Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-10-28T19:04:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Miguel Garcia Cardoso - 2014.pdf: 3179587 bytes, checksum: 5d358a40aa90ef1768cbb11668a1a1db (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-29T10:25:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Miguel Garcia Cardoso - 2014.pdf: 3179587 bytes, checksum: 5d358a40aa90ef1768cbb11668a1a1db (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T10:25:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Thiago Miguel Garcia Cardoso - 2014.pdf: 3179587 bytes, checksum: 5d358a40aa90ef1768cbb11668a1a1db (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-12-12 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / This current study describes the development of alternative technologies for the fabrication of microfluidic paper-based analytical devices (μPADs). The first technology refers to the manufacturing of a metal stamp for rapid prototyping of μPADs. Basically, the method uses the heating process to transfer wax to the paper surface. The wax is required to create a hydrophobic barriers thus delimiting microfluidic channels for the fluid transport through lateral flow effect. Some remarkable advantages of the metal stamping process include robustness, portability and simplicity. Paraffin is a hydrophobic and thermoplastic material that can be easily molded. Furthermore, it shows high chemical resistance when exposed to different aqueous and organic solutions. The stamping-based technology allows the fabrication of μPADs at very low cost. The proposed approach exhibited great reproducibility. The relative standard deviation (RSD) for the channel widths measured on 50 independent μPADs revealed a value of 3.5%. The analytical performance of the paper-based device associated with colorimetric detection was tested for the nitrite analysis in clinical, food and environmental samples. The limit of detection (LD) nitrite assays without preconcentration was 11.3 μM. In order to access the nitrite concentration in environmental samples, a preconcentration method was developed allowing to achieve a LD of 5.6 μM. The results obtained were compared to the spectrophotometric technique and the statistical test demonstrated no significant difference between both methodologies. The stamping process have demonstrated high potential to produce μPADs in laboratories with none or minimal instrumentation. Besides the stamping process, another fabrication approach based on the spraying of white glue mixed with a sensitizing agent was also proposed to produce μPADs. To create effective hydrophobic barriers, the white glue was first sprayed on the paper surface though a magnetic mask. Afterwards, the device was exposed to visible light for polymerization of the glue. In order to evaluate the fabrication methodology, 25 devices were produced and the RSD value achieved for the channel widths was 5.7%. The analytical feasibility of the μPADs fabricated with white glue was successfully demonstrated for qualitative assays dedicated to urinalysis (glucose, uric acid, nitrite, pH, BSA, urea, ketones bodies and bilirubin) and pancreatitis assay (amylase and lipase). Both alternative methods based on stamping and spraying has exhibited great potential to be used for production in mass. Moreover, the proposed devices revealed high potential to be broadly explored in biological/clinical, food and environmental applications. / O presente trabalho descreve o desenvolvimento de tecnologias alternativas para fabricação de dispositivos microfluídicos em papel. A primeira tecnologia se refere à confecção de um carimbo metálico para prototipagem de dispositivos microfluídicos em papel. Basicamente, a metodologia baseiase na transferência de parafina para a superfície do papel por um processo de aquecimento. O uso da parafina faz-se necessário para criação da barreira hidrofóbica, no qual delimita canais microfluídicos para o transporte do fluido através do fluxo lateral. As vantagens em utilizar o carimbo estão entre a facilidade de manuseio, a robutez e a portabilidade. Em relação ao uso da parafina, destaca-se como sendo um agente hidrofóbico e termoplástico, que pode ser facilmente moldado, além de ser um material altamente resistente a diferentes compostos químicos. A combinação do uso desses dois materiais, carimbo e parafina, possibilitou a fabricação rápida e barata dos dispositivos microfluídicos à base de papel (μPADs). Para avaliar o desempenho do processo de carimbagem foram fabricados 50 dispositivos no qual o desvio padrão relativo (DPR) encontrado para a largura do canal foi de 3,5%. O desempenho analítico dos μPADs associado a detecção colorimétrica foi avaliado na análise de nitrito em amostras clínicas, alimentícias e ambientais. O limite de detecção da análise de nitrito sem etapa de pré-concentração foi de 11,3 μM, para a análise de amostras ambientais foi desenvolvido uma etapa de pré-concentração, onde foi obtido um limite de detecção de 5,6 μM. Os resultados obtidos foram comparados à técnica de espectrofotometria e o teste estatístico demonstrou que não existe diferença significativa entre os dois métodos. O método de carimbagem demonstrou potencialidade para fabricação dos μPADs em laboratórios com recursos limitados, pois exige um mínimo de instrumentação. Além do processo de carimbagem, uma outra metodologia, também de baixo custo, foi explorada para fabricação dos μPADs. Essa medologia consiste no jateamente de cola branca misturada a um agente sensibilizante serigráfico para fabricação da barreira hidrofóbica. Basicamente, o processo consiste em jatear essa mistura sobre o substrato de papel que foi fixada a uma máscara magnética. Após o jateamento, o dispositivo foi exposto à radiação visível para polimerização da cola e obtenção das barreiras hidrofóbicas. A reprodutibilidade da largura dos canais foi avaliado em 25 microdispositivos e DPR encontrado foi de 5,7%. A potencialidade dos μPADs fabricados por essa metodologia foi avaliada na aplicação em teste para urinálise (glicose, ácido úrico, bilirrubina, nitrito, pH, albumina, ureia e corpos cetônicos) e pancreatite (amilase e lipase). Os dois métodos alternativos de fabricação apresentaram-se viáveis para fabricação dos μPADs e com grande potencialidade para produção em escala industrial. Além disso, demonstraram-se aplicáveis para análise biológicas, alimentícias e ambientais.

O desenvolvimento de dispositivos microfluídicos biomiméticos, \"órgãos-em-chip\", tem permitido melhores respostas em ensaios que carecem de uma correlação fisiológica mais próxima da in vivo. Explorando as tecnologias da microfluídica e microfabricação, esses dispositivos recapitulam aspectos específicos de estruturas e funções dos órgãos. Ainda, os avanços obtidos em culturas tridimensionais de células, modelos de matrizes extracelulares e tecnologias direcionadas às células tronco, têm consolidado os órgãos-em-chip como uma ferramenta fundamental para a compreensão de diversas respostas biológicas do corpo humano frente às aplicações biomédicas, farmacêuticas, químicas e ambientais. Com os avanços da nanotecnologia e ciência dos materiais, inúmeros progressos têm sido alcançados na farmácia e na medicina. Devido à redução da escala, propriedades que se diferenciam substancialmente daquelas encontradas na escala macro são obtidas. As nanopartículas de dióxido de titânio (NPs TiO2) têm apresentado múltiplas aplicações na medicina e na indústria. Em vista disso, faz-se necessário a investigação dos efeitos tóxicos dessas nanopartículas, seja na saúde ou no meio ambiente. É bem documentado que as NPs TiO2 podem chegar à corrente sanguínea e alcançar vários órgãos, causando reações inflamatórias e interações celulares que podem ser patogenicamente relevantes. Assim, o presente trabalho propõe o estudo dos efeitos das NPs TiO2 em células endoteliais (HUVEC) cultivadas em um dispositivo microfluídico fabricado em poliéster-toner (PT), uma tecnologia simples que alia rapidez e baixo custo de produção. A viabilidade do uso dos microchips de PT foi avaliada por meio do teste MTT e produção de NO e verificou-se serem adequados para a cultura de células endoteliais. As células no sistema microfluídico foram expostas às NPs TiO2, e os resultados comparados a um sistema estático (placas de cultura de células) submetido às condições semelhantes. Os sobrenadantes de ambos os sistemas foram utilizados para determinação da produção de VEGF-A. Ademais, foram avaliadas a produção de aníon superóxido e a indução de apoptose. Os resultados esclarecem os mecanismos de toxicidade das NPs TiO2 e são correlacionados com as patologias que eventualmente estão associadas a esses efeitos. Por meio deste estudo, demonstrou-se o grande potencial dos microchips de PT para estudos em biologia celular, os quais podem fornecer a base para ensaios pré-clinicos com maior poder preditivo, alternativos ao uso de animais e cobaias na pesquisa científica. / The development of biomimetic microfluidic devices, \"organ-on-chips\", has allowed better responses in assays that need a closer in vivo physiological correlation. Exploring the technologies of microfluidics and microfabrication, these devices recapitulate specific aspects of structures and functions of the organs. In addition, the progress made in 3D cell cultures, extracellular matrix models, and stem cells technologies, have consolidated the organ-on-chips as a key tool for understanding various biological responses of the human body in face of biomedical, pharmaceutical, chemical, and environmental applications. With the advances in nanotechnology and materials science, much progress has been made in pharmacy and medicine. Due to the scale reduction, properties that differ substantially from those found on the macro scale are obtained. Titanium dioxide nanoparticles (TiO2 NPs) have found many applications in medicine and industry. In view of this fact, it is necessary to investigate the toxic effects of nanoparticles, either on health or in the environment. It has been well documented that TiO2 NPs can reach the bloodstream and affect various organs, causing inflammatory reactions and cellular interactions that can be pathogenetically relevant. Thus, this work proposes the study of the effects of TiO2 NPs in endothelial cells (HUVEC) cultured in a microfluidic device made of polyester toner (PT), a simple technology that combines speed and low cost of production. The viability of the use of PT microchips was evaluated by MTT assay and production of NO and we found that it is suitable for culturing of endothelial cells. The HUVEC in the microfluidic system were exposed to TiO2 NPs and the results compared to a static system (cell culture plates) subjected to similar conditions. Supernatants from both systems were used for determining the production of the VEGF-A. Furthermore, we have evaluated superoxide anion production and induction of apoptosis. The results clarify the mechanisms of toxicity of NPs TiO2 and are correlated with the pathologies that eventually are associated with these effects. Through this study, we demonstrated the great potential of PT microchips for studies in cell biology, which may provide the basis for pre-clinical trials with greater predictive power, alternative to the use of animals in scientific research.

Orientador: Lauro Tatsuo Kubota / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-24T12:03:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santhiago_Murilo_D.pdf: 3375339 bytes, checksum: 5d945dd23cfef732a3e3d083685bedc0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Neste trabalho descreve-se a construção e aplicação de dispositivos analíticos 2D e 3D à base de papel com detecção eletroquímica (ePAD). Os dispositivos foram construídos empregando o método de impressão com cera e diferentes tipos de papéis. Eletrodos de ouro foram utilizados juntamente com o conceito da separação cromatográfica em dispositivos microfluídicos. No canal microfluídico à base de papel foi possível realizar a separação de ácido ascórbico e dopamina em 14 minutos. A necessidade por processos de fabricação mais simples e de baixo custo nos motivou a estudar eletrodos de carbono em ePADs. Assim, eletrodos de grafite de lapiseira foram selecionados visando o desenvolvimento de um biossensor para glicose. O biossensor apresentou uma excelente resposta eletroquímica e um tempo de análise de 4 minutos. O mesmo eletrodo de grafite foi acoplado com um sistema de informação para determinação de p-nitrofenol. Assim, foi possível detectar 1,0 mmol L de p-nitrofenol em amostras de água e analisar/interpretar os resultados empregando um celular. Por fim, a necessidade por sistemas eletroquímicos com menores limites de detecção nos impulsionou a fabricar microeletrodos de pasta de carbono. Os microeletrodos foram fabricados em folhas de transparência e acoplados no papel empregando uma configuração do tipo sanduíche. Os dispositivos foram caracterizados eletroquimicamente na presença de cisteína e apresentaram uma constante cinética de 10 L mol s. Um limite de detecção de 4,8 mmol L para cisteína foi obtido empregando um arranjo de microeletrodos. Por fim, os microeletrodos de pasta de carbono foram utilizados para a construção de um biossensor visando a determinação de metil paration. O ePAD foi construído de modo a acomodar o substrato (acetiltiocolina) e a enzima (acetilcolinesterase) no mesmo dispositivo / Abstract: This thesis describes the construction and application of 2D and 3D electrochemical paper-based analytical devices (ePADs). The devices were constructed using the wax printing method and different types of papers. Gold electrodes were employed along with the concept of chromatographic separation in microfluidic devices. By using the paper-based microfluidic channel it was possible to perform the separation of ascorbic acid and dopamine in 14 minutes. The need for simpler and low cost manufacturing processes motivated us to study carbon electrodes in ePADs. Thus, pencil graphite electrodes were selected for the development of a biosensor for glucose. The biosensor exhibited excellent electrochemical response and analysis time of 4 minutes. The same graphite electrode was coupled to an information system for the determination of p-nitrophenol. Thus, it was possible to detect 1.0 mmol L of p-nitrophenol in water samples and analyze/interpret the results using a smartphone. Finally, the need for electrochemical systems with lower limits of detection made us to search for carbon paste microelectrodes. The microelectrodes were fabricated on transparency sheets and coupled on paper using a sandwich-type configuration. The devices were characterized electrochemically in the presence of cysteine and had a rate constant of 10 L mol s. A detection limit of 4.8 mmol L for cysteine was obtained using an array of microelectrodes. By last, carbon paste microelectrodes were used to construct a biosensor in order to determine methyl parathion. The ePAD was constructed to accommodate the substrate (acetylthiocholine ) and enzyme ( acetylcholinesterase ) in the same device / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

Este trabalho utilizou pulsos laser ultracurtos para modificar, de forma controlada, as características dimensionais de nanopartículas de prata em solução aquosa. Para atingir este objetivo foram empregados algoritmos genéticos e circuitos microfluídicos. Utilizou-se um conformador temporal de pulsos ultracurtos para criar diversos perfis temporais de pulsos que irradiaram soluções de nanopartículas de prata. Estes perfis temporais foram ajustados em tempo real, visando otimizar o resultado do experimento, quantificada pela diminuição do diâmetro médio das nanopartículas nas soluções irradiadas. Uma vez que cada experimento de minimização do diâmetro das nanopartículas exigiu centenas de medidas, sua realização foi possível em decorrência da utilização de um circuito microfluídico construído especialmente para este trabalho. Neste circuito é possível utilizar pequenas quantidades de amostra, levando a curtos tempos de irradiação e medição, além da evidente economia de amostras. Para a realização deste trabalho foi elaborado e testado um algoritmo genético interfaceado a diversos equipamentos, incluindo um filtro acustóptico dispersivo programável que modifica as características temporais dos pulsos ultracurtos, através da introdução de componentes de fases espectrais nestes pulsos. Utilizando o algoritmo genético e o filtro acustóptico dispersivo programável foram realizados experimentos de encurtamento da duração temporal dos pulsos ultracurtos provenientes do sistema laser, resultando na obtenção de pulsos com durações próximas às limitadas por transformada de Fourier. Além disso, foram realizados experimentos para a otimização do processo evolutivo do algoritmo genético escrito em Labview. Os experimentos de irradiação de soluções de nanopartículas de prata mostraram que, ao conformar a duração dos pulsos utilizados nas irradiações, pôde-se controlar as dimensões destas nanopartículas, diminuindo seu tamanho médio por um fator 2. Esses experimentos caracterizam a irradiação de nanopartículas por lasers de pulsos ultracurtos como uma importante técnica de controle de características de nanopartículas. / This work used ultrashort laser pulses to modify, in a controlled way, the dimensional characteristics of silver nanoparticles in aqueous solution. To reach this goal, genetic algorithm and microfluidic circuits were used. A pulse shaper was used to create different temporal profiles for the ultrashort pulses used to irradiate the silver nanoparticle solutions. These temporal profiles were conformed in real time, aiming to optimize the experiment result, quantified by the decrease of the average diameter of the nanoparticles in the irradiated solutions. Since each nanoparticle diameter minimization experiment demanded hundreds of measurements, its achievement was possible by the use of a microfluidic circuit specially built for this work. This circuit enables the use of small sample quantities, leading to short irradiation and measurement intervals, besides evident sample savings. To make this work possible, a genetic algorithm was created and tested. This genetic algorithm was interfaced to several equipments, including an acustooptic programmable dispersive filter that modifies the ultrashort pulses temporal characteristics by the introduction of spectral phases in the pulses. The genetic algorithm and the acustooptic programmable dispersive filter were used in conjunction in experiments to temporally shorten the ultrashort pulses from the laser system, generating pulses durations close to the Fourier transform limited ones. Besides, experiments were performed with the Labview coded genetic algorithm to optimize its evolutionary process. The silver nanoparticles irradiation experiments showed that the ultrashort pulses temporal conformation allowed the control of these particles dimensions, decreasing its mean size by a factor of 2. These experiments characterize the nanoparticles irradiation by ultrashort pulses as an important technique to control the nanoparticles characteristics.

O desenvolvimento de um equipamento de eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato e hifenizado a um sistema de amostragem de gases é apresentado. Ele foi construído a partir de chapas de poli(metacrilato de metila) por ablação a laser de CO2, mesclando métodos convencionais com os de microfabricação. Este protótipo traz como inovações: (1) a refrigeração em estado sólido da coluna capilar, (2) a inclusão de eletrólise separada em microdispositivos e (3) a montagem de uma válvula embutida no microchip, baseada em servomotor. O equipamento é portátil (31 × 29 × 25 cm) e projetado para ser utilizado em bancada ou embarcado num robô para análises remotas de agentes neurotóxicos e outros gases ionizáveis em contato com a fase aquosa. O sistema de termostatização permitiu o controle da temperatura interna do capilar de sílica fundida entre 12 e 50 °C utilizando uma elemento Peltier a a partir da temperatura ambiente de 21 °C. A amostragem de gases é feita utilizando-se uma membrana tubular porosa acoplada ao sistema microfluídico. Ela possui 10 cm de comprimento com 300 micrometros de diâmetro externo e 3,1 microlitros de volume interno. Como prova de conceito, foram feitas amostragens de ar contendo ácidos fórmico, acético e propiônico, separação por eletroforese capilar dos respectivos ânions e detecção com relação sinal-ruído de 414, 150 e 115, respectivamente. A amostragem foi realizada por 30 s e a injeção eletrocinética, por 2 s a 1 kV. A corrida eletroforética foi concluída em 4 min. / The development of a capillary electrophoresis equipment with contactless conductivity detection coupled to a gas sampling system is described. It was constructed from poly(methyl methacrylate) by carbon dioxide laser ablation, using conventional methods and microfabrication. The innovations are: (1) solid-state cooling system of the silica capillary, (2) the inclusion of separate electrolysis on a microdevices, and (3) a valve assembly embedded in the microchip based servomotor. It is portable (31 × 29 × 25 cm) and designed to be used on a workbench or embedded in a robot for remote analysis of nerve agents and other ionized gases. The thermostating system allowed the temperature control of the fused silica capillary between 12 and 50 °C using a Peltier chip from ambient temperature of 21°C. Gas sampling is performed using a tubular porous membrane coupled to the microfluidic system. It is 10 cm long with outer diameter of 300 micrometers and 3.1 microliters of internal volume. Air containing formic, acetic, and propionic acids were sampled, and the corresponding anions were separated and detected in the equipment as a proof of concept. The signal-to-noise ratio were, respectively, 414, 150, and 115, after sampling by 30 s and electrokinetic injection by 2 s at 1 kV. The electrophoretic run was accomplished in 4 min.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento de câncer que consiste na interação de três componentes: fotossensibilizador (FS), luz para ativar o FS e o oxigênio presente nos tecidos. Os estudos da fototoxicidade e do potencial de agente terapêuticos utilizados no tratamento do câncer, dentre eles os FSs, são realizados utilizando culturas celulares bidimensionais (2D) ou modelos animais. No entanto, os modelos 2D apresentam limitações, como impossibilitar sinais tão importantes que ocorrem in vivo, dentre eles o contato célula-célula e célula-matriz. Além disso, busca-se reduzir cada vez mais o número de animais em pesquisas científicas. Diante dessas limitações, nos últimos 30 anos tem sido desenvolvidos métodos alternativos in vitro que possam mimetizar melhor as complexas estruturas e funcionalidade dos sistemas in vivo. O objetivo desse estudo foi desenvolver um modelo de cultura de células tridimensional (3D) e um modelo de plataforma de cultura microfluídica para avaliar a viabilidade de células de carcinoma humano (HEp-2) após aplicação da terapia fotodinâmica com hipericina. O modelo 3D foi produzido utilizando-se colágeno tipo I aniônico e a plataforma de cultura microfluídica foi produzida utilizando-se lâmina de plástico, que serviu como base para o adesivo biocompatível utilizado para delimitar o canal celular e o poliéster, servindo como uma espécie de tampa para os dois materiais. A caracterização do biomaterial utilizado no modelo 3D foi realizada pela determinação da porosidade e diâmetro dos poros por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e por ensaios de citotoxicidade pelo método de difusão em ágar e pelo método do MTT (ISO 10993-5). Os ensaios de citotoxicidade comprovaram que o biomaterial utilizado é biocompatível e não causa nenhuma citotoxicidade as células. A viabilidade celular da linhagem HEp-2 foi acompanhada no modelo 2D e 3D durante 168 h (sete dias) utilizando o método do MTT e na plataforma microfluídica por 24 h através de microscopia de fluorescência com perfusão contínua de meio de cultura. Em ambos os modelos as células apresentaram-se capazes de se manter aderidas e em multiplicação. Nos ensaios fototóxicos realizados no modelo 3D por meio do método do MTT, observou-se que a viabilidade celular diminui à medida que se aumenta a concentração da hipericina, mantendo-se a dose de luz e o tempo de incubação constantes, sugerindo que as células HEp-2 em cultura 2D apresentaramse mais sensíveis à TFD do que as células em cultura 3D. Os ensaios fototóxicos na plataforma microfluídica mostraram através da análise das imagens de microscopia de fluorescência que o tipo de morte celular preponderante foi a apoptose. Portanto, os resultados apresentados sugerem que é possível a realização de estudos de terapia fotodinâmica no modelo de cultura tridimensional bem como na plataforma microfluídica de cultura de células. / Photodynamic Therapy (PDT) is a cancer treatment modality consisting of the interaction of three components: photosensitizer (PS), light to activate the PS and oxygen present in the tissues. The studies about the toxicity and potential of therapeutic agents used for cancer treatment, among them the PS, are performed using 2D cell cultures or animal models. However, the 2D models have several limitations, such as making it impossible that important signals which occur in vivo, such as cell-cell and cell-matrix contact occur. In addition, it is importatnt to reduce the number of animals in scientific research. Due of the limitations of the twodimensional cell culture models and the need to reduce the use of animals in research, in the last 30 years alternative in vitro methods have been developed which t can better mimic the complex structures and functionality of in vivo systems. Therefore, the objective of this study was to develop a three-dimensional (3D) cell culture model and a microfluidic culture platform model to evaluate the viability of human carcinoma cells (HEp-2) after photodynamic therapy with hypericin. The 3D support was produced using type I collagen and the microfluidic culture platform was produced using a plastic blade which served as the basis for the surgical adhesive, used to delimit the cell canal and the polyester, serving as a sort of cap for both materials. The characterization of the biomaterial used in the 3D model was performed by determination of the porosity and pore diameter by Scanning Electron Microscopy (SEM) and by cytotoxic assays using the agar diffusion method and the MTT method (ISO 10993-5). It was observed that the biomaterial used in the 3D model is biocompatible and does not cause any cytotoxicity to the cells. The cell viability of the HEp-2 cells was monitored in the 2D and 3D models for 168 h (seven days) using the MTT method and in the microfluidic platform for 24 h by fluorescence microscopy with continuous perfusion of culture medium. In both models the cells are able to remain adherent and in multiplication. In the phototoxic assays performed on the microfluidic platform, the analysis of fluorescence microscopy images showed that the preponderant cell death type was apoptosis. Results suggest that is possible to perform photodynamic therapy studies in the three-dimensional culture model as well as in the microfluidic cell culture platform.

Durante a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) seleciona-se um espermatozoide móvel e morfologicamente normal para injeção em ovócito maduro. Evidências recentes indicam que mesmo espermatozoides aparentemente normais podem ocultar defeitos em nível molecular. O principal objetivo deste trabalho foi a descrição de um novo método capaz de selecionar espermatozoides maduros a partir de amostras não processadas em procedimento de ICSI. Em um estudo comparativo e prospectivo testou-se uma gota estendida modificada. A \"gota estendida com mecanismo contracorrente\" - GEMC foi montada em uma placa de ICSI padrão a partir de seis gotas de meio de cultivo (10 ?L). O posicionamento e união precisa das gotas deram origem a dois reservatórios e um canal, resultando em um fluxo de líquido através do canal. A adição de uma solução de PVP (polivinilpirrolidona) gerou um gradiente de viscosidade no final do circuito. Amostras seminais foram obtidas de 40 pacientes inférteis. Cada amostra seminal foi dividida em 4 alíquotas: uma alíquota para o processamento por centrifugação em gradiente de densidade (CGD), uma alíquota para a GEMC utilizando amostras não processadas, uma alíquota para a GEMC utilizando amostras processadas e uma alíquota para controle. Nos grupos GEMC uma média de 200 espermatozoides foram consecutivamente coletados, sem seleção, no reservatório de captura utilizando-se uma micropipeta de injeção como no procedimento convencional de ICSI. A morfologia espermática foi avaliada e demonstrou melhora, comparando-se com os controles, em todos os tratamentos utilizados. A imaturidade da cromatina foi avaliada utilizando-se o teste do azul de anilina. Em relação à imaturidade, 100% dos homens obtiveram melhores resultados tanto após o preparo por CGD quanto utilizando o método GEMC. Isto se refletiu em uma redução das formas imaturas de 28.65 ± 8.97% no sêmen fresco para 17.29 ± 7.72% após processamento por CGD (P < 0.01). Uma redução ainda maior nas formas imaturas foi obtida após o método GEMC quando comparado com o processamento por CGD: 0.89 ± 1.31% (P < 0.01) utilizando-se sêmen fresco e 1.05 ± 1.63% (P < 0.01) utilizando-se amostras processadas. Um novo método unindo seleção e captura de espermatozoides em um mesmo procedimento de ICSI foi descrito e testado. O método GEMC seleciona espermatozoides de forma fácil e permite o uso direto de amostras não processadas em procedimentos de ICSI. Este método seleciona espermatozoides maduros com mais eficiência do que o processamento por CGD. Novos estudos são necessários para se analisar o impacto do método nas taxas de fertilização, desenvolvimento embrionário, gravidez, implantação e abortamento / During intracytoplasmic sperm injection (ICSI) a motile spermatozoon with normal morphology is visually selected for insemination of an oocyte. Recent evidence indicates that even though the sperm appears morphologically normal, a possibility of defects at the molecular level still exists. The main objective of this work was to describe a novel approach capable of selecting mature spermatozoa from unprocessed semen sample in a one-step ICSI procedure. A modified extended drop was tested in a prospective comparative study. The \"Gota Estendida com Mecanismo Contracorrente - GEMC\" (Positive Rheotaxis Extended Drop - PRED) was assembled on a standard ICSI dish and consisted of six culture medium droplets (10 ?L). The precise merging of the drops created two reservoirs and a channel therefore the fluid flew through the channel. The addition of a PVP solution created a viscosity gradient in the final sector of the circuit. Semen samples were taken from 40 subfertile men. Each semen sample was divided into four aliquots: one aliquot for density gradient centrifugation (DGC), one aliquot for GEMC using fresh semen, one aliquot for GEMC using processed semen and one aliquot for the control. In GEMC a mean of 200 spermatozoa were collected consecutively, without selection, from the outlet reservoir with an injecting pipette as for conventional ICSI procedure. Sperm morphology was assessed and resulted in improvement compared to controls in all treatments. Chromatin immaturity was assessed using aniline blue assay. Regarding to chromatin immaturity, 100% of men had better results after DGC preparation and GEMC approach. This was reflected in a mean reduction from 28.65 ± 8.97% uncondensed chromatin in the native ejaculates to 17.29 ± 7.72% in DGC processed semen (P < 0.01). An even greater reduction was achieved after GEMC approach showing a mean of 0.89 ± 1.31% uncondensed chromatin compared to DGC processed sample (P < 0.01). A novel one-step ICSI approach joining sperm selection and recovery was developed and tested. This GEMC approach can select sperm easily and permits the direct use of native semen in ICSI. This approach can select sperm with lower chromatin immaturity than DGC method. Further studies need to access its relation to fertilization, embryo development, pregnancy, implantation and miscarriage rates

O objetivo principal desta tese foi o de se desenvolver uma biocélula a combustível enzimática em microfluídica, utilizando a glicose como combustível e o oxigênio como oxidante. Foram utilizadas as enzimas Glicose Oxidase ou Glicose Desidrogenase em um bioânodo, de forma a promover reações bioeletrocatalíticas de oxidação da glicose e as enzimas Lacase ou Bilirrubina Oxidase, de forma a promover reações bioeletrocatalíticas de redução do oxigênio molecular. O trabalho se procedeu por tentativas de imobilizar estas enzimas, de forma a promover o mecanismo de transferência eletrônica direta com um eletrodo. Nas situações as quais isso não foi possível, foram utilizados mediadores eletrônicos, de forma a promover o mecanismo de transferência eletrônica mediada. O melhor par de sistemas de bioeletrodos e mediadores foi escolhido para serem aplicados em uma biocélula a combustível. O trabalho se procedeu em adaptar este par de bioeletrodos desenvolvidos para um sistema de microfluídica em papel, sendo ambos biocátodo e bioânodo em papel. Como as condições de concentração de combustível e de cofatores foram otimizadas para o bioânodo, foi necessário trabalhar com os biocátodos, de forma a apresentar as características de um biocátodo respirador, para melhor utilizar o oxigênio presente no ar e a apresentar um desempenho tão bom quanto o dos bioânodos. A biocélula a combustível em papel possibilitou a geração de energia elétrica por até 18 dias, utilizando uma resistência de 1.7 k&Omega;, nas condições experimentais ideais. De forma a provar o conceito da tecnologia para aplicações reais, a biocélula a combustível em papel foi demonstrada a ter a capacidade de geração de energia elétrica suficiente para fazer um relógio funcionar por pelo menos 36 horas, utilizando a bebida isotônica Gatorade&reg;, como combustível. / The main objective of this thesis is to develop a microfluidic biofuel cell using glucose as the fuel and oxygen as the oxidant. The enzymes Glucose Oxidase or Glucose Dehydrogenase were used in a bioanode to promove the bioelectrocatalytic oxidation of glucose and the enzymes Laccase or Bilirubin Oxidase to promove the bioelectrocatalytic reduction of the molecular oxygen. The work was conducted by attempts to immobilize these enzymes in order to promote the mechanism of direct electron transfer with the electrode. For the situations where this was not observed, mediators were used in a way to promote the mechanism of mediated electron transfer. The best pair of bioelectrodes and mediatores was chosen to be applied in a biofuel cell. The work was carried out to adapt this par of developed bioelectrodes to a paper based microfluidic system, using both biocathode and bioanode in a paper-like design. As the conditions for concentration of fuel and cofactors were optimized for the bioanode, it was necessary to work on these biocathodes so as to have the characteristics of an air-breathing biocathode for a better use of the oxygen present in the air and to work with a performance as good as the bioanode. The paper based biofuel cell enabled the generation of electricity for up to 18 days using a resistance of 1.7 k&Omega; within the optimum experimental conditions. In order to prove the concept of this technology for real applications, the paper based biofuel cell was demonstrated to have the capacity for generation of enough electrical energy to power up a clock for at least 36 hours using the isotonic drink Gatored&reg; as fuel.

O desenvolvimento de um equipamento de eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato e hifenizado a um sistema de amostragem de gases é apresentado. Ele foi construído a partir de chapas de poli(metacrilato de metila) por ablação a laser de CO2, mesclando métodos convencionais com os de microfabricação. Este protótipo traz como inovações: (1) a refrigeração em estado sólido da coluna capilar, (2) a inclusão de eletrólise separada em microdispositivos e (3) a montagem de uma válvula embutida no microchip, baseada em servomotor. O equipamento é portátil (31 × 29 × 25 cm) e projetado para ser utilizado em bancada ou embarcado num robô para análises remotas de agentes neurotóxicos e outros gases ionizáveis em contato com a fase aquosa. O sistema de termostatização permitiu o controle da temperatura interna do capilar de sílica fundida entre 12 e 50 °C utilizando uma elemento Peltier a a partir da temperatura ambiente de 21 °C. A amostragem de gases é feita utilizando-se uma membrana tubular porosa acoplada ao sistema microfluídico. Ela possui 10 cm de comprimento com 300 micrometros de diâmetro externo e 3,1 microlitros de volume interno. Como prova de conceito, foram feitas amostragens de ar contendo ácidos fórmico, acético e propiônico, separação por eletroforese capilar dos respectivos ânions e detecção com relação sinal-ruído de 414, 150 e 115, respectivamente. A amostragem foi realizada por 30 s e a injeção eletrocinética, por 2 s a 1 kV. A corrida eletroforética foi concluída em 4 min. / The development of a capillary electrophoresis equipment with contactless conductivity detection coupled to a gas sampling system is described. It was constructed from poly(methyl methacrylate) by carbon dioxide laser ablation, using conventional methods and microfabrication. The innovations are: (1) solid-state cooling system of the silica capillary, (2) the inclusion of separate electrolysis on a microdevices, and (3) a valve assembly embedded in the microchip based servomotor. It is portable (31 × 29 × 25 cm) and designed to be used on a workbench or embedded in a robot for remote analysis of nerve agents and other ionized gases. The thermostating system allowed the temperature control of the fused silica capillary between 12 and 50 °C using a Peltier chip from ambient temperature of 21°C. Gas sampling is performed using a tubular porous membrane coupled to the microfluidic system. It is 10 cm long with outer diameter of 300 micrometers and 3.1 microliters of internal volume. Air containing formic, acetic, and propionic acids were sampled, and the corresponding anions were separated and detected in the equipment as a proof of concept. The signal-to-noise ratio were, respectively, 414, 150, and 115, after sampling by 30 s and electrokinetic injection by 2 s at 1 kV. The electrophoretic run was accomplished in 4 min.

Este trabalho utilizou pulsos laser ultracurtos para modificar, de forma controlada, as características dimensionais de nanopartículas de prata em solução aquosa. Para atingir este objetivo foram empregados algoritmos genéticos e circuitos microfluídicos. Utilizou-se um conformador temporal de pulsos ultracurtos para criar diversos perfis temporais de pulsos que irradiaram soluções de nanopartículas de prata. Estes perfis temporais foram ajustados em tempo real, visando otimizar o resultado do experimento, quantificada pela diminuição do diâmetro médio das nanopartículas nas soluções irradiadas. Uma vez que cada experimento de minimização do diâmetro das nanopartículas exigiu centenas de medidas, sua realização foi possível em decorrência da utilização de um circuito microfluídico construído especialmente para este trabalho. Neste circuito é possível utilizar pequenas quantidades de amostra, levando a curtos tempos de irradiação e medição, além da evidente economia de amostras. Para a realização deste trabalho foi elaborado e testado um algoritmo genético interfaceado a diversos equipamentos, incluindo um filtro acustóptico dispersivo programável que modifica as características temporais dos pulsos ultracurtos, através da introdução de componentes de fases espectrais nestes pulsos. Utilizando o algoritmo genético e o filtro acustóptico dispersivo programável foram realizados experimentos de encurtamento da duração temporal dos pulsos ultracurtos provenientes do sistema laser, resultando na obtenção de pulsos com durações próximas às limitadas por transformada de Fourier. Além disso, foram realizados experimentos para a otimização do processo evolutivo do algoritmo genético escrito em Labview. Os experimentos de irradiação de soluções de nanopartículas de prata mostraram que, ao conformar a duração dos pulsos utilizados nas irradiações, pôde-se controlar as dimensões destas nanopartículas, diminuindo seu tamanho médio por um fator 2. Esses experimentos caracterizam a irradiação de nanopartículas por lasers de pulsos ultracurtos como uma importante técnica de controle de características de nanopartículas. / This work used ultrashort laser pulses to modify, in a controlled way, the dimensional characteristics of silver nanoparticles in aqueous solution. To reach this goal, genetic algorithm and microfluidic circuits were used. A pulse shaper was used to create different temporal profiles for the ultrashort pulses used to irradiate the silver nanoparticle solutions. These temporal profiles were conformed in real time, aiming to optimize the experiment result, quantified by the decrease of the average diameter of the nanoparticles in the irradiated solutions. Since each nanoparticle diameter minimization experiment demanded hundreds of measurements, its achievement was possible by the use of a microfluidic circuit specially built for this work. This circuit enables the use of small sample quantities, leading to short irradiation and measurement intervals, besides evident sample savings. To make this work possible, a genetic algorithm was created and tested. This genetic algorithm was interfaced to several equipments, including an acustooptic programmable dispersive filter that modifies the ultrashort pulses temporal characteristics by the introduction of spectral phases in the pulses. The genetic algorithm and the acustooptic programmable dispersive filter were used in conjunction in experiments to temporally shorten the ultrashort pulses from the laser system, generating pulses durations close to the Fourier transform limited ones. Besides, experiments were performed with the Labview coded genetic algorithm to optimize its evolutionary process. The silver nanoparticles irradiation experiments showed that the ultrashort pulses temporal conformation allowed the control of these particles dimensions, decreasing its mean size by a factor of 2. These experiments characterize the nanoparticles irradiation by ultrashort pulses as an important technique to control the nanoparticles characteristics.