextrano y ácido ascórbico-L-sulfato En resumen, dos nuevas estrategias terapéuticas avanzadas libres de células han sido propuestas en el presente trabajo, donde se han mostrado resultados preliminares prometedores para reducir el daño en el miocardio tras el IAM en términos de reducción de apoptosis de cardiomiocitos y de activación de fibroblastos car / [CA] Les intervencions actuals utilitzades en l'àmbit clínic durant l'infart agut de miocardi (IAM) se centren en la revascularització de la zona isquèmica. Entre aquestes estratègies, l'angioplàstia coronària, procediment pel qual s'utilitza un catèter per a desobstruir l'artèria oclosa, és el procés més utilitzat. No obstant això, s'ha descrit que aquest procés (conegut com a reperfusió) desencadena un mal addicional en el miocardi. En conseqüència, la combinació d'aquesta intervenció amb molècules cardioprotectores resulta de gran interés per a tractar de reduir la grandària de l'infart. El present treball proposa dues noves molècules amb potencial cardioprotector en el context del IAM. Com a primera estratègia terapèutica, s'ha proposat l'aportació d'un àcid gras (diDHA) a la zona isquèmica del miocardio abans de la reperfusió per a tractar de reduir l'estrés dels cardiomiocitos i el nombre de cèl·lules mortes abans de la reperfusió. A més, s'han sintetitzat nanoconjugats basats en la unió covalent de diDHA a un esquelet polimèric (àcid poli-L-glutàmic, PGA) amb la finalitat d'incrementar l'estabilitat del diDHA i aconseguir un alliberament controlat de la molècula. Els resultats obtinguts van mostrar que la formulació PGA-diDHA6.4 va ser la més efectiva, mostrant un millor efecte en el precondicionament dels cardiomiocitos abans de la reperfusió en termes de reducció d'apoptosi, generació d'espècies reactives d'oxigen i manteniment de la funció mitocondrial in vitro. A més, el nanoconjugat PGA-diDHA6.4 també va mostrar un modest efecte terapèutic quan es va administrar en models in vivo d'isquèmia-reperfusió en rates i porcs, reduint la grandària final d'infart respecte als grups control. La segona estratègia proposada s'ha centrat en potenciar l'efect terapèutic de vesícules extracelul·lars de xicoteta grandària (SEV o exosomes) que son secretades per cèl·lules mare estromales. Nombrosos estudis han descrit el paper terapèutic de factors paracrinos secretats per les MSC, on s'inclouen tant factors solubles com vesícules extracelul·lars (EV) i, especialment, les SEV. Diverses estratègies, com la modificació genètica o el precondicionament de les MSC, s'han estudiat per augmentar el potencial terapèutic d'aquestes cèl·lules. En aquest treball, es va pensar en la modificació genètica de les MSC amb l'objectiu d'enriquir les SEV en proteïnes d'interés que pogueren potenciar l'efecte terapèutic de les SEV natives. Sobre la base d'estudis previs, on s'ha vist que la oncostatina-M (OSM) podria jugar un paper anti-fibròtic en el context del IAM, es va decidir incorporar aquesta proteïna en la superfície de les SEV derivades de MSC mitjançant la seua fusió amb proteïnes presents de manera natural en la superfície de les SEV, amb l'objectiu de desencadenar una resposta en les cèl·lules diana. La modificació de la seqüència de la OSM i la seua fusió amb la tetraspanina CD81 van permetre carregar de manera efectiva la OSM en la superfície de les SEV, i els resultats preliminars en fibroblastos ventriculars cardíacs van mostrar un efecte funcional respecte als SEV control i els enriquits en CD81, reduint la taxa de proliferació de les cèl·lules en condicions de dejuni, i modificant l'expressió i la secreció de la proteïna telo-Col1α1 en les cèl·lules després de ser estimulades amb TGFβ-1, α-dextran i àcid ascòrbic-L-sulfat, simulant una activació dels fibroblastos in vitro. En resum, dues noves estratègies terapèutiques avançades lliures de cèl·lules han sigut proposades en el present treball, on s'han mostrat resultats preliminars prometedors per a reduir el mal en el miocardi després del IAM en termes de reducció d'apoptosi de cardiomiocitos i d'activació de fibroblastos cardíacs. / [EN] Current therapeutic approaches against acute myocardial infarction (AMI) are focused on myocardial ischemic zone revascularization. The most common strategy is called primary angioplasty, in which a catheter is introduced to unblock the affected artery and restore blood flux, in a process called reperfusion. Nevertheless, an additional injury on cardiac tissue is caused after reperfusion, and the combination of primary angioplasty with the use of cardioprotective molecules has emerged as a potential strategy to reduce cardiac tissue injury. Two new cell-free therapeutic strategies to preconditionate myocardial ischemic area before reperfusion have been proposed to reduce cardiac injury after AMI. The first therapeutic strategy proposed consisted on the input of a free fatty acid (di-docosahexaenoic acid, diDHA) covalently bound to a polymeric backbone (poly-L-glutamic acid, PGA) in order to increase diDHA solubility and stability and modulate its effect on target cells. Results showed that PGA-diDHA6.4 conjugate administration during ischemia protected cardiomyocytes from reperfusion-induced injury, as apoptotic number of cells and oxidative stress was reduced, and mitochondrial function was less affected when compared to untreated cells. In addition to this, PGA-diDHA6.4 also showed therapeutic effects when locally administered in an ischemia-reperfusion in vivo model in rats and pigs, where a modest reduction of area at risk was observed compared to control groups. The second cell-free strategy proposed in this work was focused on enhancing the therapeutic potential of small extracellular vesicles (SEV or exosomes) isolated form mesenchymal stromal cells (MSC) conditioned media. Previous studies have described the therapeutic potential of paracrine factors released by MSC, where both soluble factors and vesicular components are included. In particular, SEV have gained special attention. Several stretegies, such as genetic modification or cell preconditioning, have been tested to enhance the MSC therapeutic potential. In this work, it was proposed MSC genetic modification in order to load proteins of interest on SEV and potentiate its native therapeutic potential. Based on previous findings, where it has been described a potential anti-fibrotic role of oncostatin-M (OSM) in AMI context, we decided to incorporate OSM on SEV surface by its fusion to CD81 tetraspanin, a protein naturally loaded on SEV surface, in order to trigger functional effects on target cells. OSM sequence modification was necessary in order to load the protein on SEV surface efficiently, and preliminary data showed that modified OSM-CD81 loaded on SEV had a functional effect on human ventricular cardiac fibroblasts. Concretely, decrease of proliferation rate after starvation and telo-Collagen1α1 location pattern modification was observed after stimulation with a pro-fibrotic cocktail (containing TGFβ-1, α-dextran and ascorbic-L-acid sulphate) in vitro when cells were treated with modified OSM-CD81- SEV compared to ctrl and CD81-loaded SEV treatments. Overall, two new advanced cell-free therapies with preliminary promising results have been proposed in order to reduce myocardial injury after AMI in terms of cardiomyocytes apoptosis reduction and fibrosis mitigation. / Tejedor Gascón, S. (2021). Development of new advanced therapies to mitigate ischemia-reperfusion-induced injury during acute myocardial infarction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/171487