O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

This graduation theses was intent on study influence conditions submerged cultivation select types enthomopatogenic fungi in liquid nutritive medium with emphasis on optimalization key elements of the process that manner performance uniform biomass mythosporotic fungi {--} blastospores. Experimental part of work was conceived with regard on next sphere problems: 1.Nutritive soil compositionon effect on production blastospores 2.Comparing possibility different kinds and strains enthomopathogenic fungi produce blastospores in submerged cultivation. 3.Conditions submerged cultivation effect on production and yield blastospores 4.Verify possibility production of uniform biomass blastospores in range usable for large-screen application

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-24T16:39:07Z No. of bitstreams: 1 Jose Menezes Araujo Junior.pdf: 362260 bytes, checksum: ad127ee31030ace5f6a04e4c2c1df8cb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-24T16:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jose Menezes Araujo Junior.pdf: 362260 bytes, checksum: ad127ee31030ace5f6a04e4c2c1df8cb (MD5) Previous issue date: 2008-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae), is considered an important pest of kale in Brazil. Botanical insecticides and the fungi Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok., Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., and Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & Gams are promising alternatives to control aphids populations. This work aimed to evaluate isolates of entomopathogenic fungi and toxicity of the neem formulation (Neemseto®) to control L. erysimi, as well the compatibility of the selected isolates and neem oil. Survey done accros kale areas from five counties of the Agreste region in Pernambuco State resulted in presence of L. erysimi in four of them. Among 20 evaluated fungi isolates, the B. bassiana CG 001 and M. anisopliae CG 30 were the most pathogenic, providing 90 and 64% mortality towards the aphid, respectively. The CL50s for B. bassiana CG 001, M. anisopliae CG 30, and L. muscarium URPE-24 were 1,6x106,3,4x106 and 2,5x105 conidia mL-1, respectively. Bioassays with the neem formulation at concentrations 0.5, 1.0, and 2.0% were done either by leaf discs dipping or spraying the aphids on the leaf discs. All treatments caused mortality higher than 60 %, however the neem spraying treatment at 2.0% provided 90% mortality. Regarding the compatibility of B. bassiana CG001, M. anisopliae CG30 isolates with the neem oil formulation at 0.125, 0.25, and 0.5%, the 0.5% treatment did not affect the B. bassiana CG 001 viability. Compatibility test conducted with theisolates CG001 of B. bassiana and CG30 of M. anisopliae with Neemseto® at concentration 0.125, 0.25 and 0.5%, showed that the highest neem concentration caused negative impact on sporulation of the isolate CG001 and on vegetative growth and viability of the isolate CG30. These results show that the isolates B. bassiana CG001, M. anisopliae CG 30, L. muscariumURPE-24, and neem oil may be used to the control of L. erysimi. / O pulgão Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) tem-se destacado como praga das brássicas. Entre as medidas de controle de pulgões, o uso de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok., Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Lecanicillium muscarium (Petch) Zare & Gams, e de extratos de plantas têm sido considerado uma alternativa promissora. Assim, este trabalho objetivou selecionar isolados de fungos entomopatogênicos eficazes e estudar a aplicação de nim formulado para controle de L. erysimi e avaliar também, a compatibilidade entre os isolados e o nim. Levantamentos realizados em cultivos de brássicas, no Agreste de Pernambuco, mostraram que L. erysimi ocorreu em quatro das cinco localidades investigadas. Foram avaliados 20 isolados de fungos, onde CG001 de B. bassiana e CG30 de M. anisopliae apresentaram-se como os mais patogênicos causando 90 e 64% de mortalidade, respectivamente. Para a determinação da concentração letal (CL50) foram utilizou-se estes dois isolados e URPE-24 de L. muscarium. Osvalores para a CL50 foram de 1,6 x 106, 3,4 x 106 e 2,5 x 105 conídios mL-1, para B. bassiana, M. anisopliae e L. muscarium, respectivamente. O óleo de nim formulado foi testado em três concentrações (0,5; 1,0 e 2,0%) por imersão foliar e pulverização sobre os pulgões. Em todos os tratamentos observou-se mortalidade superior a 60%, porém o melhor resultado foi obtido com apulverização do nim a 2,0% proporcionando mortalidade de 90%. Testando a compatibilidade in vitro de CG001 de B. bassiana e CG30 de M. anisopliae com o Neemseto® a 0,125; 0,25 e 0,5%, observou-se que o tratamento a 0,5% afetou apenas a esporulação do isolado CG001 e o crescimento vegetativo e a viabilidade de CG30. Pode-se concluir que os isolados CG001, CG30 e URPE-24 de B. bassiana, M. anisopliae e L. muscarium, respectivamente, e óleo emulsionávelde nim podem ser utilizados para o controle de L. erysimi.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-12-01T16:28:25Z No. of bitstreams: 1 Laurici Maria Pires dos Santos.pdf: 3466863 bytes, checksum: 5d731758c5c5bc0c0ab7e9025027b287 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T16:28:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Laurici Maria Pires dos Santos.pdf: 3466863 bytes, checksum: 5d731758c5c5bc0c0ab7e9025027b287 (MD5) Previous issue date: 2008-02-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The control of Tuta absoluta (Meyrick) is usually done with intensive insecticide sprays, which has led to the research of alternative control methods as part of the tomato leafminer integrated management in tomato crops. The objective of this work was to evaluate the pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. and Beauveria bassiana (Bals.)Vuill isolates on eggs and larvae of T. absoluta, and their compatibility with insecticides used to control this pest. Also, it was investigated the infection process of M. anisopliae on eggs and the effect over fecundity and mortality of females. Although both fungi showed pathogenicity to eggs and larvae of T. absoluta, M. anisopliae showed higher pathogenicity than B. bassiana. Among the isolates of M. anisopliae tested, URPE-6 and URPE-19 caused 95% and 42% infection in eggs and 1st instar larvae, respectively. The LC50-value for T. absoluta eggs was 3.5 x 104 conidia.mL-1 of the URPE-6 isolate. The compatibility of isolates URPE-6 and URPE-19 with neem, chlorfenapyr, indoxacarb, spinosad and abamectin was evaluated. Field dosages of chlorfenapyrand neem were toxic to the isolate URPE-19, while abamectin and neem showed toxicity to the isolate URPE-6. Ultra-structure analysis of URPE-6 infecting eggs showed that the process of conidia penetration occurred within 6 h after application of the fungus. Bodies of hyphae presenceand intense micelle extrusion were observed in eggs at 12 and 72 h after application, respectively. The URPE-6 isolate did not show any effect on egg-laying preference and fecundity of T. absoluta females, but it affected their survivals. The use of entomopathogenic fungi is a potential alternative control for T. absoluta mainly at the egg stage, and it may be associated with insecticides used in the control of this tomato pest / Um dos fatores limitantes da produtividade da cultura do tomateiro é a ocorrência de pragas, destacando-se Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera:Gelechiidae). A aplicação intensiva de inseticidas no controle convencional desse inseto torna relevante a busca por métodos alternativos que possam compor o Manejo Integrado desta praga. Esta pesquisa teve como objetivos avaliar a patogenicidade de isolados de Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorok. e Beauveria bassiana (Bals.) Vuill para ovos e lagartas de T. absoluta, estudar a compatibilidade destes patógenos com inseticidas, investigar o processo de infecção de M. anisopliae sobre ovos e avaliar seu efeito na fecundidade e mortalidade de fêmeas. Todos os isolados testados apresentaram patogenicidade a ovos e lagartas de T. absoluta, sendo M. anisopliae mais patogênico. Destacaram-se os isolados URPE-6 causando infecção de 95% sobre ovos e URPE-19 com mortalidade de 42% sobre lagartas de primeiro ínstar. Foi determinada a CL50 do isolado URPE-6 de M. anisopliae sobre ovos de T. absoluta, obtendo-se um valor de 3,5 x 104 conídios mL-1. Testou-se a compatibilidadedos isolados URPE-6 e URPE-19 com Nim, Clorfenapir, Indoxacarbe, Espinosade e Abamectina. Os produtos Clorfenapir e Nim foram tóxicos ao isolado URPE-19 e Abamectina e Nim apresentaram toxicidade para o isolado URPE-6, nas dosagens recomendadas pelo fabricante. Aavaliação ultra-estrutural dos ovos infectados pelo isolado URPE-6 de M. anisopliae nos períodos de 6, 12, 24, 48 e 72h após a aplicação do patógeno, demonstrou que o processo de penetração dos conídios ocorreu dentro do período de 6 horas, confirmando sua virulência. Foi observada a presença de corpos hifais no interior do ovo, nos períodos de 12 e 24h. No período de 72h após a infecção ocorreu intensa extrusão do micélio cobrindo a superfície externa dos ovos. O isolado URPE-6 não apresentou efeito sobre a oviposição e fecundidade de T. absoluta, porém afetou a sobrevivência. A utilização de M. anisopliae representa mais uma alternativa no controle de T. absoluta, principalmente no estágio de ovo, sendo possível associação deste patógeno com inseticidas utilizados no controle desta praga.

Orientador: Ranulfo Monte Alegre, Vanildo Luiz Del Bianchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T12:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Guandalini_NataliaCapeletti_M.pdf: 871682 bytes, checksum: e4a32e6ca78e765cdc8ad2777861e933 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O fungo Metharhizium anisopliae tem sido empregado no biocontrole de insetos em diferentes regiões do Brasil, com aplicação principal em lavouras de cana-de-açúcar. O processo de biocontrole envolve a adesão dos esporos do fungo à superfície do inseto, a destruição do mesmo através da pressão mecânica das hifas, além de processos de digestão enzimática de proteínas, quitinas e lipídeos. Por esse motivo, estudos indicam a viabilidade da produção de amilases, proteases, lipases e quitinases pelo fungo. Além disso, este fungo tem sido objeto de estudos como produtor de swainsonine, um alcalóide com ação potencial na inibição da metástase celular e do crescimento primário de tumores, sendo promissora a sua utilização em tratamentos contra o câncer e AIDS. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo estudar o potencial amilolítico de linhagens de Metarhizium anisopliae. Para a produção das enzimas utilizou-se fermentação em meio sólido. Para tanto, o microrganismo mantido em meio BDA foi inoculado através da suspensão de células na concentração de 107 esporos/g em 10 g de meio farelo e casca de arroz, em proporções de 7/3 (p/p), 6/4 (p/p) e 8/2 (p/p). A umidade inicial dos meios de cultivo variou em 47%, 65% e 74%. A fermentação ocorreu em sacos de polipropileno, os quais foram mantidos a 28ºC durante 480 horas, sendo retiradas amostras a cada 24 horas. No extrato enzimático obtido foram determinadas as atividades de a-amilase e de amiloglicosidase. Para o estudo da influência da interação de fatores como meio de cultivo, umidade, pH e concentração de esporos na produção das enzimas em estudo, foi utilizado um planejamento experimental 24-1, onde se observou que o pH apresenta influência na produção de a-amilase. Para a produção de a-amilase e amiloglicosidase, observou-se que o melhor meio de cultivo foi o constituído por farelo e casca de arroz na proporção 6/4 (p/p), com umidade de 47%. O pH ótimo para a atividade de a¿amilase e de amiloglicosidase foi de 5 - 5,5, apresentando estabilidade numa faixa de 5 ¿ 6,5 para a a¿amilase e de 5,5 ¿ 6 para a amiloglicosidase. A temperatura ótima para a atividade enzimática de a¿amilase foi de 70ºC e de 60ºC para a amiloglicosidase, apresentando estabilidade numa faixa de 10 a 50ºC. A atividade enzimática de a¿amilase foi influenciada positivamente pelos íons Mg+2, Mn+2, K+, Ca+2 e EDTA, enquanto o íon Zn+2 influenciou negativamente a atividade da enzima. Para a amiloglicosidase, todos os íons testados apresentaram efeito negativo, com destaque para o Zn+2 que apresentou a maior redução na atividade enzimática / Abstract: The fungus Metharhizium anisopliae has been used as biocontrol agent, actuating on insects in different areas of Brazil, with main application in sugarcane farmings. Such a biocontrol process involves the adhesion of the fungus spores to the surface of the insect, destruction of the same through the mechanical pressure of the hyphal, as well the processes of enzymatic digestion of proteins, chitins and lipids. For that reason, studies indicate the viability of the production of amylases, proteases, lipases and chitinases by this fungus. Besides, it is object of studies as producer of swainsonine, an alkaloid with potential action in the metastasis cellular and in the primary growth of tumors, being promising its use in treatments against the cancer and AIDS. The objective of this work was to evaluate the amylolytic potential of the strains of Metharizium anisopliae. For the enzymes production, it was utilized solid state fermentation. For that, the microorganism maintained in PDA media was inoculated through the suspension of cells in the concentration of 107 spores/g in 10 g of media constituted by bran and rice chaff, in proportions of 7/3 (p/p), 6/4 (p/p) and 8/2 (p/p). The initial moisture content of fermentation was varied on 47%, 65% and 74%. The experiments were carried in polypropylene bags, which were incubated at 28ºC for 480 hours of fermentation, being removed from it, samples every 24 hours. From the crude enzymatic solution, there were determined the activities of a-amylase and the amiloglucosidase. For the study of the interaction of factors such as cultivation medium, moisture, pH and inoculum size in the enzymes production, a statistical design 24-1 was used, where it was observed that the pH presents influence in the production of a-amylase. For the production of a-amylase and amiloglicosidase, it was concluded that the best cultivation medium is constituted by bran and rice chaff in the proportion 6/4 (p/p), with a moisture content of 47%. The optimum pH for a-amylase and amiloglicosidase was of 5 - 5,5, presenting stability in a pH range from 5 to 6,5 for the a- amylase and 5,5 to 6 for the amiloglicosidase activity. The best temperature for a-amylase activity was 70ºC and 60ºC for the amiloglicosidase, presenting stability in a range from 10 to 50ºC. The a-amylase activity was influenced positively by the ions Mg+2, Mn+2, K+, Ca+2 and EDTA, while the ion Zn+2 influenced negatively the enzyme activity. For the amiloglicosidase, all of the tested ions presented negative effect, with prominence for Zn+2 that presented the largest reduction in the enzymatic activity / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

O carrapato Rhipicephalus microplus é o principal ectoparasita de bovinos. O controle de R. microplus baseia-se principalmente no uso de acaricidas químicos, o que contribuiu para o problema emergente da seleção de populações de carrapatos resistentes. Portanto, há a necessidade do desenvolvimento de métodos mais eficientes/sustentáveis de controle, como o controle biológico utilizando fungos acaropatogênicos. A eficácia do fungo Metarhizium anisopliae de forma isolada ou em associação com acaricida químico para controle do carrapato bovino já foi evidenciada em condições de campo utilizando uma cepa de carrapatos resistente à acaricidas. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de R. microplus envolvidos na sua interação com M. anisopliae e com acaricidas. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de larvas de R. microplus expostas ao fungo, ao acaricida e à associação de ambos. Primeiramente foi realizado um estudo para determinar a metodologia mais indicada para avaliar o efeito in vitro do fungo M. anisopliae sobre larvas de R. microplus. Para isso, comparamos o Teste de Pacote de Larvas modificado (TPL) e o Teste de Imersão de Larvas (TIL). Os valores de tempo letal mediano (TL50) obtido na maior concentração de M. anisopliae (108conídios/mL) foram 24,8 e 9,2 dias para o TPL e TIL, respectivamente. A mortalidade após 21 dias foi de 38% e 98% para o TPL e TIL respectivamente, na mesma concentração. O TIL demonstrou ser o teste mais indicado a ser utilizado, sendo, portanto, escolhido para realização dos experimentos futuros. Em seguida foi realizado um estudo para comparar a suscetibilidade de diferentes isolados de R. microplus ao fungo M. anisopliae. Foram avaliados 67 isolados de campo. Para tanto, as larvas de R. microplus foram imersas em uma suspensão de M. anisopliae (108conídios/mL) durante 5 min. Os tempos letais medianos (TL50) variaram de 2,6 a 24,9 dias A mortalidade observada no 15º dia após o tratamento variou de 26,3 a 100% nas amostras testadas. Esses resultados demonstraram que as populações de campo de R. microplus apresentam uma alta variação em sua suscetibilidade a M. anisopliae. Por fim, foi realizada uma análise transcricional (RNAseq) de larvas de R. microplus expostas a M. anisopliae, cipermetrina, associação de ambos e do controle (não-tratado). A análise dos transcritos dos quatro grupos gerou um total de 507.792 sequências com um tamanho total de 303.160.891 pb. Foram encontrados 31 genes diferencialmente expressos no grupo controle quando comparado com M. anisopliae, 39 com cipermetrina e 73 com M. anisopliae + cipermetrina. M. anisopliae e o grupo da associação apresentaram 81 genes diferencialmente expressos e M. anisopliae e cipermetrina, 46. Houve 177 genes diferencialmente expressos ao comparar M. anisopliae + cipermetrina com larvas expostas à cipermetrina Os resultados deste estudo demonstraram que a associação M. anisopliae + cipermetrina aumentou a expressão de genes relacionados a resposta à agressão, provavelmente pelo fato da associação provocar uma agressão maior ao carrapato e este responder de forma mais rápida, levando à superexpressão de genes de defesa. As descobertas deste estudo fornecem informações sobre as vias e mecanismos moleculares de R. microplus ativados em resposta à interação de M. anisopliae e a acaricida. Além disso, esses estudos estabelecem as bases para pesquisas futuras sobre genes-chave que controlam a suscetibilidade de R. microplus a M. anisopliae. O sinergismo evidenciado em nossos estudos comprova a ideia de que o controle integrado, utilizando o controle biológico com o controle químico é uma opção tanto para o controle de cepas de carrapatos resistentes à acaricidas, quanto para um controle mais rápido de cepas de carrapatos que não apresentam resistência ou que apresentem resistência intermediária. / The tick Rhipicephalus microplus is the major cattle ectoparasite. The control of R. microplus is based mainly on the use of chemical acaricides, which contributed to the emerging problem of the selection of tick populations resistant to acaricides. Therefore, there is a need for the development of more efficient/sustainable methods of control, such as biological control using acari pathogenic fungi. The effectiveness of the fungus Metarhizium anisopliae alone or in association with chemical acaricide to control the bovine tick has already been evidenced under field conditions using an acaricide resistant tick strain. However, to date, little is known about the molecular pathways of R. microplus involved with its interaction with M. anisopliae and with acaricides. Thus, the aim of the present study is to evaluate the response of R. microplus larvae exposed to the fungus, the acaricide and the association of both. Firstly, a study was carried out to determine the most appropriate methodology to evaluate the in vitro effect of the fungus M. anisopliae on larvae of R. microplus tick. For this, we compared the Modified Larval Packet Test (LPT) and the Larval Immersion Test (LIT). The values of lethal time (LT50) obtained in the highest concentration of M. anisopliae (108conidia / mL) were 24.8 and 9.2 days for LPT and LIT, respectively. Mortality after 21 days was 38% and 98% for LPT and LIT, respectively, at the same concentration. The LIT proved to be the most indicated test to be used and was therefore chosen to carry out the following experiments Then, a study was performed to compare the susceptibility of different R. microplus isolates to M. anisopliae fungus. Sixty-seven field isolates were evaluated. For this, R. microplus larvae were immersed in a suspension of M. anisopliae (108conidia/mL) for 5 min. Lethal times (LT50) ranged from 2.6 to 24.9 days. Mortality observed on the 15th day after treatment ranged from 26.3 to 100% in the tested samples. These results demonstrated that R. microplus field populations showed a high variation in their susceptibility to M. anisopliae. Finally, a RNAseq analysis of R. microplus larvae exposed to M. anisopliae, cypermethrin, association of both or untreated (control) was performed. Analysis of the transcripts of the four groups generated a total of 507,792 sequences with a total length of 303,160,891 bp. We found 31 differentially expressed genes in the control group when compared to M. anisopliae, 39 with cypermethrin and 73 with M. anisopliae + cypermethrin. M. anisopliae and the association group had 81 differentially expressed genes and M. anisopliae and cypermethrin, 46 There were 177 differentially expressed genes when comparing M. anisopliae + cypermethrin with cypermethrin exposed larvae. The results of this study demonstrated that the association of M. anisopliae + cypermethrin increased the expression of genes related to response to aggression, possibly because the M. anisopliae + cypermethrin association causes a greater aggression to the tick and, then it could respond quickly, leading to overexpression of defense genes. The findings of this study provide information on the pathways and molecular mechanisms of R. microplus in response to the interaction of M. anisopliae and acaricides. In addition, these studies establish the basis for future research on key genes that control the susceptibility of R. microplus to M. anisopliae. The synergism evidenced in our studies confirms the idea that integrated control using biological control and chemical control is an option both for the control of acaricide resistant tick strains and for a faster control of tick strains that do not show resistance or exhibit intermediate resistance.

Thesis (PhD (Agric))--University of Stellenbosch, 2004. / ENGLISH ABSTRACT: Biological control studies were conducted with isolates of entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarrhizium anisopliae from Ethiopia and South Africa against the spotted stem borer Chilo partellus. The study was conducted from April 2002 to April 2003, at the department of Entomology and Nematology, University of Stellenbosch, South Africa. The objectives were to screen these isolates for pathogenicity and to determine the susceptibility of different larval instars; to study the effect of temperature on fungal development and virulence; to investigate food consumption of fungus treated larvae; to determine compatibility of fungal isolates with insecticides; to study the effect of exposure methods and diets on larval mortality; and to evaluate promising isolates under greenhouse conditions using artificially infested maize plants. Four isolates of B. bassiana and six isolates of M. anisopliae were tested against second instar larvae. Of these isolates, B. bassiana (BB-01) and M. anisopliae (PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61 and EE-01) were found to be highly pathogenic inducing 90 to 100 % mortality seven days after treatment. In subsequent assays, the fungal isolates were tested against third, fourth, fifth and sixth instar larvae. Second and sixth instar larvae were more susceptible to these isolates than third, fourth and fifth instar larvae. Conidial germination, radial growth and sporulation of the isolates PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61, EE-01 and BB-01 were retarded at 15 and 35 0C. A suitable temperature range for the isolates was from 20 - 30 0C. At 25 and 30 0C the isolates induced 100 % mortality to second instar larvae within four to six days. Second and third instar C. partellus larvae were treated with the isolates PPRC-4 and BB-01, and daily consumption of maize leaf was measured. Treatment with the fungi was associated with a reduction in mean daily food consumption. In in-vitro studies, five concentrations (0.1 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, and 100 ppm active ingredients) of the insecticides benfuracarb and endosulfan were tested with the isolates PPRC-4, PPRC-19, PPRC-16, EE-01 and BB-01. Increasing the concentration of the insecticides adversely affected germination, radial growth and sporulation of the isolates. In in-vivo studies combining the fungi, PPRC-4 and BB-01,with low concentrations (1 and 5 ppm a.i.), of the insecticides increased the mortality of third instar larvae from 65 to 100 %. Larvae sprayed directly with conidia, exposed to conidia treated leaves and dipped into conidial suspensions suffered high mortality of 98 to 100 %. Larvae exposed to treated leaves and larvae sprayed directly with conidia produced high numbers mycoses in cadavers. Exposure of larvae to treated leaves yielded high sporulation. At a low conidial concentration (1.25x107 conidia/ml), mycosis and sporulation were high. The optimum temperature was 20 0C for mycosis and 15 0C for sporulation. In greenhouse trails, a conidial suspension of 2 x 108 conidia/ml of the pathogenic isolates was sprayed on 3 to 4 week-old maize plants infested with 20 second instar larvae per plant. This resulted in suppression of foliar damage. Treatment with the fungi also reduced stem tunneling and deadheart. In addition, fungal treatment increased mean plant fresh and dry biomass compared to untreated control plants. In general, results from laboratory and greenhouse studies indicated that there was good potential for the use of these fungal isolates for controlling C. partellus larvae. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Biologiese beheerstudies is uitgevoer met isolate van die insekpatogeniese swamme, Beauvaria bassiana en Metarrhizium anisopliae teen die gespikkelde stamboorder, Chilo partellus. Die doelwitte was om hierdie isolate te evalueer vir patogenesiteit; die vatbaarheid van verskillende larvale instars teenoor hulle te bepaal; die invloed van temperatuur op swamontwikkeling en virulensie te bepaal; die voedsel inname van swambehandelde larwes te ondersoek; die verenigbaarheid van die swamisolate met insektedoders te bepaal; die invloed van blootstellingsmetodes en diëte op larvale mortaliteit; en om belowende isolate in glashuisproewe te evalueer met gebruik van kunsmatig besmette mielieplante. Vier isolate van B. bassiana en ses isolate van M. anisopliae is teen tweede instar larwes getoets. Uit dié isolate is B. bassiana (BB-01) en M. anisopliae (PPRC-4, PPRC- 19, PPRC-16 en EE-01) as hoogs patogenies bevind. Hulle het 90 tot 100 % mortaliteit na sewe dae veroorsaak. In daaropvolgende essays, is die swamisolate teen derde, vierde, vyfde en sesde instar larwes getoets. Tweede en sesde instar larwes was gevoeliger vir die isolate as die derde, vierde en vyfde instar larwes. Spoorkeming, radiale groei en sporulasie van die isolate PPRC-4, PPRC-19, PPRC-61, EE-01 en BB-01, is by 15 en 35 0C vertraag. ‘n Aanvaarbare temperatuurreeks vir die isolate is vanaf 20 tot 30 0C. By 25 en 30 0C het die isolate 100 % mortaliteit teen tweede instar larwes binne vier tot ses dae geïndusseer. Tweede en derde instar C. partellus larwes is met die isolate PPRC-4 en BB-01 behandel en die daaglikse inname van mielieblare gemeet. Behandeling met die swamme is met ‘n afname in die gemiddelde voedselinname geassosieer In in-vitro studies is vyf konsentrasies (0.1 dpm, 1 dpm, 5 dpm, 10 dpm en 100 dpm aktiewe bestandele) van die insekdoders, benfuracarb en endosulfan getoets saam met die isolate PPRC-4, PPRC-19, PPRC-16, EE-01 en BB-01. ‘n Toename in die konsentrasie van die insekdoders het ontkieming, radiale groei en sporulasie van die isolate benadeel. In in-vitro studies het die kombinering van die die swamme, PPRC-4 en BB-01, met lae konsentrasies (1 en 5 dpm a.b.) van die insekdoders mortaliteit van derde instar larwes vanaf 65 tot 100 % laat toeneem. Larwes wat direk met spore gespuit is, aan behandelde blare blootgestel is en in spoorsuspensies gedoop is het tot hoë mortaliteit gelei, (98 tot 100 %). Blootstelling aan behandelde blare saam met ‘n lae konidiakonsentrasie, 1.25x106 spore/ml) en ‘n temperatuur van 15 tot 20 0C het tot hoë swammikose en sporulasie in kadawers gelei. In glashuisproewe, is ‘n spoorsuspensies van 2 x 108 spores/ml van die patogeniese isolate op 3 tot 4 weekoud mielieplante wat met 20 tweede instar larwes per plant besmet is gespuit. Dit het blaarskade onderdruk. Behandeling met die swamme het ook stamtonnels en dooiehart verminder. Boonop het swambehandeling die vars- en droë plantbiomassa laat toeneem in vergelyking met die onbehandelde kontrole plante. Oor die algemeen het resultate van laboratorium- en glashuisproewe getoon dat daar goeie potensiaal is vir die gebruik van hierdie swamisolate vir die beheer van C. partellus larwes.

The dissertation is focused on the findings, whether it is combination of physical and biological seed treatment for selected field crops (oilseed rape, spring barley) comparable with chemical treatment. Evaluated the effectiveness of the physical seed treatment, low temperature plasma (Gliding Arc, microwave), a biological treatment culture mycoparasitic of the fungus Trichoderma virens and culture entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. In the context of experiments in laboratory conditions, was evaluated the effect of treatment on the evolution grains (the seeds), the percentage of germination grains (the seeds) and the percentage of healthy grains (the seeds). Individual plasma treatment in combination with biological treatment had a significant positive effect on the germination rate of grains (the seeds).There was no negative effect of physical and biological treatments on the grains (seeds). Involved the evaluation of emergence of the treated seed in laboratory and field conditions. In the field conditions for the selected crops in different localities and in different years, was assessed the effect of treatment on the development of the crop health and yield parameters. Plasma and plasma with T. virens treatments positively affected by the model of the plant better integration of crops, the length of the cob, (shell) and yield. The combined adjustment should in oilseed rape positive effect on the faster development of the spring, the length and strength of the root, earlier flowering and ripening. In contrast, the combined adjustment for barley spring positively influenced the emergence and tillering. According to the obtained results it seems that the combined physical and biological seed treatment is an effective alternative to the chemical treatment of seeds.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. / In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.

Com o intuito de gerar subsídios para melhoria do processo de produção de Metarhizium anisopliae, o presente estudo teve como principais objetivos, determinar os efeitos de inibidores de proteinases de soja no crescimento vegetativo, esporulação e virulência do fungo e comparar a produção, viabilidade e virulência dos conídios produzidos em diferentes tipos de arroz e aditivos. A adição de 5 g.L-1 de inibidores de proteinases semi-purificados de soja ou 0,5 g.L-1 de inibidor purificado do tipo Kunitz no meio de cultura ME resultou em grande aumento na esporulação (de duas a 75 vezes) sem afetar a viabilidade dos conídios de quatro isolados (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20) de M. anisopliae. A presença destes inibidores de proteinases também alterou a morfologia dos conídios produzidos em ME. Os mecanismos responsáveis por estas alterações fisiológicas não foram determinados, mas provavelmente estejam associados à ação anti-nutricional, diminuindo a absorção protéica e estimulando a esporulação. Os conídios produzidos no meio com adição de 0,5 g.L-1 de inibidor de proteinase do tipo Kunitz ou com 2,5 g.L-1 de albumina de soro bovino e no meio BDA apresentaram virulência superior aos conídios produzido no meio ME sem inibidores. Quando o inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi adicionado à suspensão de conídios do fungo antes da pulverização de lagartas de Diatraea saccharalis, a eficiência de controle foi 35,1%, inferior ao apresentado pelos demais tratamentos sem a presença deste inibidor. Nos estudos para determinação dos melhores tipos de arroz para produção de M. anisopliae, tentou-se correlacionar à produção de conídios com características destes substratos como valor nutricional, teor de resíduos de agrotóxicos e densidade de microorganismos. O arroz parboilizado foi responsável pela maior produção de conídios (4,38 x 109 conídios.g-1). Este tipo de arroz apresentou teor de proteína bruta menor do que a maioria dos arrozes e o maior teor de umidade (41,3% após a autoclavagem). Além disto, os grãos após autoclavagem ficaram menos gelatinosos e mais soltos, o que facilita o processo de produção do fungo. Enquanto que os arrozes dos tipos brancos polidos, canjicão e integral ficaram pegajosos e formaram grumos, o que provavelmente deve acarretar em menor superfície de desenvolvimento para o fungo. O segundo melhor arroz, o canjicão, com produção de 3,42 x 109 conídios.g-1, teve a maior quantidade de fungos contaminantes nos grãos crus. Quantidades intermediárias de conídios foram produzidas pelos arrozes branco polido irrigado, de terras altas e orgânico. O integral foi o que resultou na menor quantidade de conídios (1,53 x 109 conídios.g-1), sendo o mais rico em minerais, proteína bruta e extrato etéreo. Nenhum dos aditivos (farelo de soja, grãos de soja partidos, extrato de soja, peptona de soja, inibidores de proteinases de soja semipurificados e purificado do tipo Kunitz, polpa cítrica e levedura) resultou em aumento na produção de conídios em comparação com o arroz parboilizado sem aditivos. Os conídios produzidos em todos os arrozes e aditivos apresentam viabilidade superior a 99%. As vantagens da utilização do arroz parboilizado levando-se em consideração custo, facilidade de manuseio e produtividade são discutidas. / In order to optimize the production process of Metarhizium anisopliae, the present study aimed to determine the effects of soybean proteinase inhibitors on growth, sporulation and virulence of the fungus and to compare yield, viability and virulence of M. anisopliae conidia produced in different types of rice and additives. The addition of 5 g.L-1 of semi-purified soybean proteinase inhibitor or 0.5 g.L-1 of Kunitz-type inhibitor purified on the culture medium ME resulted in large increases in sporulation (two to 75 times) without affecting the viability of conidia of four M. anisopliae isolates (ESALQ-1037, IBCB348, E9, F20). The presence of proteinase inhibitors altered morphology of conidia produced in ME. Mechanisms responsible for these physiological changes in the fungus have not been determined, but it is probably associated to an anti-nutritional action, reducing the absorption of protein and stimulating sporulation. Spores produced in the medium with the addition of 0.5 g.L-1 Kunitz-type inhibitor purified or 2.5 g.L-1 of bovine serum albumin (BSA) and PDA medium showed higher virulence of conidia produced in ME without inhibitors. When the Kunitz-type inhibitor was added to conidial suspension of the fungus before spraying larvae of Diatraea saccharalis, control efficiency was 35.1% lower than that presented in other inhibitor-free treatments. In the studies aiming to determine the best types of rice for production of M. anisopliae, we tried to correlate production of conidia with characteristics of these substrates such as nutritional content, pesticide residues and density of microorganisms. The parboiled rice was responsible for greater production of conidia (4.38 x 109 conidia.g-1). This type of rice showed crude protein content lower than most rice and the highest moisture content (41.3% after autoclaving). Besides that, grains became less gelatinous and loose after autoclaving, and these feature favored fungus production. While types of polished white, brown rice and course (broken) rice grain were sticky and formed clumps, providing a smaller area for fungus development. The second best rice, course rice grain, with production of 3.42 x 109 conidia.g-1, had the highest amount of fungal contaminants in raw grains. Intermediate amounts of conidia were produced by white irrigated polished rice, upland rice and organic rice. The brown rice was the kind that resulted in fewer conidia (1.53 x 109 conidia.g-1), being the richest in minerals, protein and lipids. None of the additives (soybean meal, soybean parties, soy extract, soy peptone, semi-purified soybean proteinase inhibitor, Kunitz-type inhibitor purified, citrus pulp and yeast) resulted in increased production of conidia compared to parboiled rice without additives. Conidia produced in all types of rice and additives presented viability greater than 99%. The advantages of the use of parboiled rice taking into consideration the cost, easy handling and productivity are discussed.