O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-02. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:03Z : No. of bitstreams: 1 000843824.pdf: 1134206 bytes, checksum: 7e50793b27d7dcb24fe0acd95bbbd5df (MD5) / Poucos são os trabalhos de pesquisa em que probióticos e ácidos orgânicos são testados sinergicamente. Para tanto, conduziu-se um experimento utilizando 900 pintos de corte machos da linhagem Cobb, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2+1 (suplementação ou não de probiótico), (suplementação ou não de ácidos orgânicos) e (ração basal com inclusão de antibiótico e anticoccidiano). As aves foram desafiadas com Eimeria acervulina, E. máxima e E. tenella. Os dados de desempenho foram avaliados nos períodos de 1-7, 1-10, 1-14, 1-21 e 1-42 dias, sendo que o antibiótico mostrou-se eficiente em quase todas as fases. Os efeitos do probiótico e dos ácidos orgânicos no desempenho foram pouco conclusivos e o mesmo aconteceu para as características morfométricas avaliadas. Quase não foi notado o efeito sinérgico esperado pela interação entre o probiótico e os ácidos orgânicos. O probiótico aumentou a contagem de bactérias anaeróbias no intestino delgado aos 14 dias enquanto o antibiótico reduziu a contagem das mesmas no mesmo período. O peso relativo e o comprimento do intestino delgado foram menores na presença do antibiótico aos 21 dias, assim como, as características morfometricas avaliadas na mesma idade também diminuíram. Porém, aos 42 dias o efeito sobre o peso relativo, comprimento e morfometria do intestino não diferiram para nenhum dos aditivos testados. Diante do desafio experimental imposto, o probiótico e os ácidos orgânicos mostraram-se pouco eficientes no que se diz respeito à substituição dos antibióticos como melhoradores de desempenho / There are few researches in which probiotics and organic acids are tested synergistically. To this end, we conducted an experiment using 900 broiler chicks males of Cobb, distributed in a completely randomized design in a factorial 2x2 + 1 (supplemented or not with probiotic), (supplemented or not with organic acids) and (basal diet with antibiotic and anticoccidial inclusion). The broilers were challenged with Eimeria acervulina, E. maxima and E. tenella. The performance data were evaluated at periods of 1-7, 1-10, 1-14, 1-21 and 1-42 days, and the antibiotic was efficient in almost every phase. The effects of probiotic and organic acids in the performance were inconclusive and the same happened for the evaluated morphometric characteristics. It was hardly noticed the synergic effect expected by the interaction between the probiotic and organic acids. The probiotic increased the count of anaerobic bacteria in the small intestine after 14 days while the antibiotic reduced the count in the same period. The relative weight and the length of the small intestine were lower in the presence of the antibiotic at 21 days, as well as the morphometric characteristics evaluated in the same age also decreased. However, at the 42° day the effect on the relative size, length and morphology of the intestine did not differ for any of the tested additives. In front of imposed experimental challenge, probiotic and organic acids shown to be inefficient as it concerns the replacement of antibiotics as performance enhancers

A ema (Rhea americana) é uma ave silvestre que habita o sudeste da América do Sul e tem sido criada em fazendas pela sua carne e penas. O comércio de carne de emas só é permitido de animais provenientes de criadouros comerciais regularizados junto ao IBAMA e abatido em frigoríficos legalizados. A presente tese teve como objetivo a pesquisa de Salmonella sp. em materiais oriundos de emas abatidas no Rio Grande do Sul. Coletaram-se um total de 70 aves aleatoriamente dentro de seis lotes distintos respeitando um mínimo de 10% do lote, no período de setembro a outubro de 2004. De todas as aves eram amostrados o conteúdo cecal e fígado para a detecção de Salmonella. De 26 aves, coletaram-se, ainda, suabe cloacal. Além disso, sangue de todas as 70 aves para exames sorológicos. Foram realizados para a pesquisa de Salmonela sp. exames bacteriológicos, de reação em cadeia da polimerase e sorológicos. Os resultados foram apresentados em cinco trabalhos distintos. No primeiro, se preconizou a padronização da técnica de sorologia rápida em soro de suíno utilizando-se uma amostra de S. Typhimurium isolada de ema, para a posterior utilização desta técnica nos soros coletados neste experimento. Foram testadas 60 amostras de soro suíno, sendo 30 sororreagentes e 30 não-reagentes no teste padrão de ELISA. Com o soro não diluído, determinou-se que a SAR exibiu sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo iguais a 96,7%, demonstrando que a soroaglutinação rápida, usando como antígeno Salmonella Typhimurium, é um teste de triagem eficaz para a detecção de anticorpos contra este patógeno em soro de suínos, apresentando alta sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo O segundo trabalho teve como objetivo identificar animais portadores de Salmonella sp. a partir de amostras de fígado, conteúdo cecal e suabe cloacal de emas (Rhea americana) ao abate e comparar o método bacteriológico padrão (MBP) com a soroaglutinaçao rápida utilizando S. Typhimurium como antígeno. Verificou-se isolamento de Salmonella sp. em 66 (94,2%) aves, sendo 60 (85,7%) em amostras de fígado, 42 (60%) em conteúdo cecal e 11 (42,3%) em suabe cloacal. Das 114 linhagens de salmonelas isoladas, identificaram-se 19 (16,6%) como S. enterica enterica rugosa, 41 (35,9%) como S. Typhimurium, 53 (46,5%) como S. Newport e uma amostra (0,9%) como S. Anatum. O terceiro trabalho relatou a detecção de Salmonella Anatum em uma amostra de fígado de ema. O quarto comparou o método bacteriológico para isolamento de Salmonella sp. e a reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos demonstraram que a PCR detectou Salmonella sp. em um maior número de amostras provenientes de emas (Rhea americana) do que o MBP, concordando com resultados encontrados em outras espécies. Finalmente, no quinto estudo foi avaliada a resistência a antimicrobianos de 64 amostras de Salmonella Typhimurium isoladas. Observou-se resistência contra sulfonamida (73,44%), ácido nalidíxico (1,56%) e cefaclor (1,56%). Salienta-se o ineditismo dos trabalhos apresentados devido à pouca bibliografia na área de sanidade da produção de emas. / Greater Rhea (Rhea americana) is a southern South American native wild bird, which is breed in captivity for its feathers and meat. Commercialization of the Greater Rhea's meat is only allowed of animals deriving from commercial breeders who are regulated by IBAMA and slaughtered at legalized slaughterhouses. This thesis aims to research the Salmonella sp. presence in greater rhea samples in the Rio Grande Do Sul. We randomically collected 70 birds of 6 different flocks, respecting a minimum of 10% of the flock, in the period from September to October of 2004. All birds had liver and cecal material collected to Salmonella detection. Of 26 birds we collected cloacal swab. Moreover, we collected blood samples of 70 birds to serological exams. Bacteriological, serological and polymerase chain reaction (PCR) exams are made to research Salmonela sp. the results are presented in five different papers. At first paper, we standardize a RA test to detect anti-Salmonella antibodies from serum. We tested 60 samples of swine serum which were previously shown to be positive (30) and negative (30) to S. Typhimurium when tested with ELISA. The results show that the RA had sensitivity, specificity, predictive positive value and predictive negative value equal to 96.7% when used with non-diluted serum. Thus, this test can be applied to detect antibodies against S. Typhimurium in serum. The 2th paper, aims to identify Salmonella's reservoirs animals, using Greater Rhea (Rhea americana) liver samples, cecal material and cloacal swab, collected at slaughterhouse and to compare the rapid serum-agluttination method using S. Typhimurium antigen and the microbiological standard method (MSM). We detected Salmonella sp. at 66 (94.2%) birds, of this 60 (85.7%) in the liver, 42 (605) in the material cecal and 11 (42.3%) in the cloacal swab. Of the 114 Salmonella strains, we identify 19 (16.6%) to S. enterica enterica rough, 41 (35.9%) to S. Typhimurium, 53 (46.5%) to S. Newport e one sample (0.9%) to S. Anatum. All birds were serum non-reactives at RSA, but 37 were serum reactives at RSA-ST. The 3th paper reported the Salmonella Anatum detection in the greater rhea liver. The 4th paper, aims to compare a polymerase chain reaction (PCR) protocol to a standard microbiological technique (SMT) in the generic detection of Salmonella in liver, cecal material and cloacal swab of Greater Rheas samples. The present report demonstrates that the PCR technique can detect a higher number of Salmonella sp. positive samples in Greater Rhea when compared to the SMT, which agrees with previous results from other species. Finally, the 5th paper shows the resistance pattern of Salmonella sp. colonies. Salmonella-like colonies were serologically typed. We observed resistance against sulfonamide (73.4%), nalidixic acid (1.56%) and cefacloer (1.56%). As far we concerned there are no other thesis in the same subject.

Orientador: Valquíria Cação Cruz-Polycarpo / Banca: Antonio Carlos de Laurentiz / Banca: Ricardo de Albuquerque / Resumo: Poucos são os trabalhos de pesquisa em que probióticos e ácidos orgânicos são testados sinergicamente. Para tanto, conduziu-se um experimento utilizando 900 pintos de corte machos da linhagem Cobb, distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x2+1 (suplementação ou não de probiótico), (suplementação ou não de ácidos orgânicos) e (ração basal com inclusão de antibiótico e anticoccidiano). As aves foram desafiadas com Eimeria acervulina, E. máxima e E. tenella. Os dados de desempenho foram avaliados nos períodos de 1-7, 1-10, 1-14, 1-21 e 1-42 dias, sendo que o antibiótico mostrou-se eficiente em quase todas as fases. Os efeitos do probiótico e dos ácidos orgânicos no desempenho foram pouco conclusivos e o mesmo aconteceu para as características morfométricas avaliadas. Quase não foi notado o efeito sinérgico esperado pela interação entre o probiótico e os ácidos orgânicos. O probiótico aumentou a contagem de bactérias anaeróbias no intestino delgado aos 14 dias enquanto o antibiótico reduziu a contagem das mesmas no mesmo período. O peso relativo e o comprimento do intestino delgado foram menores na presença do antibiótico aos 21 dias, assim como, as características morfometricas avaliadas na mesma idade também diminuíram. Porém, aos 42 dias o efeito sobre o peso relativo, comprimento e morfometria do intestino não diferiram para nenhum dos aditivos testados. Diante do desafio experimental imposto, o probiótico e os ácidos orgânicos mostraram-se pouco eficientes no que se diz respeito à substituição dos antibióticos como melhoradores de desempenho / Abstract: There are few researches in which probiotics and organic acids are tested synergistically. To this end, we conducted an experiment using 900 broiler chicks males of Cobb, distributed in a completely randomized design in a factorial 2x2 + 1 (supplemented or not with probiotic), (supplemented or not with organic acids) and (basal diet with antibiotic and anticoccidial inclusion). The broilers were challenged with Eimeria acervulina, E. maxima and E. tenella. The performance data were evaluated at periods of 1-7, 1-10, 1-14, 1-21 and 1-42 days, and the antibiotic was efficient in almost every phase. The effects of probiotic and organic acids in the performance were inconclusive and the same happened for the evaluated morphometric characteristics. It was hardly noticed the synergic effect expected by the interaction between the probiotic and organic acids. The probiotic increased the count of anaerobic bacteria in the small intestine after 14 days while the antibiotic reduced the count in the same period. The relative weight and the length of the small intestine were lower in the presence of the antibiotic at 21 days, as well as the morphometric characteristics evaluated in the same age also decreased. However, at the 42° day the effect on the relative size, length and morphology of the intestine did not differ for any of the tested additives. In front of imposed experimental challenge, probiotic and organic acids shown to be inefficient as it concerns the replacement of antibiotics as performance enhancers / Mestre

O alfaherpesvírus bubalino 1 (BuHV1) e os alfaherpesvírus bovinos 1 (BoHV1), 5 (BoHV5) e são membros da ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, gênero Varicellovirus. O BoHV1 e o BoHV5 são subdivididos em subtipos (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). No Brasil circulam BoHV1 e BoHV5 de todos os subtipos até o presente reconhecidos. Em vista dessa variedade de alfaherpesvírus potencialmente infecciosos para bovinos e bubalinos, o conhecimento sobre estes agentes é essencial para a implementação de medidas de controle ou erradicação. Com o objetivo de permitir algumas comparações entre estes agentes e as respostas por eles induzidas em seus hospedeiros, primeiramente foi realizado o sequenciamento do genoma completo de uma amostra de BuHV1 (b6), isolada a partir de prepúcio de búfalos (Bubalus bubalis) em 1972, na Austrália. O objetivo foi disponibilizar a primeira sequência completa de um alfaherpesvírus bubalino e avaliar o grau de similaridade entre o genoma desse vírus e os alfaherpesvírus de bovinos. O genoma sequenciado compreende 137.452 pares de bases (pb), com um nível de similaridade nucleotídica de 92,2% com BoHV5 (SV507/99) e 76,7% com BoHV1 (NVSL). Estes resultados permitirão estudos futuros buscando reconstruir a história evolutiva destes vírus, a importância de infecções interespécies na geração de variantes destes agentes e possíveis associações entre tais infecções e patogenicidade. Na segunda etapa dos estudos, foram realizados diversos testes sorológicos buscando definir uma metodologia de diagnóstico adequada para a identificação de anticorpos contra BuHV1 e todos os diferentes subtipos de BoHV1 e BoHV5. Inicialmente, 600 amostras de soros de bovinos de campo foram testadas através do teste de soroneutralização (SN), realizada frente aos sete alfaherpesvírus em estudo. Os resultados da SN foram influenciados pela escolha do vírus desafio utilizado no ensaio. Para obter a sensibilidade máxima do teste (259/600), foi necessário combinar resultados positivos frente a pelo menos cinco diferentes amostras virais. Em seguida, foram preparados ensaios do tipo “ELISA” para detecção de anticorpos utilizando antígenos preparados com cada um dos diferentes tipos/subtipos desses vírus (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individualmente (chamado “single ELISA” ou “sAgELISA”). Os resultados obtidos foram comparados com os resultados da soroneutralização (SN). A sensibilidade do sAgELISA variou significativamente conforme a amostra viral utilizada no preparo dos antígenos. Considerando os resultados frente a apenas um antígeno, a maior sensibilidade foi de 96,1% (249/259), obtida com apenas uma amostra de BoHV5c. Foram necessários pelo menos seis antígenos (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) para atingir a sensibilidade máxima do teste (263/259). Assim, foi desenvolvido um ELISA combinando vários antígenos em um mesmo teste (chamado “multiple ELISA” ou “mAgELISA”). O mAgELISA detectou 263 amostras positivas, resultando em uma concordância ótima entre sAgELISA e mAgELISA (κ=0,99). Frente a SN, o mAgELISA apresentou uma sensibilidade de 96,5% e especificidade de 96,1% (κ=0,93; VPP=95,0%; VPN=97,3%). Essas diferenças não foram estatisticamente significativas. Os resultados obtidos com a SN e mAgELISA foram comparados também a um ELISA comercial para a detecção de anticorpos contra BoHV1. O ELISA comercial utilizado nas comparações não apresentou resultados significativamente diferentes dos demais testes realizados, no entanto, revelou o maior número de resultados discrepantes em relação ao SN, considerado padrão-ouro. Estes resultados revelam que o mAgELISA aqui relatado é adequado para a detecção de anticorpos para BuHV1, BoHV1 e BoHV5, com sensibilidade e especificidade significativamente comparáveis às da SN. / Bubaline alphaherpesvirus 1 (BuHV1), Bovine alphaherpesviruses 1 (BoHV1) and 5 (BoHV5) are members of the order Herpesvirales family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, genus Varicellovirus. The BoHV1 and BoHV5 are divided into subtypes (BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c). In Brazil, circulates BoHV 1 and BoHV 5 from all subtypes known to the present. In view of this variety of potentially infectious alphaherpesviruses for bovines and buffaloes, knowledge about these agents is essential for the implementation of control or eradication measures. In order to gain a deeper understanding about these agents and the responses induced by them in their hosts, initially, the complete genome sequence of BuHV1-b6, one of the first BuHV1 viruses isolated in Australia in 1972, is reported. The objective was to provide the first complete sequence of a buffalo alphaherpesvirus and to evaluate the degree of similarity between BuHV1 and bovine alphaherpesviruses genomes. The BuHV1-b6 genome is a linear double-stranded DNA molecule, 137,452 bp long, with overall sequence of the 92.2% similarity at the nucleotide level to the reference BoHV5 (SV507/99) strain and 76.7% with BoHV1 (NVSL) strain. These results are expected to be valuable for further studies involving evolutionary chain of these viruses, the interspecies infections importance in generation of variants and possible associations between such infections and pathogenicity. In the second stage of the study, several serological tests were performed in order to define a appropriate diagnostic methodology for the identification of antibodies against BuHV1 and all different subtypes of BoHV1 and BoHV5. Initially, 600 bovine field serum samples were screened in serum neutralization tests (SN) performed against all seven virus types/subtypes. The SN results were influenced by the choice of the challenge virus. The maximum number of positive sera (259/600) was detected by adding the positive results obtained with at least five different viruses. Seven enzyme linked immunoassays were prepared with each of the seven antigens (BuHV1; BoHV1.1, 1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c), individually (single antigen ELISAs; sAgELISAs). The results obtained were compared to the SN. The sensitivity of the sAgELISAs was also influenced by the choice of antigen. Considering the results against only one of them, the best sensitivity was 96.1% (249/259), obtained with BoHV5c. Maximum sAgELISA sensitivity (263/259) was achieved when positive results of at least six viruses (BuHV1; BoHV1.2a, 1.2b; BoHV5a, b, c) were combined. A multiple antigen ELISA (mAgELISA) was then prepared by combining of different viral antigens in the same test. The mAgELISA detected 263 positive samples, resulting an optimum concordance between sAgELISA and mAgELISA (κ=0.99). When compared to SN, the mAgELISA revealed 96.5% sensitivity and 96.1% specificity (κ=0.93; PPV=95.0%; NPV=97.3%). These differences were not statistically significant. The results of both SN and mAgELISA were compared to a commercially available (IBRgB) ELISA. The results of the commercial ELISA did not vary significantly in relation to others tests performed, however, revealed the highest number of discrepant results in relation to SN, taken as the gold standard. These results reveal that the mAgELISA reported here is suitable for the detection of antibodies to BuHV1, BoHV1 and BoHV5 with sensitivity and specificity significantly comparable to those of SN.

A ema (Rhea americana) é uma ave silvestre que habita o sudeste da América do Sul e tem sido criada em fazendas pela sua carne e penas. O comércio de carne de emas só é permitido de animais provenientes de criadouros comerciais regularizados junto ao IBAMA e abatido em frigoríficos legalizados. A presente tese teve como objetivo a pesquisa de Salmonella sp. em materiais oriundos de emas abatidas no Rio Grande do Sul. Coletaram-se um total de 70 aves aleatoriamente dentro de seis lotes distintos respeitando um mínimo de 10% do lote, no período de setembro a outubro de 2004. De todas as aves eram amostrados o conteúdo cecal e fígado para a detecção de Salmonella. De 26 aves, coletaram-se, ainda, suabe cloacal. Além disso, sangue de todas as 70 aves para exames sorológicos. Foram realizados para a pesquisa de Salmonela sp. exames bacteriológicos, de reação em cadeia da polimerase e sorológicos. Os resultados foram apresentados em cinco trabalhos distintos. No primeiro, se preconizou a padronização da técnica de sorologia rápida em soro de suíno utilizando-se uma amostra de S. Typhimurium isolada de ema, para a posterior utilização desta técnica nos soros coletados neste experimento. Foram testadas 60 amostras de soro suíno, sendo 30 sororreagentes e 30 não-reagentes no teste padrão de ELISA. Com o soro não diluído, determinou-se que a SAR exibiu sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo iguais a 96,7%, demonstrando que a soroaglutinação rápida, usando como antígeno Salmonella Typhimurium, é um teste de triagem eficaz para a detecção de anticorpos contra este patógeno em soro de suínos, apresentando alta sensibilidade, especificidade e valor preditivo positivo O segundo trabalho teve como objetivo identificar animais portadores de Salmonella sp. a partir de amostras de fígado, conteúdo cecal e suabe cloacal de emas (Rhea americana) ao abate e comparar o método bacteriológico padrão (MBP) com a soroaglutinaçao rápida utilizando S. Typhimurium como antígeno. Verificou-se isolamento de Salmonella sp. em 66 (94,2%) aves, sendo 60 (85,7%) em amostras de fígado, 42 (60%) em conteúdo cecal e 11 (42,3%) em suabe cloacal. Das 114 linhagens de salmonelas isoladas, identificaram-se 19 (16,6%) como S. enterica enterica rugosa, 41 (35,9%) como S. Typhimurium, 53 (46,5%) como S. Newport e uma amostra (0,9%) como S. Anatum. O terceiro trabalho relatou a detecção de Salmonella Anatum em uma amostra de fígado de ema. O quarto comparou o método bacteriológico para isolamento de Salmonella sp. e a reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos demonstraram que a PCR detectou Salmonella sp. em um maior número de amostras provenientes de emas (Rhea americana) do que o MBP, concordando com resultados encontrados em outras espécies. Finalmente, no quinto estudo foi avaliada a resistência a antimicrobianos de 64 amostras de Salmonella Typhimurium isoladas. Observou-se resistência contra sulfonamida (73,44%), ácido nalidíxico (1,56%) e cefaclor (1,56%). Salienta-se o ineditismo dos trabalhos apresentados devido à pouca bibliografia na área de sanidade da produção de emas. / Greater Rhea (Rhea americana) is a southern South American native wild bird, which is breed in captivity for its feathers and meat. Commercialization of the Greater Rhea's meat is only allowed of animals deriving from commercial breeders who are regulated by IBAMA and slaughtered at legalized slaughterhouses. This thesis aims to research the Salmonella sp. presence in greater rhea samples in the Rio Grande Do Sul. We randomically collected 70 birds of 6 different flocks, respecting a minimum of 10% of the flock, in the period from September to October of 2004. All birds had liver and cecal material collected to Salmonella detection. Of 26 birds we collected cloacal swab. Moreover, we collected blood samples of 70 birds to serological exams. Bacteriological, serological and polymerase chain reaction (PCR) exams are made to research Salmonela sp. the results are presented in five different papers. At first paper, we standardize a RA test to detect anti-Salmonella antibodies from serum. We tested 60 samples of swine serum which were previously shown to be positive (30) and negative (30) to S. Typhimurium when tested with ELISA. The results show that the RA had sensitivity, specificity, predictive positive value and predictive negative value equal to 96.7% when used with non-diluted serum. Thus, this test can be applied to detect antibodies against S. Typhimurium in serum. The 2th paper, aims to identify Salmonella's reservoirs animals, using Greater Rhea (Rhea americana) liver samples, cecal material and cloacal swab, collected at slaughterhouse and to compare the rapid serum-agluttination method using S. Typhimurium antigen and the microbiological standard method (MSM). We detected Salmonella sp. at 66 (94.2%) birds, of this 60 (85.7%) in the liver, 42 (605) in the material cecal and 11 (42.3%) in the cloacal swab. Of the 114 Salmonella strains, we identify 19 (16.6%) to S. enterica enterica rough, 41 (35.9%) to S. Typhimurium, 53 (46.5%) to S. Newport e one sample (0.9%) to S. Anatum. All birds were serum non-reactives at RSA, but 37 were serum reactives at RSA-ST. The 3th paper reported the Salmonella Anatum detection in the greater rhea liver. The 4th paper, aims to compare a polymerase chain reaction (PCR) protocol to a standard microbiological technique (SMT) in the generic detection of Salmonella in liver, cecal material and cloacal swab of Greater Rheas samples. The present report demonstrates that the PCR technique can detect a higher number of Salmonella sp. positive samples in Greater Rhea when compared to the SMT, which agrees with previous results from other species. Finally, the 5th paper shows the resistance pattern of Salmonella sp. colonies. Salmonella-like colonies were serologically typed. We observed resistance against sulfonamide (73.4%), nalidixic acid (1.56%) and cefacloer (1.56%). As far we concerned there are no other thesis in the same subject.

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em equinos, caninos e humanos. A secreção de enzimas por micro-organismos é considerada um fator importante na invasão tecidual. O presente estudo teve como objetivo analisar a atividade enzimática de isolados de P. insidiosum obtidos de lesões equinas (n=13), coelhos infectados experimentalmente (n=2) e uma amostra padrão (ATCC). Para isso, utilizou-se o kit comercial API ZYM. Zoósporos foram cultivados em caldo RPMI 1640 por 24h a 37 oC. Após esse período, a presença de hifas foi observada, as quais foram separadas e 65μl do líquido restante foram inoculados em cada um dos 20 poços (um controle e 19 com substratos específicos para cada enzima) do kit. As galerias foram então incubadas por 4 h a 37 oC. Os resultados foram obtidos através da leitura visual das reações. As análises foram feitas em triplicata e submetidas à análise de variância utilizando um nível de significância de 5%. Houve uma variação intraespecífica na atividade enzimática entre os isolados, sendo que enzimas dos grupos fosfohidrolases e éster hidrolases foram as mais prevalentes. Esses dados demonstram a capacidade de P. insidiosum em secretar enzimas que degradam substratos presentes em animais e em plantas, bem como a variabilidade enzimática entre os isolados. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenipila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. This study aimed at analyzing the enzymatic activity of P. insidiosum isolates obtained from equine lesions (n=13), experimentally infected rabbits (n=2) and a standard strain (ATCC 58637). To address this issue, the API ZYM commercial kit was used. Zoospores were cultivated in RPMI 1640 broth for 24 h at 37oC. After this period, the presence of hyphae was observed and they were carefully separated from the liquid phase. Then, 65 μl of this liquid were inoculated in each of the 20 microwells (one control, 19 containing specific substrates for each enzyme) of the API ZYM kit. The strips were incubated for 4h at 37oC. Results were obtained by visual observation of the reactions. The tests were carried out in triplicate and submitted to an analysis of variance using a significance level of 5%. An intraspecific variation among the enzymatic activities was observed among the isolates, where the group of phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among most of the isolates. Data here obtained highlighted the capacity of P. insidiosum in secreting enzymes capable of degrading substrates present in animals and plants, besides the enzymatic variability among the isolates.

Aspergilose é uma das principais causas de mortalidade em aves imunocompetentes e imunodeprimidas. A manifestação clínica aguda da doença é geralmente observada em aves jovens, com episódios de surtos em aviários, enquanto a forma crônica é mais frequentemente observada em aves adultas. A inspeção das carcaças é fundamental para a detecção e monitoramento da prevalência de doenças. Os objetivos do trabalho foram avaliar a ocorrência de aspergilose causada por Aspergillus fumigatus em aves comerciais através do diagnóstico micológico e histopatológico e verificar a possibilidade de associação causal entre os critérios de diagnóstico de aspergilose e condenação por aerossaculite em frangos de corte através de um estudo de casocontrole. O estudo foi realizado com 380 amostras pulmonares. Foram coletados pulmões de frangos condenados (95) por aerossaculite e não condenados (285), diretamente na linha de abate de um frigorífico. Quarenta e seis (12%) amostras de pulmão foram positivas na cultura micológica. Do total de amostras, 177 (46,6%) apresentaram alterações histopatológicas, sendo as mais frequentes pneumonia fibrinoheterofílica necrótica, pneumonia heterofílica e hiperplasia linfóide. Do total de 380 pulmões analisados, 30 (65,2%) apresentaram concomitantemente alterações histopatológicas e isolamento fúngico. A relação entre a presença de lesões histopatológicas e isolamento de A. fumigatus testada por McNemar indicou que houve associação significativa entre a presença de alterações histopatológicas e o isolamento de A. fumigatus. A identificação molecular foi realizada em 44 isolados, sendo todos confirmados como sendo A. fumigatus através dos genes b-tub e rodA. O cultivo micológico e o exame histopatológico aumentam as chances de se detectar alterações pulmonares em aves condenadas pelo Sistema de Inspeção Final do que nas aves normais, sugerindo que tais critérios de diagnóstico são eficazes para aprimorar a avaliação e condenação de aves por aerossaculite. O perfil genético entre os isolados foi variado, mostrando que isolados de aves normais podem ser potencialmente causadores de aspergilose em aves suceptíveis. / Aspergillosis is one of the main causes of mortality in both immunocompetent and immunodepressed birds. The clinical manifestation of acute aspergillosis is usually observed in young birds, often with episodes of outbreaks in poultry farms, whereas chronic aspergillosis is more frequently observed in adult birds. The inspection of carcasses is fundamental for the detection of diseases and for monitoring their prevalence. The objectives of this study were to evaluate the occurrence of aspergillosis caused by Aspergillus fumigatus in poultry through mycological and histopathological diagnosis and to verify the possibility of a causal association between the criteria for aspergillosis diagnosis and carcass condemnation due to airsacculitis in broilers through a case-control study. The study was made with 380 lung samples. Lungs were collected from condemned (95) and not condemned (285) broilers due to airsacculitis, directly from the slaughter line of a slaughterhouse. Forty-six (12%) lung samples were positives in mycological culture. From the total samples, 177 (46.6%) showed histopathological alterations, the most frequent being necrotic, fibrinous, heterophilic pneumonia, heterophilic pneumonia and lymphoid hyperplasia. Of the 380 lungs analyzed, 30 (65.2%) showed histopathological alterations and isolation of fungi. The relation between the presence of histopathological lesions and the isolation of A. fumigatus, as observed with the McNemar test, indicated the significant association between the presence of histopathological alterations and the isolation of A. fumigatus.The molecular identification was made in 44 isolates, and all of them were confirmed to be A. fumigatus through analysis of the b-tub and rodA. The mycological cultivation and the histopathological test increase the chances of detecting pulmonary alterations in birds condemned by the Final Inspection System than in normal birds, suggesting that such diagnostic criteria are efficient to improve the assessment and condemnation of birds affected by airsacculitis. There were different genetic profiles among the isolates, which shows that isolates obtained from normal birds can potentially cause aspergillosis in those susceptible.

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Camila da Silva Frade / Resumo: Pertencente a família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae, o Herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), é o agente causal da meningoencefalite bovina não supurativa, que atinge majoritariamente bovinos jovens. No Brasil, os casos de encefalite por BoHV-5 são a segunda maior causa de óbitos no rebanho. A infecção viral geralmente resulta em alteração no processo de morte celular programada, pela via mitocondrial, estimulando ou inibindo genes relacionados à apoptose, favorecendo a replicação e disseminação viral. O presente estudo teve como objetivo a análise da expressão de genes relacionados à apoptose (Apaf-1, α, FasL e citocromo c) em células MDBK infectadas ou não com o BoHV-5. Foi possível observar um aumento (p<0,05) na expressão dos genes estudados para o grupo infectado comparado ao controle, em diferentes momentos pós-infecção experimental. No caso da família Herpesviridae, a modulação da apoptose parecer ser uma etapa chave para sua patogênese, apesar da associação das atividades anti e pró-apoptóticas com o BoHV-5 ser completamente desconhecida. Este estudo demonstra a capacidade do BoHV-5 em modular, seja ativando ou inibindo, a via extrínseca da apoptose / Abstract: Belonging to the family Herpesviridae, subfamily Alphaherpesvirinae, bovine Herpesvirus type 5 ( BoHV-5) is the causative agent of bovine non-suppurative meningoencephalitis, which predominantly affects young cattle. In Brazil, cases of encephalitis caused by BoHV-5 are the second leading cause of deaths in the herd. Viral infection usually results in a change in the programmed cell death via mitochondrial, stimulating or inhibiting apoptosis related genes, promoting viral replication and dissemination process. The present study aimed to analyze the expression of apoptosis related genes (Apaf-1, TNFα-R1, FasL and cytochrome c) in infected or uninfected MDBK cells with BoHV-5. We observed an increase ( p < 0.05 ) in expression of the genes studied for the infected group compared with controls, in different times post-infection experimental. In the case of the Herpesviridae family, modulation of apoptosis appears to be a key step in its pathogenesis, despite the association of anti and pro-apoptotic activities with BoHV-5 is completely unknown. This study demonstrates the ability of BoHV-5 in modulating either activating or inhibiting the extrinsic pathway of apoptosis / Mestre

Pythium insidiosum, classificado no Reino Stramenipila e Classe Oomycetes, é o agente etiológico da pitiose, uma doença diagnosticada principalmente em equinos, caninos e humanos. A secreção de enzimas por micro-organismos é considerada um fator importante na invasão tecidual. O presente estudo teve como objetivo analisar a atividade enzimática de isolados de P. insidiosum obtidos de lesões equinas (n=13), coelhos infectados experimentalmente (n=2) e uma amostra padrão (ATCC). Para isso, utilizou-se o kit comercial API ZYM. Zoósporos foram cultivados em caldo RPMI 1640 por 24h a 37 oC. Após esse período, a presença de hifas foi observada, as quais foram separadas e 65μl do líquido restante foram inoculados em cada um dos 20 poços (um controle e 19 com substratos específicos para cada enzima) do kit. As galerias foram então incubadas por 4 h a 37 oC. Os resultados foram obtidos através da leitura visual das reações. As análises foram feitas em triplicata e submetidas à análise de variância utilizando um nível de significância de 5%. Houve uma variação intraespecífica na atividade enzimática entre os isolados, sendo que enzimas dos grupos fosfohidrolases e éster hidrolases foram as mais prevalentes. Esses dados demonstram a capacidade de P. insidiosum em secretar enzimas que degradam substratos presentes em animais e em plantas, bem como a variabilidade enzimática entre os isolados. / Pythium insidiosum is classified in the kingdom Stramenipila, class Oomycetes. It causes pythiosis, a disease mainly diagnosed in horses, dogs, and humans. This study aimed at analyzing the enzymatic activity of P. insidiosum isolates obtained from equine lesions (n=13), experimentally infected rabbits (n=2) and a standard strain (ATCC 58637). To address this issue, the API ZYM commercial kit was used. Zoospores were cultivated in RPMI 1640 broth for 24 h at 37oC. After this period, the presence of hyphae was observed and they were carefully separated from the liquid phase. Then, 65 μl of this liquid were inoculated in each of the 20 microwells (one control, 19 containing specific substrates for each enzyme) of the API ZYM kit. The strips were incubated for 4h at 37oC. Results were obtained by visual observation of the reactions. The tests were carried out in triplicate and submitted to an analysis of variance using a significance level of 5%. An intraspecific variation among the enzymatic activities was observed among the isolates, where the group of phosphohydrolases and ester hydrolases were conspicuous among most of the isolates. Data here obtained highlighted the capacity of P. insidiosum in secreting enzymes capable of degrading substrates present in animals and plants, besides the enzymatic variability among the isolates.