Doctor en Bioquímica / El cáncer constituye una de las principales causas de muerte en Chile y el mundo. Particularmente, la agresividad de esta enfermedad subyace en la diseminación de las células tumorales hacia otros tejidos, fenómeno conocido como metástasis. La metástasis es un proceso multifactorial, siendo la migración celular una de las etapas más relevantes. Caveolina-1 es una proteína de membrana que en etapas avanzadas del cáncer aumenta su expresión y promueve la migración celular y metástasis. En este contexto, Caveolina-1 ha sido asociada a un conjunto de cambios morfológicos esenciales que permiten la migración e invasión celular, entre estos, la remodelación del citoesqueleto de actina y el recambio de complejos de adhesión celular. Muchos de estos eventos dependen del tráfico endosomal, el cual a su vez es finamente regulado por diversos factores y moléculas, como las GTPasas pequeñas de la familia Rab. Una de estas proteínas es Rab5, la cual no sólo actúa como regulador maestro de la endocitosis temprana, sino que además cumple un rol fundamental en la migración celular. Trabajos recientes han descrito que la interacción entre Rab5 y Caveolina-1 influye en el tráfico endosomal, sin embargo el rol de esta interacción en la migración celular no había sido investigado. Entre los reguladores de Rab5, p85α (la subunidad reguladora de PI3K), se caracteriza por inhibir a Rab5, ya que posee un dominio RabGAP que estimula su actividad GTPasa. Literatura reciente ha descrito una interacción funcional entre p85α y Caveolina-1, la cual a su vez depende de la fosforilación de Caveolina-1 en tirosina (Y14). Lo anterior cobra relevancia, ya que Caveolina-1 ejerce muchos de sus efectos en migración celular mediante la fosforilación en este residuo. Por otro lado, trabajos recientes indican que Rab5 activa a Rac-1, a través del reclutamiento de la GEF Tiam1, fomentando la formación de lamellipodios y la polimerización de actina en sitios específicos de membrana. Además, trabajos de nuestro laboratorio demostraron que Caverolina-1 promueve la activación de Rac-1 en células metastásicas. Todos estos eventos llevan a que la célula adquiera cambios morfológicos que le permiten migrar. Por lo tanto, es importante investigar el papel potencial que desempeñaría Caveolina-1 en la regulación de este circuito, así como su relevancia en la migración celular. En esta tesis, se investigó los mecanismos asociados al efecto promotor de migración y metástasis de Caveolina-1, identificando un nuevo eje de señalización “p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1”. A su vez, se evaluó la relevancia de este eje en un modelo preclínico, evaluando la metástasis in vivo en ratones C57BL/6. Los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta tesis indican que Caveolina-1 promueve la migración, invasión y la activación de Rab5 en tres líneas celulares metastásicas: HT-29(US) de cáncer de colon, B16-F10 de melanoma murino y MDAMB- 231 de cáncer de mama. En relación a esto último, la expresión de Caveolina-1 promueve un aumento en el tamaño de los endosomas tempranos, pero no debido a la estabilización de Rab5 en éstos, sino que debido al secuestro de p85α en un complejo proteico. Interesantemente, el efecto de p85α en la inhibición de Rab5 es asociado a su actividad GAP, y no involucra la activación de PI3K. Mediante ensayos de silenciamiento y reconstitución, se observó que la expresión y actividad de Rab5 son fundamentales para que Caveolina-1 promueva migración e invasión celular, así como también la activación de Rac-1. La activación de Rac-1 por Caveolina-1 y Rab5 requiere de Tiam1, la cual es reclutada a endosomas tempranos de manera dependiente de Caveolina-1. Finalmente, se demostró que Caveolina-1 requiere de Rab5, p85α y Rac-1 para promover invasión in vitro y metástasis in vivo en ratones C57BL/6. De esta manera, este trabajo de tesis aporta nueva evidencia acerca de los mecanismos moleculares involucrados en la migración y metástasis inducida por Caveolina-1, proponiendo un nuevo eje de señalización p85α/Rab5/Tiam1/Rac-1, el cual involucra proteínas comúnmente alteradas en cáncer, y por lo tanto, contribuyendo con la identificación de nuevos blancos potenciales terapéuticos / Cancer is a leading cause of disease in Chile and worldwide. During the development and progression of this disease, normal cells convert to the cancerous state by acquiring specific characteristics. Of these metastasis is widely considered particularly important because it is this trait of cancer cells that is responsible for the large majority of deaths in cancer patients. Caveolin-1 is a membrane protein with vastly differing roles in cancer that range from functioning as a tumor suppressor to promoting tumor cell migration invasion and metastasis. Concomittant with this unfavorable role in tumor progression, expression of this protein frequently increases in advanced stages of cancer and is viewed there as a marker for poor patient prognosis and survival. In this cellular context, it is important to gain better insight to how Caveolin-1 promotes the acqusition of a more invasive cellular phenotype. In these migration-related events, endosomal trafficking reportedly plays a fundamental role and Caveolin-1 is known to promote recycling of membrane components and the activation of GTPases at the leading edge. A key membrane-associated protein involved in such processes is Rab5, a small Rho GTPase that acts as a master regulator of early endocytosis. Recently, evidence has been provided suggesting that p85α, the regulatory subunit of PI3K, is a Rab5 GAP that controls Rab5 inactivation. Structurally, p85α has two SH2 domains, involved in binding to tyrosine-phosphorylated proteins, often including receptors and adaptor proteins. Caveolin-1, on the other hand, is known to promote the migratory and invasive capacity of tumor cells via phosphorylation on tyrosine-14. Furthermore, Rab5 activates Rac-1 and promotes lamellipodia formation, through recruitment of the GEF Tiam1. Together, these events lead to changes that permit cell migration. However, the precise mechanisms by which Caveolin-1 participates in the regulation of such processes and specifically whether Caveolin-1 enhanced migration and invasion in vitro involves a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis remained to be determined. Also, a model of B16F10 murine melanoma metastasis in syngeneic C57BL / 6 mice was employed to evaluate the relevance of Rab5, p85α and Rac-1 in promoting Caveolin-1-enhanced lung metastasis in vivo. The results obtained during this thesis demonstrate that Caveolin-1 promoted migration, invasion and activation of Rab5 in the metastatic cell lines HT-29 (US), B16-F10 and MDA-MB-231. Moreover, the expression of Caveolin-1 was shown to increase the average size of early endosomes in B16F10 cells, consistent with a role in the activation of Rab5. To study molecular mechanisms that explain these results, the expression of p85α was shown to decrease Rab5 activation induced by Caveolin-1. Using inhibitors, the activation of Rab5 by Caveolin-1 was shown to be independent of PI3K activity. Moreover, expression of Rab5 was required for Caveolin-1 to promote cell migration and invasion. Importantly, the activation of the small GTPase Rac-1 induced by Caveolin-1 required the presence of Rab5 to promote migration. Furthermore, evidence is provided showing that recruitment of the Rac1 GEF Tiam1 to early endosomes was enhanced in the Caveolin-1 positive cells. Finally, using short-hairpin knock-down technology Rab5, p85α and Rac-1 were shown to be required for Caveolin-1 to promote migration and invasion in vitro, as well as metastasis in vivo in C57BL / 6 mice. In conclusion, the results of this thesis shed light on the molecular mechanisms involved in Caveolin-1-enhanced migration, invasion and metastasis and propose the existence of a novel p85α / Rab5 / Tiam1 / Rac-1 signaling axis downstream of Caveolin-1 that contributes to deregulation in cáncer and potentially represents an interesting target for treatments in cancer patients / Conicyt; Fondecyt; Anillo ACT 1111

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctor en Bioquímica / Caveolina-1 es una proteína de membrana esencial en la formación de caveolas, participa en el transporte de colesterol, actúa como proteína de andamiaje en señalización y ha sido descrita como un supresor de tumores. Por otro lado, la presencia de Caveolina-1 juega un rol esencial en la polarización celular durante el proceso migratorio, ya que controla la localización de moléculas de señalización y regula la activación de proteínas que participan en migración. Sin embargo, no sólo la presencia de Caveolina-1 es esencial para la migración celular, sino también la fosforilación de Caveolina-1 en Tirosina 14. Considerando que la migración celular es esencial para la metástasis, Caveolina-1 ha sido descrita también como un promotor de metástasis. Este comportamiento dual ha causado controversia y ha dado origen a un gran número de investigaciones en desarrollo actúalmente en la comunidad científica. El principal objetivo de esta tesis fue establecer, en un modelo in vivo inmunocompetente, si Caveolina-1 tiene o no este rol dual en cáncer usando como modelo células de melanoma. Estudiamos en ratones C57-BL/6 el comportamiento de las líneas tumorales B16-F0 y B16-F10, ambas líneas singénicas con la cepa C57-BL/6, y por lo tanto no existe rechazo inmunológico. Estas células al ser subcutáneamente en estos ratones tienen la capacidad de formar tumores sólidos y a la vez, si se inyectan por la vía intravenosa, generan focos de metástasis en el pulmón de los ratones. Por lo tanto, con este sistema estudiamos el rol dual de Caveolina-1 en un mismo modelo in vivo. Una vez inoculados los animales en el lomo (vía subcutánea) o por la vena lateral de la cola (vía intravenosa), con las células seguimos la formación de tumores y cuantificamos la metástasis a nivel pulmonar, respectivamente. Los ensayos realizados in vivo en las células B16-F0 mostraron que Caveolina-1 era capaz de suprimir la formación de tumores, retardando al doble el tiempo de aparición de éstos. Al silenciar los niveles de expresión de Caveolina-1 en las B16-F0 Caveolina-1 mostró promover metástasis no sólo a nivel de pulmón, a la vez mostró nódulos metastasicos en ganglios, riñón, bazo e hígado. Los ensayos en los ratones C57BL/6 con las células B16-F10 con y sin expresión de Caveolina-1 mostraron una reducción del 60 % en el tamaño de los tumores formado por las células que expresaron Caveolina-1 comparado con las que no la expresaron. En los ensayos de metástasis, las células que expresaron Caveolina-1 causaron al menos dos veces más metástasis pulmonar. Estos resultados mostraron por primera vez en un modelo in vivo que Caveolina-1 es capaz de actúar tanto como supresor tumoral y como promotor de metástasis. Usando el mismo modelo de estudio, para analizar el rol dual de Caveolina-1 continuamos con un análisis mutacional, específicamente usando una población celular que expresó Caveolina-1 no fosforilable en la posición de la Tirosina-14 (B16-F10(cav-1/Y14F) y se realizaron los ensayos de supresión de tumor y metástasis. Los resultados revelaron que Tirosina-14 era esencial para otorgarla a Caveolina-1 la capacidad de actúar como una molécula promotora de metástasis, pero al mismo tiempo este residuo no era esencial para el rol supresor de tumores. Por otra parte, evaluamos in vivo la capacidad de E-cadherina de modular los dos roles descritos para Caveolina-1 en las células B16-F10. En estas, la presencia de E-cadherina cumple una función sinérgica sobre Caveolina-1 en su rol supresor de tumores, llegando incluso a inhibir completamente la formación de tumor dependiendo de la expresión de E-cadherina de manera directamente proporcional. Al mismo tiempo E-cadherina mostró frenar el efecto promotor de metástasis dado por Caveolina-1, es decir, ambas proteínas juntas en las células B16-F10 evitan la formación de tumores metastasicos en el pulmón o en cualquier otra parte del cuerpo del animal. / Caveolin-1 is a membrane protein essential for the formation of caveolae, is involved in cholesterol transport, acts as a signaling scaffold protein and has been described as a tumor suppressor. On the other hand, the presence of caveolin-1 plays an essential role in cell polarization during the migration process as it controls the localization of signaling molecules and regulates the activation of proteins involved in migration. However, not only the presence of caveolin-1 is essential for cell migration, but also the phosphorylation of caveolin-1 on Tyrosine 14. Whereas cell migration is essential for metastasis, caveolin-1 has also been described as a promoter of metastasis. This dual behavior has caused controversy and led to a large number of investigations currently under development in the scientific community. The main objective of my research is to establish, in an immunocompetent in vivo model, caveolin-1 whether or not this dual role in cancer melanoma. We study a model where we use mice C57-BL / 6 and tumor lines F0 B16, B16 and F10, both lines syngeneic with the strain C57-BL / 6, ie, no immune rejection. These cells to be inoculated subcutaneously in mice have the ability to form solid tumors and also, if injected intravenously, generate foci of metastases in the lungs of mice. Therefore, with this system we can study the dual role of caveolin 1 in the same model in vivo. Once inoculated animals in a case in the back of the animal (subcutaneously) and the lateral tail vein (intravenously), the cells follow the formation of tumors and quantified the lung metastases, respectively. The tests performed in vivo in B16-F0 cells show that caveolin-1 is able to suppress tumor formation, slowing to twice the time of appearance of these. Metastases in trials of these same cells, caveolin-1 showed promote metastases not only in both lung metastatic lymph nodes showed kidney, spleen and liver. By silencing the expression levels of caveolin-1 in B16-F0 results showed that both roles of caveolin-1 is lost. Trials in C57BL / 6 mice with B16 F10 cells with and without expression of caveolin-1 show that there is a 60% reduction in the size of tumors formed by cells expressing caveolin-1 compared with those without expressed. In trials of metastasis, the cells expressing caveolin-1 cause at least twice as lung metastases. These results show for the first time in an in vivo model that caveolin 1 is able to act as both tumor suppressor and a promoter of metastasis. Using the same model to study, to analyze the dual role of caveolin-1 continue with mutational analysis, specifically using a cell population that expresses caveolin-1 is not phosphorylated at the position of tyrosine-14 (B16 F10 (cav 1/Y14F) tests were performed in tumor suppression and metastasis. The results show that tyrosine-14 is essential for caveolin-1 to grant it the ability to act as a metastasis-promoting molecule, but at the same time, this residue is not essential for the role tumor suppressor. Moreover, we evaluate in vivo the ability of E-cadherin to modulate the two roles described for caveolin-1 in B16-F10 cells. In these, the presence of E-cadherin plays a synergistic role of caveolin-1 in tumor suppressor role, even to completely inhibit tumor formation depending on the expression of E-cadherin in direct proportion. While E-cadherin stops the metastasis-promoting effect given by caveolin-1, ie both proteins together in B16 F10 cells prevent the formation of metastatic tumors in the lung or elsewhere in the body of the animal. / Conicyt; FONDECYT-FONDAP

Tesis para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer corresponde a la segunda causa de muerte en Chile y el mundo, pero los pacientes con cáncer no mueren debido al crecimiento del tumor primario, sino a la diseminación de las células tumorales y posterior colonización de éstas en nuevos órganos o metástasis. En términos generales, el cáncer es la consecuencia de un proceso multifactorial que lleva a la transformación progresiva de células normales en células altamente malignas. La amplia variedad de fenotipos del cáncer se debe a la manifestación de alteraciones esenciales en la fisiología celular, las que colectivamente dictaminan el crecimiento maligno. Dos de las características adquiridas por las células tumorales en las que se enfocará esta tesis son; la invasión de tejidos y metástasis y la reprogramación del metabolismo energético. Caveolina-1 es una proteína integral de membrana a la que se le ha atribuido un rol dual en la progresión tumoral, actuando como supresor de tumores, ya que la disminución de la expresión de caveolina-1 es suficiente para revertir el fenotipo transformado, o como promotor de metástasis en estadios tardíos del cáncer, donde la expresión de caveolina-1 aumenta sin revertir el fenotipo maligno y se correlaciona con un aumento en la migración celular y metástasis, multiresistencia a drogas y una mala prognosis para el paciente. Ambos roles de caveolina-1 se ven afectados por la presencia de la glicoproteína Ecadherina, la cual potencia su acción supresora de tumores y suprime la habilidad de caveolina-1 para promover metástasis in vivo. Sin embargo, el mecanismo por el cual E-cadherina suprime la habilidad de caveolina-1 para promover la metástasis no ha sido estudiado. La habilidad de caveolina-1 para promover un aumento en la migración en células metastásicas se relaciona con un aumento en la activación de Rab-5 y Rac-1. Ya que la reprogramación del metabolismo energético de las células, suple tanto las necesidades bioenergéticas como biosintéticas de las células cancerígenas para sostener una proliferación aumentada y una rápida migración e invasión celular, en este proyecto se caracterizó el fenotipo metabólico de las células metastásicas que expresan o no, caveolina-1 y estudiamos cómo la expresión de E-cadherina afecta el metabolismo. Caveolina-1 sufre modificaciones post-traduccionales que participan en su función intracelular, como la fosforilación en el residuo de tirosina 14 (Y14), mediada por las proteínas tirosina quinasas no receptoras Src, Fyn y Abl en respuesta a varios estímulos como. En células metastásicas de cáncer de mama, se observan altos niveles de expresión de caveolina-1 y un alto grado de fosforilación de ésta en Y14, lo que promueve un aumento en la migración celular por un aumento en el recambio de la adhesiones focales, polarización, velocidad persistencia y direccionalidad de la migración. Todas estas funciones de caveolina-1 son bloqueadas por la inhibición de la fosforilación de caveolina- 1 en Y14 tanto de manera farmacológica como por la utilización de una caveolina-1 que no es fosforilable (Y14F). Por lo tanto, el rol promotor de metástasis de caveolina-1, dependería de su fosforilación en Y14. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipita con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y PTPN14 en células de melanoma murino e induce una disminución en la migración, formación de colonias y crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de colon. Estos antecedentes nos llevaron a proponer la siguiente hipótesis: En presencia de E-cadherina se recluta a la fosfatasa PTPN14 al complejo multiproteíco formado con caveolina-1 lo que reduce la habilidad promotora de migración y metástasis de caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de ésta en tirosina 14. El objetivo principal de esta tesis es determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la fosforilación en tirosina de caveolina-1 (Y14) y β-catenina (Y654) y la migración e invasión celular en células cancerígenas. Para abordar la hipótesis de trabajo se plantearon los siguientes objetivos específicos: (1) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre los niveles de fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina y la migración e invasión celular; (2) Estudiar la participación de Src en la fosforilación en tirosina 14 de caveolina-1 y en tirosina 654 de β-catenina en presencia y ausencia de E-cadherina; (3) Determinar si los complejos proteicos formados con caveolina-1 en presencia de E-cadherina contienen PTPN14, la que contribuye a la desfosforilación de caveolina-1 en tirosina 14; (4) Determinar el efecto de la co-expresión de caveolina-1 y E-cadherina sobre la activación de Rab-5 y Rac-1; (5) Caracterización de los cambios metabólicos inducidos por la expresión caveolina-1 y la variación de éstos por la co-expresión con Ecadherina. Para el desarrollo de los objetivos mencionados se utilizaron líneas celulares metastásicas en las que se co-expresan caveolina-1 y E-cadherina. Se realizó ensayos de Western de blot, luego de ensayos de multiherida para determinar los niveles de fosforilación de caveolina-1 en Y14 y β-catenina en Y654, ensayos de migración por transwell, ensayos de invasión, ensayos de precipitación por afinidad para determinar la actividad de Rab-5 y Rac1 en células que expresan caveolina-1 en presencia o en ausencia de E-cadherina. Además, se caracterizaron los complejos multiproteícos formados por caveolina-1, mediante ensayos de inmunoprecipitación y espectrometría de masa en células que expresan o no E-cadherina y se caracterizó el fenotipo metabólico de células que expresan o no caveolina-1, estudiando cómo cambia éste en presencia de E-cadherina. En resumen en esta tesis se buscó dilucidar el mecanismo mediante el cual Ecadherina reduce la habilidad promotora de migración, invasión y metástasis de caveolina-1 en células de cáncer metastásicas. En este trabajo mostramos que la expresión de E-cadherina inhibe el aumento en la migración, invasión y metástasis inducido por caveolina-1 por la disminución de la fosforilación de caveolina-1 en Y14, además, de bloquear la activación del eje Rab-5/Rac1. La fosfatasa PTPN14 co-inmunoprecipitó con caveolina-1 en presencia de E-cadherina y su expresión fue capaz de inhibir el rol promotor de migración, invasión y metástasis de caveolina-1. Finalmente mostramos que la expresión y fosforilación de caveolina-1 induce un switch metabólico a un fenotipo glicolítico aeróbico por el bloqueo del complejo mitocondrial IV, generando cambios en el metaboloma de las células metastásicas congruentes con este switch metabólico. La expresión de Ecadherina bloquea el cambio metabólico inducido por caveolina-1 llevando a las células a un metabolismo quiescente / Cancer is the second leading cause of death in Chile and in the world. Cancer patients do not die due to the primary tumor growth, but rather due to the spread of the cancer cells from the primary tumor and subsequent colonization of new organs, a process known as metastasis. In general terms, cancer is the result of a multifactorial process that leads to the progressive transformation of normal cells into highly malignant cells. The wide variety of cancer phenotypes is due to alterations in cell physiology that collectively lead to the malignant cell behavior. Two of the characteristics acquired by tumor cells, on which this thesis will focus, are tissue invasion, as well as metastasis and reprogramming of energy metabolism. Caveolin-1 is a membrane protein that has been attributed a dual role in cancer progression, acting at early stages as a tumor suppressor given that augmenting the expression of caveolin-1 is sufficient to reverse the transformed phenotype, or as a promoter of metastasis in late stages of cancer, where enhanced expression of caveolin-1 favors the malignant phenotype and correlates with an increase in cell migration and metastasis, multidrug resistance and poor prognosis of the patients. Both roles of caveolin-1 are affected by the presence of the glycoprotein E-cadherin, which enhances caveolin-1 function as a tumor suppressor and suppresses the ability of caveolin-1 to promote metastasis in vivo. However, the precise mechanism by which E-cadherin suppresses the malignant traits of caveolin-1 is unknown. The ability of caveolin-1 to promote migration of metastatic cells is associated with increased activation of Rab-5 and Rac-1. Bearing in mind that the reprogramming of energy metabolism in cancer cells, is required to supplement both the both the bioenergetic and biosynthetic needs of these cells to sustain increased proliferation, rapid migration and cell invasion, this thesis also evaluated the metabolism of metastatic cells expressing or not caveolin-1 and how this was affected by the expression of E-cadherin. Caveolin-1 is subjected to posttranslational modifications relevant to protein function, such as phosphorylation on tyrosine 14 (Y14), by the non-receptors protein tyrosine kinases non-receptor Src, Fyn and Abl. This may occur in response to a large variety of different stimulus. In metastatic breast cancer cells, high levels of caveolin-1 expression and phosphorylation on Y14 are observed and associated with increased cell migration by promoting focal adhesion turnover, polarization, persistence, speed and directionality of migration. All these functions of caveolin-1 are blocked by inhibition of caveolin- 1 phosphorylation on Y14 either pharmacologically or by introducing a nonphosphorylatable caveolin-1 (Y14F) mutation. Therefore, the metastasis promoting role of caveolin-1 depends on Y14 phosphorylation. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of Ecadherin and PTPN14 in murine melanoma cells and decreased migration, colony formation and anchorage-independent growth of colon cancer cells. These results available in the literature led us to propose that in the presence of E-cadherin PTPN14 is recruited to the multiprotein complex including caveolin-1 to reduce Y14 phosphorylation, cell migration and metastasis induced by caveolin-1. The main objective of this thesis was to determine the effect of co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on tyrosine phosphorylation of caveolin-1 (Y14) and β-catenin (Y654), as well as migration and invasion in cancer cells. To address the working hypothesis the following specific objectives were evaluated: (1) To determine the effect of the co-expression of caveolin-1 and E-cadherin on the levels of tyrosine phosphorylation 14 of caveolin-1 and on tyrosine 654 of β catenin and migration and cell invasion; (2) To study participation of Src in the phosphorylation of the tyrosine 14 of caveolin-1 and on tyrosine β-catenin 654 in the presence and absence of E-cadherin; (3) To determine whether the protein complexes formed with caveolin-1 in the presence of E-cadherin contain PTPN14, and if this phosphatase contributes to dephosphorylation of tyrosine 14 of caveolin-1; (4) To determine the effect of coexpression of caveolin-1 and E-cadherin on the activation of Rab-5 and Rac-1; (5) To characterization of the metabolic changes induced by caveolin-1 expression and the effect of the co-expression with E-cadherin on cell metabolism. To address these objectives metastatic cell lines that co-expressed caveolin-1 and E-cadherin were used. Multiple wounding assays and Western blot analysis was used to determine the phosphorylation levels of caveolin-1 on Y14 and β-catenin on Y654 moreover migration assays, invasion assays, affinity precipitation assays were employed to determine the activity of Rab-5 and Rac1 in cells expressing caveolin-1 in the presence or absence of E-cadherin. Furthermore, protein composition the analysis of the multiprotein complex formed by caveolin-1 and E-cadherin was evaluated following immunoprecipitation assays by mass spectrometry analysis. The metabolic phenotype of cells expressing or not caveolin-1 was characterized using Seahorse extracellular analyzer and metabolic changes in presence of Ecadherin were determined. In summary, this thesis sought to elucidate the mechanism by which E-cadherin reduces the ability of caveolin-1 to promote migration, invasion and metastasis as well as metabolic reprograming of metastatic cancer cells. In this study, we show that the expression of E-cadherin prevented caveolin-1- enhanced migration, invasion and metastasis by reducing caveolin-1 phosphorylation on Y14 and, as a consequence, blocking of the activation of the Rab-5/Rac-1 signaling axis. The PTPN14 phosphatase co-immunoprecipitated with caveolin-1 in the presence of E-cadherin and overexpression or this phosphatase was sufficient to prevent the migration, invasion and metastasis promoting role of caveolin-1, even in the absence of E-cadherin. Finally we show that the expression caveolin-1 induced a metabolic switch to an aerobic glycolytic phenotype, likely by blocking the mitochondrial complex IV. These effects coincided in metastatic melanoma cells with changes in the metabolome. Moreover, the expression of E-cadherin blocked the metabolic changes induced by caveolin-1 leading to a quiescent metabolic phenotype in metastatic cells / Conicyt-FONDAP; Fondecyt ; Anillo ACT / 31 de diciembre de 2018

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La búsqueda de tratamientos alternativos para el cáncer es un gran desafío para la comunidad científica moderna, ya que la aparición de resistencia a los tratamientos utilizados, por parte de los diversos tipos de tumor, es un problema aún sin resolver. Se ha visto y comprobado que la angiogénesis (desarrollo de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes) es un fenómeno estrechamente ligado al crecimiento tumoral y la capacidad metastásica del cáncer, por lo que su limitación es un nuevo camino de investigación en búsqueda de un tratamiento definitivo. Con el objetivo de estudiar el efecto angiogénico tumoral analizamos el efecto del implante intramuscular profundo de tumor TA3-MTX-R. en el modelo de ratón (Mus musculus) AJ hembras, clínicamente sanas. Para ello, se utilizaron 2 grupos de 8 ratones cada uno. Un grupo control (A) al cual se le aplicó suero fisiológico y un grupo experimental (B), al cual se le inoculó por vía intramuscular tumor el mismo día. A los ratones se les realizó mediciones del crecimiento tumoral y se esperó hasta la muerte natural de estos, debido al tumor primario y sus metástasis. Se realizó estudio histológico e inmunohistoquímico con conteo de los capilares en un área de estudio estándar, para evaluar angiogénesis, tanto en tumor como en tejidos blanco de metástasis. Los resultados se analizaron estadísticamente, mostrando un importante aumento en la angiogénesis de los ratones con tumor versus los controles. Se constató también que el tumor tiene la capacidad de sacar a las células endoteliales de su estado de reposo del ciclo celular (G0), para hacerlas entrar en una proliferación acelerada

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alessandravidotto_tese.pdf: 5410688 bytes, checksum: e1af0ab5bd616652ebf0225cd33f4c1d (MD5) Previous issue date: 2009-08-27 / The regional lymph nodes play a pivotal role in diagnosis, staging and management of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite their importance, detailed understanding of the probable mechanisms of lymphatic metastases has not been completely achieved. Subjects and Methods: We analyzed metastatic and normal lymph node tissues, as well as saliva and serum from sixth-two patients with HNSCC, and twenty-nine controls using two-dimensional electrophoresis, MALDI-Q-TOF and western blot. Results: Several proteins were found to be significantly increased in metastatic nodes, such as stratifin, glutathione S-transferase pi, apoliproteín A-I, alpha-1-microglobulin, disulfide isomerase, galectin, citokeratins, immunoglobulins, transtirretin, calciun-binding protein (família S100) and fat-binding protein (FABP). Among the down-regulated proteins in metastatic lymph nodes are calreticulin, tropomiosin 3, triosephosphate isomerase, piruvate quinase, anidrase carbonic, gamma actin, peroxiredoxin 2, profilin 1, gliceraldeyde 3- fosfato desidrogenase and heat shock proteins. These proteins are involved in epidermis development, cell proliferation, migration and adhesion, apoptosis, defense and inflammatory response and xenobiotic metabolism. Our data on the expression of heat shock proteins and enzymes of the glycolytic pathway suggest an effect of the lymph node environment in controlling tumor progression or in metabolic reprogramming of the metastatic cell. In saliva, 13 proteins showed an altered pattern of expression in samples patient, including over-expression of keratins, immunoglobulins, alphaamylase, PLUNC and zinc-alpha-2-glycoprotein and down-regulation of myosin. In serum samples, six proteins were over-expressed (serum albumin, alpha-1- microglobulin/bikunin precursor, apolipoprotein A-I, haptoglobin, serotransferrin, transthyretin) and two were under-expressed (hemoglobin subunit alpha, hemoglobin subunit beta) compared to the control group. Conclusion: New potential markers, such as profilin-1 and E-FABP, were identified and may be proved useful for defining the invasive phenotype of head and neck carcinomas. / O comprometimento de linfonodos regionais por células neoplásicas é atualmente o indicador mais utilizado para prognóstico em pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP). Apesar disso, a compreensão detalhada dos mecanismos envolvidos na formação de metástases linfáticas ainda não foi completamente atingida. Casuística e Método: Foi avaliado o perfil protéico de linfonodos metastáticos e não metastáticos, bem como de amostras de saliva e soro de 62 pacientes em diferentes estágios da doença e de 29 controles, utilizando eletroforese bidimensional, espectrometria de massas por MALDI-Q-TOF e experimentos de validação por Western blot. Resultados: Os resultados mostraram várias proteínas com expressão elevada em linfonodos metastáticos em relação aos não metastáticos, como stratifina, glutathiona S-transferase pi, apoliproteína A-I, alfa-1-microglobulina, dissulfeto isomerase, galectinas, citoqueratinas, imunoglobulinas, transtirretina e proteínas de ligação ao cálcio (família S100) e a ácidos graxos (FABP). De forma inversa, as proteínas calrreticulina, tropomiosina 3, triofosfato isomerase, piruvato quinase, anidrase carbônica, gama actina, peroxirredoxina 2, profilina 1, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e proteínas de choque térmico mostraram níveis reduzidos em linfonodos metastáticos. Essas proteínas estão envolvidas em processos de desenvolvimento epidérmico, proliferação, migração e adesão celular, apoptose, resposta inflamatória e metabolismo de xenobióticos. Os dados relacionados à expressão de proteínas de choque térmico e enzimas da via glicolítica sugerem um efeito do ambiente dos linfonodos e no controle da progressão do tumor ou na reprogramação das células metastáticas. Em saliva, 13 proteínas exibiram um padrão alterado nas amostras de pacientes com câncer, incluindo expressão elevada de queratinas, imunoglobulinas, alfa-amilase, PLUNC e zinc-alfa-2-glicoproteína e expressão reduzida de miosina. Em amostras de soro, seis proteínas apresentaram expressão aumentada (albumina, alfa-1-microglobulina/bikunina precursor, apolipoproteína A-I, haptoglobina, serotransferrina e transtirretina) e duas estavam com expressão diminuída (hemoglobina alfa e hemoglobina beta), quando comparadas com o grupo controle. Conclusão: Os resultados obtidos revelaram novos marcadores potenciais, como profilina 1 e E-FABP, PLUNC e transtirretin que podem ser úteis na definição do fenótipo invasivo e no rastreamento e diagnóstico desse grupo de neoplasias.