Evalúa dos programas de vacunación en animales contra Neumonía Enzoótica procedentes de madres con y sin antecedentes de vacunación contra Mycoplasma hyopneumoniae. Se trabajaron 240 porcinos de crianza intensiva, divididos en dos grupos de 120 animales cada uno, con 4 tratamientos de 30 lechones, vacunados con dos dosis a los 35 y 56 días, 42 y 56 días; vacunados con una dosis a los 42 días, y el control (placebo). La medición de anticuerpos fue mediante la prueba de ELISA a las 3, 6, 10, 12, 16 y 21 semanas de edad. Los animales fueron pesados a los 21 y 145 días a fin de obtener la ganancia de peso. En el grupo 1 (madres sin vacunación), se encontró que no existía diferencia significativa entre la ganancia de peso de los animales según tratamiento. Los títulos de anticuerpos fueron similares entre los grupos de vacunación. El grado de consolidación pulmonar fue estadísticamente diferente entre los grupos, siendo mayor en el control (p=0.006). En el grupo 2 (madres vacunadas), no hubieron diferencias significativas entre la ganancia de peso de los animales según tratamiento. Los títulos de anticuerpos y el grado de consolidación pulmonar fueron similares entre los grupos de vacunación. / Tesis

O complexo respiratório bovino é um dos principais problemas encontrados em bovinos tanto confinados quanto àqueles criados a pasto, levando a importantes perdas econômicas devido aos altos índices de morbidade e mortalidade. O objetivo geral deste trabalho foi determinar a prevalência de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb- 3) e Influenza vírus D e a prevalência de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (BoHV1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB) em bezerros sadios e com broncopneumonia criados nos assentamentos de Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema - SP. Além disso, objetivase avaliar a associação destes micro-organismos com a presença da broncopneumonia e dos sinais e sintomas apresentados pelos animais durante a avaliação física. Estudou-se 141 bezerros, machos e fêmeas de até um ano de idade, os quais, após exame físico, foram classificados em sadios e com pneumonia. Foram coletadas amostras de lavado traqueobrônquico e sangue total para obtenção do soro. As amostras foram utilizadas para isolamento e identificação de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida e M. haemolytica, detecção molecular de Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb-3) e Influenza vírus D (IVD) e detecção de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (HVBo-1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB). Não houve isolamento de P. multocida e M. haemolytica. Dentre as bactérias aeróbias isoladas, observou-se maior frequência de isolamento de Bacillus sp., Staphylococcus intermedius e bactérias Gram-negativas não fermentadoras. M. díspar foi a única espécie de micoplasma identificada com os oligonucleotídeos iniciadores utilizados. Faz-se necessário a busca por outras espécies de micoplasmas que podem estar relacionadas aos casos de broncopneumonia em bovinos. Não houve detecção de Parainfluenza Bovino tipo 3 e Influenza vírus D nas amostras de lavado traqueobrônquico. Os três municípios estudados apresentaram anticorpos para os vírus estudados. Observou-se prevalência de BoHV-1, VDVB e VRSB de 31,7%, 24,6 e 38,8%, respectivamente. Não houve associação entre o status de saúde dos bezerros e os achados microbiológicos e sorológicos. Foi observada associação entre enterobactérias e a variável “desidratação leve” (p=0,033/ OR= 11,25, IC: 1,809-41,834. Observou-se associações entre Mollicutes e a variável “secreção nasal serosa” (p=0,03). Concluiu-se que a broncopneumonia é uma enfermidade multifatorial. Faz-se, necessário, portanto, a associação dos achados de exames físico, microbiológicos e características do ambiente e manejo / Bovine respiratory disease complex is one of the major problems observed in feedlot and grazing cattle, causing economic losses due to high morbidity and mortality rates. The aim of this study was to determine the prevalence of M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 (bPI-3) and Influenza vírus D (IVD) and the prevalence of antibodies against Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB) in healthy and pneumonic calves raised in settlements located in Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema São Paulo State. Moreover, we aimed to evaluate the association between those microorganisms and antibodies and the presence of bronchopneumonia and the symptoms observed during the physical examination. We studied 141 males and females calves that were classified as healthy and pneumonic calves. We collected tracheobronchial lavage samples and total blood to obtain serum samples. Isolation and biochemical/ molecular identification were performed in order to detect M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 and Influenzavírus D. Serological survey was performed to detect antibodies aginst Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB). There was not any isolation of P. multocida and M. haemolytica. Bacillus sp., Staphylococcus intermedius and Non-fermenter Gram-negative bacteria were higher prevalent compared to the other aerobic bacteria isolated. M. díspar was the only mycoplasma species identified by the primers used. It is necessary the identification of other mycoplasma species that could be related to the cases of bronchopneumonia in cattle. Bovine Parainfluenza type-3 and Influenza vírus D were not identified. Antibodies were detected in all municipalities. The prevalence of BoHV, BVDV e VRSB was 31.7%, 24.6 and 38.8%, respectively. The association between health status and microbial/ serological findings was not observed. Enterobacterias were associated to “mild dehydration” (p=0.033/OR=11.25; IC: 1.809-41.834). Associations between Mollicutes and “serous nasal discharge” (p=0.03) was also detected. In conclusion, S. intermedius was associated to “nasal air flow” (p=0.097). In conclusion bovine bronchopneumonia is multi-factorial disease. It is necessary, though, physical examination, microbiology and management and environment feature results

O Brasil é o 18ª maior produtor de carne ovina e, apesar de ser em grande parte informal, é uma cultura crescente no país. Dentre as enfermidades infecciosas que acomete a ovinocultura a broncopneumonia é uma das mais recorrentes, no entanto, não há muitos estudos sobre esta enfermidade em pequenos ruminantes no Brasil. Por isso, esta pesquisa teve como objetivo verificar a ocorrência de doenças respiratórias no estado de São Paulo e Rio de Janeiro causadas por bactérias e vírus. Para a realização desse projeto foi utilizado a técnica de lavado traqueobrônquico transtraqueal e coleta de sangue total para obtenção do soro em 99 ovinos. Essas amostras foram submetidas a teste de virusneutralização para identificação de anticorpos contra vírus da Parainfluenza Tipo 3 (PI-3), Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV- 1), Vírus Sincicial Respiratório Bovino (BRSV) e Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB). Utilização do teste de imunodifusão em gel de agarose e Eradikt® para detectar a presença de anticorpos contra Lentivírus de Pequenos Ruminantes (LVPR). Isolamento e identificação bioquímica para M. haemolytica e Pasteurella multocida. Cultivo e isolamento, identificação bioquímica e PCR foram testes utilizados para identificação de micoplasmas (Mycoplasma bovis, M. agalactiae, M. mycoides subsp. capri). Das 99 amostras coletadas, 33 foram de ovinos doentes e 66 de ovinos sadios. Não houve identificação de M. haemolytica e P. multocida, nem presença de anticorpos contra BoHV-1 e VDVB. No entanto, observou-se a prevalência de 52,52%, 48,48% e 21,87% de PI-3, BRSV e LVPR respectivamente. Em relação as bactérias aeróbias, houve maior frequência de isolamento de Bacillus sp. e Gram-negativas não fermentadoras. Apesar de identificar bactérias da classe Mollicutes em colônias isoladas em 23,28% das amostras, houve apenas uma identificação com os oligonucleotídeos utilizados, o M. mycoides subsp. capri, primeiro isolamento em ovinos no estado de São Paulo e Rio de Janeiro. Houve diferença estatística significativa (p<0,05) entre animais com broncopneumonia e manifestações clínicas como taquipneia, hipertermia, secreção nasal, tosse, dispneia, crepitação fina e ronco e entre animais com broncopneumonia e não realizam de quarentena e não separam animais doentes. A broncopneumonia envolve vários fatores, incluindo o manejo, agente infeccioso e a imunidade do animal. Por isso, é necessário conhecer todos esses aspectos e associá-los para uma melhor prevenção e tratamento. / Brazil is the 18th largest producer of sheep meat and, despite being largely informal, is a growing crop in the country. Among the infectious diseases that affect sheep production, bronchopneumonia is one of the most recurrent, however, there are not many studies on this disease in small ruminants in Brazil. Therefore, this research aimed to verify the occurrence of respiratory diseases in the state of São Paulo and Rio de Janeiro caused by bacteria and viruses. For the accomplishment of this project was used tracheobronchial lavage technique transtracheal and collection of whole blood to obtain serum in 99 sheep. These samples were submitted to virus neutralization test to identify antibodies against Parainfluenza Type 3 (PI-3), Bovine Herpesvirus Type 1 (BoHV-1), Bovine Respiratory Syncytial Virus (BRSV) and Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV). Use of the Eradikit ® and agarose gel immunodiffusion test to detect the presence of antibodies against Small Ruminant Lentiviruses (LVPR). Isolation and biochemical identification for M. haemolytica and Pasteurella multocida. Cultivation and isolation, biochemical identification and PCR were used to identify mycoplasmas (Mycoplasma bovis, M. agalactiae, M. mycoides subsp. Capri). Of the 99 samples collected, 33 were from diseased sheep and 66 from healthy sheep. There was no identification of M. haemolytica and P. multocida, nor presence of antibodies against BoHV-1 and BVDV. However, the prevalence of 52.52%, 48.48% and 21.87% of PI-3, BRSV and LVPR, respectively, was observed. In relation to aerobic bacteria, there was a higher frequency of isolation of Bacillus sp. and Gram-negative non-fermenters. Despite identifying Mollicute class bacteria in isolated colonies in 23.28% of the samples, there was only one identification with the oligonucleotides used, M. mycoides subsp. capri, first isolation in sheep in the state of São Paulo and Rio de Janeiro. There was a significant statistical difference (p <0.05) between animals with bronchopneumonia and clinical manifestations such as tachypnea, hyperthermia, nasal secretion, cough, dyspnea, fine crackling and snoring, and between animals with bronchopneumonia and quarantine and separation of diseased animals. Bronchopneumonia involves several factors, including management, infectious agent and the immunity of the animal. Therefore, it is necessary to know all these aspects and to associate them for a better prevention and treatment.

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Os micoplasmas hemotróficos (hemoplasmas) são organismos pleomórficos, epicelulares, gram negativos que infectam a superfície dos eritrócitos de diversas espécies. Devido ao fato de ser incultivável em meios de cultura tradicionais, o diagnóstico é baseado em técnicas moleculares. Em cães, a infecção pelos hemoplasmas pode causar anemia hemolítica na fase aguda, enquanto na doença crônica os sinais são inaparentes, sendo que a imunodepressão e a esplenectomia podem desencadear a doença aguda. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a prevalência dos hemoplasmas em cães submetidos a atendimento clínico e cirúrgico no Hospital Veterinário da Universidade de Passo Fundo (HV-UPF), identificar os fatores de risco para infecçao pelos hemoplasmas e as condições clínicas na infecção natural. Para isso, foram selecionadas amostras de sangue com EDTA submetidas com propósito diagnóstico ao Laboratório de Análises Clínicas do HV-UPF. Após a verificação do controle da extração (PCR para o gene GAPDH), as amostras foram encaminhadas ao Department of Comparative Pathobiology, Purdue University (IN, USA) para as análises moleculares. Foi realizada reação em cadeia da polimerase (PCR) para os hemoplasmas felinos (‘Candidatus Mycoplasma turicencis’, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’) e caninos (Mycoplasma haemocanis e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’). Ao total, foram analisadas 347 amostras, sendo que 16 foram negativas para o controle GAPDH e excluídas do estudo. A prevalência para hemoplasma foi de 6,4% (21/331) sendo 5,1% (17/331) para Mycoplasma haemocanis e 1,8% (6/331) para um organismo geneticamente semelhante ao hemoplasma felino ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’. Não foram encontradas amostras positivas para ‘Candidatus Mycoplasma turicencis’ e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’. Os cães positivos para hemoplasmas tinham como fatores de risco a presença de ectoparasitas (carrapatos e/ou pulgas), idade avançada e habitavam em casa. Embora tenha sido identificada a presença de correlação entre as neoplasias e feridas causadas por brigas com outros cães e a infecção pelos hemoplasmas, tais resultados foram atribuídos a uma influência da idade e a presença de ectoparasitas. Não houve variações hematológicas e bioquímicas em decorrência da infecção pelo Mycoplasma haemocanis. Refere-se, no presente estudo, o primeiro estudo relacionando a freqüência da infecção pelos hemoplasmas em cães no Brasil. / The hemotropic mycoplasmas (haemoplasmas) are pleomorphic epicellular and gramnegative organisms that do not grow in conventional culture media. The organisms infect the red blood cell surface of several species and nowadays the diagnosis is based on molecular techniques. In dogs, the acute infection causes severe hemolytic anemia, while in the chronic disease the clinical signs are unapparent. In addition splenectomy or immunosuppression may result in the acute disease. The aims of the present study were to evaluate the prevalence of haemoplasmas in dogs that were submitted to clinical or chirurgical procedures at the Veterinary Teaching Hospital of the University of Passo Fundo (UPF-HV), to identify the risk factors for infection and the clinical conditions of haemoplasma natural infection. EDTA blood samples that were submitted for diagnosis purpose at the Laboratório de Análises Clínicas of the HV-UPF were randomly selected and clinical data were obtained from the hospital database. After DNA extraction and the internal control, the samples were sent to the Department of Comparative Pathobiology at the Purdue University (IN, USA), School of Veterinary Medicine, for molecular analysis. A polymerase chain reaction (PCR) for feline haemoplasmas ('Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haemominutum') and canine haemoplasmas (Mycoplasma haemocanis and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum') was performed. A total of 347 samples were analyzed, while 16 were negative for the control GAPDH and excluded from the study. The total prevalence was 6.4% (21/331), 5.1% (17/331) for Mycoplasma Haemocanis and 1.8% (6/331) for an organism genetically similar to feline 'Candidatus Mycoplasma haemominutum' and no samples were found positive to 'Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum'. The haemoplasma positive dogs lived at private homes, are old and were in contact with ectoparasites (ticks and/or fleas). Although it was identified a positive correlation between neoplasic disease, wounds caused by dog fights and the haemoplasma infection, these results were attributed to the influence of age and the vector. Hematological and biochemical variations were not identified at Mycoplasma haemocanis positive samples. This is the first study frequency of haemoplasma infection in dogs in Brazil.

Os micoplasmas hemotróficos (hemoplasmas) são organismos pleomórficos, epicelulares, gram negativos que infectam a superfície dos eritrócitos de diversas espécies. Devido ao fato de ser incultivável em meios de cultura tradicionais, o diagnóstico é baseado em técnicas moleculares. Em cães, a infecção pelos hemoplasmas pode causar anemia hemolítica na fase aguda, enquanto na doença crônica os sinais são inaparentes, sendo que a imunodepressão e a esplenectomia podem desencadear a doença aguda. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a prevalência dos hemoplasmas em cães submetidos a atendimento clínico e cirúrgico no Hospital Veterinário da Universidade de Passo Fundo (HV-UPF), identificar os fatores de risco para infecçao pelos hemoplasmas e as condições clínicas na infecção natural. Para isso, foram selecionadas amostras de sangue com EDTA submetidas com propósito diagnóstico ao Laboratório de Análises Clínicas do HV-UPF. Após a verificação do controle da extração (PCR para o gene GAPDH), as amostras foram encaminhadas ao Department of Comparative Pathobiology, Purdue University (IN, USA) para as análises moleculares. Foi realizada reação em cadeia da polimerase (PCR) para os hemoplasmas felinos (‘Candidatus Mycoplasma turicencis’, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’) e caninos (Mycoplasma haemocanis e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’). Ao total, foram analisadas 347 amostras, sendo que 16 foram negativas para o controle GAPDH e excluídas do estudo. A prevalência para hemoplasma foi de 6,4% (21/331) sendo 5,1% (17/331) para Mycoplasma haemocanis e 1,8% (6/331) para um organismo geneticamente semelhante ao hemoplasma felino ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’. Não foram encontradas amostras positivas para ‘Candidatus Mycoplasma turicencis’ e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’. Os cães positivos para hemoplasmas tinham como fatores de risco a presença de ectoparasitas (carrapatos e/ou pulgas), idade avançada e habitavam em casa. Embora tenha sido identificada a presença de correlação entre as neoplasias e feridas causadas por brigas com outros cães e a infecção pelos hemoplasmas, tais resultados foram atribuídos a uma influência da idade e a presença de ectoparasitas. Não houve variações hematológicas e bioquímicas em decorrência da infecção pelo Mycoplasma haemocanis. Refere-se, no presente estudo, o primeiro estudo relacionando a freqüência da infecção pelos hemoplasmas em cães no Brasil. / The hemotropic mycoplasmas (haemoplasmas) are pleomorphic epicellular and gramnegative organisms that do not grow in conventional culture media. The organisms infect the red blood cell surface of several species and nowadays the diagnosis is based on molecular techniques. In dogs, the acute infection causes severe hemolytic anemia, while in the chronic disease the clinical signs are unapparent. In addition splenectomy or immunosuppression may result in the acute disease. The aims of the present study were to evaluate the prevalence of haemoplasmas in dogs that were submitted to clinical or chirurgical procedures at the Veterinary Teaching Hospital of the University of Passo Fundo (UPF-HV), to identify the risk factors for infection and the clinical conditions of haemoplasma natural infection. EDTA blood samples that were submitted for diagnosis purpose at the Laboratório de Análises Clínicas of the HV-UPF were randomly selected and clinical data were obtained from the hospital database. After DNA extraction and the internal control, the samples were sent to the Department of Comparative Pathobiology at the Purdue University (IN, USA), School of Veterinary Medicine, for molecular analysis. A polymerase chain reaction (PCR) for feline haemoplasmas ('Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haemominutum') and canine haemoplasmas (Mycoplasma haemocanis and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum') was performed. A total of 347 samples were analyzed, while 16 were negative for the control GAPDH and excluded from the study. The total prevalence was 6.4% (21/331), 5.1% (17/331) for Mycoplasma Haemocanis and 1.8% (6/331) for an organism genetically similar to feline 'Candidatus Mycoplasma haemominutum' and no samples were found positive to 'Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum'. The haemoplasma positive dogs lived at private homes, are old and were in contact with ectoparasites (ticks and/or fleas). Although it was identified a positive correlation between neoplasic disease, wounds caused by dog fights and the haemoplasma infection, these results were attributed to the influence of age and the vector. Hematological and biochemical variations were not identified at Mycoplasma haemocanis positive samples. This is the first study frequency of haemoplasma infection in dogs in Brazil.

Os micoplasmas hemotróficos (hemoplasmas) são organismos pleomórficos, epicelulares, gram negativos que infectam a superfície dos eritrócitos de diversas espécies. Devido ao fato de ser incultivável em meios de cultura tradicionais, o diagnóstico é baseado em técnicas moleculares. Em cães, a infecção pelos hemoplasmas pode causar anemia hemolítica na fase aguda, enquanto na doença crônica os sinais são inaparentes, sendo que a imunodepressão e a esplenectomia podem desencadear a doença aguda. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a prevalência dos hemoplasmas em cães submetidos a atendimento clínico e cirúrgico no Hospital Veterinário da Universidade de Passo Fundo (HV-UPF), identificar os fatores de risco para infecçao pelos hemoplasmas e as condições clínicas na infecção natural. Para isso, foram selecionadas amostras de sangue com EDTA submetidas com propósito diagnóstico ao Laboratório de Análises Clínicas do HV-UPF. Após a verificação do controle da extração (PCR para o gene GAPDH), as amostras foram encaminhadas ao Department of Comparative Pathobiology, Purdue University (IN, USA) para as análises moleculares. Foi realizada reação em cadeia da polimerase (PCR) para os hemoplasmas felinos (‘Candidatus Mycoplasma turicencis’, ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’) e caninos (Mycoplasma haemocanis e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’). Ao total, foram analisadas 347 amostras, sendo que 16 foram negativas para o controle GAPDH e excluídas do estudo. A prevalência para hemoplasma foi de 6,4% (21/331) sendo 5,1% (17/331) para Mycoplasma haemocanis e 1,8% (6/331) para um organismo geneticamente semelhante ao hemoplasma felino ‘Candidatus Mycoplasma haemominutum’. Não foram encontradas amostras positivas para ‘Candidatus Mycoplasma turicencis’ e ‘Candidatus Mycoplasma haematoparvum’. Os cães positivos para hemoplasmas tinham como fatores de risco a presença de ectoparasitas (carrapatos e/ou pulgas), idade avançada e habitavam em casa. Embora tenha sido identificada a presença de correlação entre as neoplasias e feridas causadas por brigas com outros cães e a infecção pelos hemoplasmas, tais resultados foram atribuídos a uma influência da idade e a presença de ectoparasitas. Não houve variações hematológicas e bioquímicas em decorrência da infecção pelo Mycoplasma haemocanis. Refere-se, no presente estudo, o primeiro estudo relacionando a freqüência da infecção pelos hemoplasmas em cães no Brasil. / The hemotropic mycoplasmas (haemoplasmas) are pleomorphic epicellular and gramnegative organisms that do not grow in conventional culture media. The organisms infect the red blood cell surface of several species and nowadays the diagnosis is based on molecular techniques. In dogs, the acute infection causes severe hemolytic anemia, while in the chronic disease the clinical signs are unapparent. In addition splenectomy or immunosuppression may result in the acute disease. The aims of the present study were to evaluate the prevalence of haemoplasmas in dogs that were submitted to clinical or chirurgical procedures at the Veterinary Teaching Hospital of the University of Passo Fundo (UPF-HV), to identify the risk factors for infection and the clinical conditions of haemoplasma natural infection. EDTA blood samples that were submitted for diagnosis purpose at the Laboratório de Análises Clínicas of the HV-UPF were randomly selected and clinical data were obtained from the hospital database. After DNA extraction and the internal control, the samples were sent to the Department of Comparative Pathobiology at the Purdue University (IN, USA), School of Veterinary Medicine, for molecular analysis. A polymerase chain reaction (PCR) for feline haemoplasmas ('Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haemominutum') and canine haemoplasmas (Mycoplasma haemocanis and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum') was performed. A total of 347 samples were analyzed, while 16 were negative for the control GAPDH and excluded from the study. The total prevalence was 6.4% (21/331), 5.1% (17/331) for Mycoplasma Haemocanis and 1.8% (6/331) for an organism genetically similar to feline 'Candidatus Mycoplasma haemominutum' and no samples were found positive to 'Candidatus Mycoplasma turicencis' and 'Candidatus Mycoplasma haematoparvum'. The haemoplasma positive dogs lived at private homes, are old and were in contact with ectoparasites (ticks and/or fleas). Although it was identified a positive correlation between neoplasic disease, wounds caused by dog fights and the haemoplasma infection, these results were attributed to the influence of age and the vector. Hematological and biochemical variations were not identified at Mycoplasma haemocanis positive samples. This is the first study frequency of haemoplasma infection in dogs in Brazil.

O complexo respiratório bovino é um dos principais problemas encontrados em bovinos tanto confinados quanto àqueles criados a pasto, levando a importantes perdas econômicas devido aos altos índices de morbidade e mortalidade. O objetivo geral deste trabalho foi determinar a prevalência de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb- 3) e Influenza vírus D e a prevalência de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (BoHV1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB) em bezerros sadios e com broncopneumonia criados nos assentamentos de Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema - SP. Além disso, objetivase avaliar a associação destes micro-organismos com a presença da broncopneumonia e dos sinais e sintomas apresentados pelos animais durante a avaliação física. Estudou-se 141 bezerros, machos e fêmeas de até um ano de idade, os quais, após exame físico, foram classificados em sadios e com pneumonia. Foram coletadas amostras de lavado traqueobrônquico e sangue total para obtenção do soro. As amostras foram utilizadas para isolamento e identificação de M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida e M. haemolytica, detecção molecular de Parainfluenza Bovino tipo-3 (PIb-3) e Influenza vírus D (IVD) e detecção de anticorpos contra Vírus da Diarreia Viral Bovina (VDVB), Herpesvírus tipo -1 (HVBo-1) e o Vírus Respiratório Sincicial Bovino (VRSB). Não houve isolamento de P. multocida e M. haemolytica. Dentre as bactérias aeróbias isoladas, observou-se maior frequência de isolamento de Bacillus sp., Staphylococcus intermedius e bactérias Gram-negativas não fermentadoras. M. díspar foi a única espécie de micoplasma identificada com os oligonucleotídeos iniciadores utilizados. Faz-se necessário a busca por outras espécies de micoplasmas que podem estar relacionadas aos casos de broncopneumonia em bovinos. Não houve detecção de Parainfluenza Bovino tipo 3 e Influenza vírus D nas amostras de lavado traqueobrônquico. Os três municípios estudados apresentaram anticorpos para os vírus estudados. Observou-se prevalência de BoHV-1, VDVB e VRSB de 31,7%, 24,6 e 38,8%, respectivamente. Não houve associação entre o status de saúde dos bezerros e os achados microbiológicos e sorológicos. Foi observada associação entre enterobactérias e a variável “desidratação leve” (p=0,033/ OR= 11,25, IC: 1,809-41,834. Observou-se associações entre Mollicutes e a variável “secreção nasal serosa” (p=0,03). Concluiu-se que a broncopneumonia é uma enfermidade multifatorial. Faz-se, necessário, portanto, a associação dos achados de exames físico, microbiológicos e características do ambiente e manejo / Bovine respiratory disease complex is one of the major problems observed in feedlot and grazing cattle, causing economic losses due to high morbidity and mortality rates. The aim of this study was to determine the prevalence of M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 (bPI-3) and Influenza vírus D (IVD) and the prevalence of antibodies against Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB) in healthy and pneumonic calves raised in settlements located in Caiuá, Presidente Epitácio e Mirante de Paranapanema São Paulo State. Moreover, we aimed to evaluate the association between those microorganisms and antibodies and the presence of bronchopneumonia and the symptoms observed during the physical examination. We studied 141 males and females calves that were classified as healthy and pneumonic calves. We collected tracheobronchial lavage samples and total blood to obtain serum samples. Isolation and biochemical/ molecular identification were performed in order to detect M. bovis, M. díspar, M. mycoides subsp. mycoides SC, P. multocida, M. haemolytica, Bovine Parainfluenza type-3 and Influenzavírus D. Serological survey was performed to detect antibodies aginst Bovine Viral Diarrhea Vírus (BVDV), Bovine Herpesvírus type -1 (BoHV1) and Bovine Respiratory Syncytial Vírus (VRSB). There was not any isolation of P. multocida and M. haemolytica. Bacillus sp., Staphylococcus intermedius and Non-fermenter Gram-negative bacteria were higher prevalent compared to the other aerobic bacteria isolated. M. díspar was the only mycoplasma species identified by the primers used. It is necessary the identification of other mycoplasma species that could be related to the cases of bronchopneumonia in cattle. Bovine Parainfluenza type-3 and Influenza vírus D were not identified. Antibodies were detected in all municipalities. The prevalence of BoHV, BVDV e VRSB was 31.7%, 24.6 and 38.8%, respectively. The association between health status and microbial/ serological findings was not observed. Enterobacterias were associated to “mild dehydration” (p=0.033/OR=11.25; IC: 1.809-41.834). Associations between Mollicutes and “serous nasal discharge” (p=0.03) was also detected. In conclusion, S. intermedius was associated to “nasal air flow” (p=0.097). In conclusion bovine bronchopneumonia is multi-factorial disease. It is necessary, though, physical examination, microbiology and management and environment feature results

Os micoplasmas são os menores microrganismos capazes de autoreplicação conhecidos na natureza, responsáveis por uma série de doenças no homem e nos animais, infectando ainda plantas e insetos. Constituem um grande grupo de bactérias, ordenadas em diferentes gêneros na classe Mollicutes, cuja principal característica em comum, além do genoma reduzido, é a ausência de parede celular. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsável pela Pleuropneumonia Contagiosa Bovina, foi o primeiro microrganismo desta classe de bactérias a ser identificado. Esta é uma doença bastante grave, com altas taxas de morbidade e mortalidade. A variedade Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC é responsável principalmente por casos de Pleuropneumonia Contagiosa Caprina, mastite no gado bovino, e ainda artrite em ovinos e caprinos em menor extensão. M. capricolum é um patógeno caprino, responsável principalmente por casos de artrite com grande importância econômica na medicina veterinária. M. pulmonis é um patógeno de roedores, considerado como o melhor modelo experimental para o estudo das micoplasmoses respiratórias. M. genitalium, o menor microrganismo conhecido capaz de se autoreplicar, é um patógeno humano responsável por casos de uretrite não gonocócica, cujo seqüenciamento completo do cromossomo tornou-se um marco na era da genômica. O estudo funcional do genoma destes micoplasmas, para a compreensão de sua biologia e patogenicidade, requer o desenvolvimento de ferramentas genéticas eficientes. No presente trabalho, análises in silico das seqüências na região das prováveis origens de replicação cromossômica (oriC) destes micoplasmas demonstraram a existência de possíveis DnaA boxes localizados em torno do gene dnaA. Estas regiões oriC foram caracterizadas funcionalmente após sua clonagem em vetores artificiais e a transformação dos micoplasmas com os plasmídeos recombinantes resultantes. O plasmídeo pMPO1, contendo a região oriC de M. pulmonis, sofreu integração no cromossomo do micoplasma por recombinação homóloga após poucas passagens in vitro. A redução desta oriC para o fragmento contendo somente os DnaA boxes localizados nas estremidades 5´ou 3´do gene dnaA não foi capaz de produzir plasmídeos replicativos em M. pulmonis, exceto quando estes dois fragmentos foram clonados no mesmo vetor, espaçados pelo determinante de resistência à tetraciclina tetM. Um fragmento interno do gene da hemolisina A (hlyA) de M. pulmonis foi clonado nestes plasmídeos oriC, e os vetores resultantes foram utilizados para transformar o micoplasma. A integração destes vetores por um crossing-over com o gene hlyA, causando a sua dirupção, foi documentada. Deste modo, estes plasmídeos oriC podem vir a se tornar ferramentas genéticas valiosas para o estudo do papel de genes específicos, notadamente aqueles potencialmente envolvidos na patogênese. / Mycoplasmas are the smallest microorganisms capable of self replication known to date, responsible for many diseases in man and animals, infecting also plants and insects. They constitute a large group of bacteria, classified in different genera in the class Mollicutes, which main common characteristic, besides the small genome, is the absence of a cell wall. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes SC, responsible for the Bovine Contagious Pleuropneumonia, was the first microorganism of this class of bacteria to be identified. That is a quite severe disease, with high morbidity and mortality rates. Mycoplasma mycoïdes subsp. mycoïdes LC is responsible mainly for cases of Caprine Contagious Pleuropneumonia, mastitis in cattle, and also arthritis in goats and sheep in less extension. M. capricolum is a pathogen of goats, responsible mainly by cases of arthritis with large economic impact in veterinary medicine. M. pulmonis is a rodent pathogen, considered to be the best experimental model for studying respiratory mycoplasmoses. M. genitalium, the smallest microorganism capable of self replication, is an human pathogen responsible for cases of non gonococcal urethritis, which complete chromosome sequencing has become a benchmark in the era of genomics. Functional studies of these mycoplasma genomes, for comprehension of their biology and pathogenicity, requires the development of efficient genetic tools. In the present work, in silico analysis of sequences of the putative origin of chromosome replication (oriC) region of these mycoplasmas demonstrates the existence of putative DnaA boxes located around the dnaA gene. These oriC regions were functionally characterized after cloning into artificial vectors and transformation of mycoplasmas with the resulting recombinant plasmids. The plasmid pMPO1, which contains the M. pulmonis oriC region, has integrated into the mycoplasma chromosome by homologous recombination after a few in vitro passages. Reduction of this oriC to the fragment containing only the DnaA boxes located upstream or downstream the dnaA gene could not produce plasmids able to replicate in M. pulmonis, except when these two fragments were cloned in the same vector, spaced by tetracycline resistance gene tetM. An internal fragment of the M. pulmonis hemolysine A gene (hlyA) was cloned into these oriC plasmids, and the resulting vectors were used to transform the mycoplasma. Integration of these disruption vectors by one crossing-over with the hlyA gene could be documented. Therefore, these oriC plasmids may become valuable genetic tools for studying the role of specific genes of mycoplasmas, specially those potentially involved in pathogenesis.

Aquesta tesi se centra en l’estudi de les possibles glicosiltransferases de Micoplasma genitalium involucrades en la síntesi de glicolípids. Aquests compostos formen part de la membrana plasmàtica del microorganisme, únic envolcall que el protegeix del seu entorn ja que no disposa de paret cel•lular. La hipòtesi sobre la qual s’ha desenvolupat el treball és la possibilitat que aquests glicolípids i els enzims encarregats de la seva producció, les glicosiltransferases, siguin essencials per a la viabilitat del micoplasma i per tant, la seva inhibició sigui una forma d’eradicar les infeccions causades pel patògen. De les tres seqüències classificades com a glicosiltrasferases en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 i mg517, s’ha determinat que mg025 és l’únic dels tres gens que no és essencial per al bacteri, tot i que s’ha observat que els tres s’expressen tant a la fase exponencial com a la fase estacionària del seu creixement. La funció de mg025 i mg060 és encara desconeguda, mentre que mg517 és la glicosiltransferasa encarregada de la síntesi dels dos principals glicolípids del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) i el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En aquesta tesi s’ha desenvolupat un protocol d’expressió per a la glicosiltransferasa codificada per mg517, anomenada GT-MG517, el qual fa ús d’una coexpressió amb xaperones i solubilitza la proteïna amb detergents, glicerol i una elevada força iònica. Aquesta metodologia ha estat necessària ja que GT-MG517 és una proteïna associada a membrana i la seva expressió recombinant en E.coli presenta dificultats. La proteïna s’ha purificat mitjançant cromatografia d’afinitat per Ni, tot i que el grau de puresa assolit no ha estat suficient per a intentar la seva cristal•lització. Les diverses proves realitzades usant cromatografia d’exclusió molecular han permès determinar que GT-MG517 forma oligòmers d’alt pes molecular. A partir de la proteïna purificada s’ha realitzat un estudi cinètic de la seva doble activitat glicosildiacilglicerolsintasa. D’aquest estudi s’extreu que GT-MG517 pot transferir un sucre, Glc o Gal, a una molècula principalment hidrofòbica, com és el DOG, i a una molècula molt més hidrofílica, com el MGlcDG. Ambdós compostos però posseeixen un alcohol primari sobre el qual té lloc la transferència creant l’enllaç (16). Amb qualsevol dels substrats acceptors provats, l’enzim presenta activitats específiques superiors si el substrat donador és UDP-Gal. L’acceptor preferit de GT-MG517 és el lípid DOG, però la glicosiltransferasa és capaç d’elongar, ja sigui amb una Glc o amb una Gal, glicolípids com el MGlcDG i el MGDEG, preferint en aquest cas el compost amb una Gal a l’extrem no reductor. Tot i això, l’afinitat de l’enzim és superior per a donadors amb Glc (KM inferiors a les dels donadors amb Gal). D’altra banda, s’ha demostrat que el lípid aniònic DOPG es comporta com a activador de l’activitat enzimática. GT-MG517 posseeix un teòric domini d’unió d’UDP-Glc a l’extrem N-terminal. Aquesta zona presenta similitud de seqüència amb altres glicosiltransferases i permet la classificació de GT-MG517 dins de la família GT-2. En canvi, el seu extrem C-terminal presenta una seqüència particular que no s’alinea amb altres proteïnes. En aquesta tesi es formula la hipòtesi que aquesta zona podria ser d’interacció amb la membrana i, a més, que aquesta interacció podria regular l’activitat enzimàtica. Per això es preparen diverses formes truncades de GT-MG517, en les quals s’eliminen alguns aminoàcids de l’extrem C-terminal, i una forma en la qual només es conserva l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc. Aquestes noves proteïnes s’expressen, solubilitzen i purifiquen aplicant el protocol establert per a la forma completa. Amb l’anàlisi dels glicolípids sintetitzats s’estableix que els deu últims aminoàcids de GT-MG517 són prescindibles per a la seva activitat, ja que les formes truncades corresponents continuen tenint la capacitat de sintetitzar glicolípids. No obstant, l’eliminació d’un nombre superior de residus, inactiva la proteïna. La purificació de l’hipotètic domini d’unió d’UDP-Glc posa de manifest que forma oligòmers, de la mateixa forma que ho fa la proteïna completa. / Esta tesis se centra en el estudio de las posibles glicosiltransferasas de Mycoplasma genitalium involucradas en la síntesis de glicolípidos. Estas moléculas constituyen parte de la membrana plasmática del miroorganismo, única estructura de protección frente al entorno ya que los micoplasmas carecen de pared celular. La hipótesis sobre la cual se ha desarrollado el trabajo es la posibilidad que los mencionados glicolípidos y las enzimas encargadas de su producción, las glicosiltransferasas, sean esenciales para la viabilidad del micoplasma y, por tanto, su inhibición sea una forma de erradicar las infecciones causadas por el patógeno. De las tres secuencias clasificadas como glicosiltransferasas en el genoma de Mycoplasma genitalium, mg025, mg060 y mg517, se determinó que mg025 es el único de los tres genes que no es esencial para la bacteria, aunque se observó que los tres se expresan tanto en la fase exponencial como en la fase estacionaria de su crecimiento. Se desconoce todavía la función de mg025 y mg060. En cambio, se conoce que mg517 es la glicosiltransferasa responsable de la síntesis de los dos principales glicolípidos del micoplasma, el monoglicosildiacilglicerol (MGlcDG) y el diglicosildiacilglicerol (DGlcDG). En esta tesis se desarrolló un protocolo de expresión para la glicosiltransferasa codificada por mg517, llamada GT-MG517, el cual emplea una coexpresión con chaperonas y solubiliza la proteína con detergentes, glicerol y una fuerza iónica elevada. Dicha metodología fue necesaria ya que GT-MG517 es una proteína asociada a membrana y su expresión recombinante en E.coli presenta dificultades. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad por Ni pero el grado de pureza obtenido no fue suficiente para intentar su cristalización. Distintas pruebas realizadas usando cromatografía d’exclusión molecular permitieron determinar que GT-MG517 forma oligómeros de alto peso molecular. Con la proteína purificada se realizó un estudio cinético de su doble actividad glicosildiacilglicerolsintasa. De este estudio se extrae que GT-MG517 puede transferir un azúcar, Glc o Gal, a una molécula principalmente hidrofóbica, como es el DOG, y a una molécula mucho más hidrofílica, como el MGlcDG. Pese a su diferencia, los dos compuestos poseen un alcohol primario sobre el que tiene lugar la transferencia creándose el enlace (16). Con cualquiera de los sustratos aceptores probados, la enzima presenta actividades específicas superiores si el sustrato dador es UDP-Gal. El aceptor preferido de GT-MG517 es el lípido DOG, aunque la glicosiltransferasa es capaz de elongar, ya sea con una Glc o con una Gal, glicolípidos como el MGlcDG y el MGDEG, prefiriendo en este caso el compuesto con una Gal en el extremo no reductor. Aún así, la afinidad de la enzima es superior para dadores con Glc (KM inferiores a las de los dadores con Gal). Por otro lado, se demostró que el lípido aniónico DOPG se comporta como activador de la actividad enzimática. GT-MG517 posee un dominio teórico de unión de UDP-Glc en su extremo N-terminal. Esta zona presenta similitud de secuencia con otras glicosiltransferasas y permite la clasificación de GT-MG517 dentro de la familia GT-2. En cambio, su extremo C-terminal presenta una secuencia particular que no se alinea con otras proteínas. En esta tesis se formula la hipótesis que dicha zona podría ser de interacción con la membrana y, además, que dicha interacción podría regular la actividad enzimática. Por eso se prepararon distintas formas trucadas de GT-MG517, en las cuales se eliminaron algunos aminoácidos del extremo C-terminal, y una forma en la cual sólo se conservó el hipotético dominio de unión de UDP-Glc. Las nuevas proteínas se expresaron, solubilizaron y purificaron aplicando el protocolo establecido para la forma completa. Con el análisis de los glicolípidos sintetizados se determinó que los diez últimos aminoácidos de GT-MG517 eran prescindibles para su actividad, ya que las correspondientes formas truncadas conservaban su capacidad de sintetizar glicolípidos. No obstante, la eliminación de un número superior de residuos inactiva la proteína. La purificación del hipotético dominio de unión de UDP puso de manifiesto que forma oligómeros, de la misma forma en que lo hace la proteína completa. / This thesis is focused on the glycolipid producing glycosyltransferases from Mycoplasma genitalium. Glycolipids are part of the microorganism plasma membrane, which is the external covering of mycoplasmas since they lack a cell wall. Our working hypothesis is that glycolipids and the enzymes responsible for their production are essential to mycoplasma. Thus, glycosyltransferase inhibition could be a way to eradicate this pathogen caused infections. There are three genes described as putative glycosyltransferases in Mycoplasma genitalium genome, mg025, mg060 and mg517. We determined that mg025 is the only one essential to the bacteria, although the three of them are expressed both during the exponential and stationary growth phases. The function of mg025 and mg060 still remains unknown, whereas mg517 codifies for the glycosyltransferase responsible for monoglycosyldiacylglycerol (MGlcDG) and diglycosyldiacylglycerol (DGlcDG) synthesis, main mycoplasma glycolipids. In this work an expression protocol for mg517 codified glycosyltransferase was designed. The protocol included chaperone coexpression and protein solubilization with detergents, glycerol and high ionic strength. This methodology was necessary since GT-MG517 is a membrane associated protein and its recombinant expression in E.coli presents some difficulties. GT-MG517 was purified by Ni affinity chromatography. However, a suitable purity degree to attempt protein crystallization was not achieved. Some experiments using size exclusion chromatography revealed that GT-MG517 forms high molecular weight oligomers. A kinetic study of the protein double glycosyldiacylglycerol synthase activity was performed. From this study we learned that GT-MG517 is able to transfer a sugar moiety, Glc or Gal, both to a hydrophobic molecule such as DOG or to a more hydrophilic compound such as MGlcDG. These acceptor substrates share a primary alcohol where the sugar transfer takes place forming a (16) bond. The enzyme presents higher specific activities when UDP-Gal acts as reaction donor, regardless of the acceptor tested. DOG is the preferred acceptor although the enzyme is able to transfer Glc or Gal moieties to glycolipids such as MGlcDG and MGDEG. In this case, the reaction is faster with acceptors with Gal in the non-reducing end. As for donor substrate, enzyme’s affinity is higher for Glc containing molecules, with lower KM values than for Gal donors. In addition, our study proved the anionic lipid DOPG to act as an enzymatic activity enhancer. GT-MG517 has a putative binding domain for UDP-Glc in the N-terminal end. This sequence is similar to other glycosyltransferases and allows its classification in Cazy’s GT-2 family. On the contrary, the C-terminal end has a particular sequence which does not match up with any other protein. Our hypothesis was that this C-terminal end of GT-MG517 could contain a membrane interaction sequence, which could at the same time modulate enzymatic activity. To test this hypothesis some truncated forms of GT-MG517, where C-terminal aminoacids had been removed, were prepared. Moreover, a form where only the putative UDP-Glc binding domain was conserved was also expressed. All these proteins were expressed, solubilized and purified with the same protocol used for the full-length form of GT-MG517. Glycolipids produced by truncated forms were analysed and results implied that the last ten aminoacids were not involved in the enzyme’s activity. Elimination of a higher number of aminoacids caused protein inactivation. When the putative UDP-binding domain was purified, it showed high molecular weight oligomers such as those developed by the complete form of the protein.