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Mécanisme d’action d’une classe d’antibiotiques depuis leur entrée jusqu’à leur cible chez la bactérie : visualisation en temps réel / Mechanism of action of a class of antibiotics from their entry to their target in bacteria : a real time visualizationOkuda, Maho 30 September 2015 (has links)
Des techniques variées de visualisation de molécules d’intérêt sur cellules vivantes ou fixées ont permis de suivre leur synthèse, localisation, dégradation et autres activités. Dans cette étude, nous avons développé deux outils de fluorescence pour étudier la synthèse des protéines sur bactéries vivantes. Le premier décrit l’utilisation du système Spinach pour l’imagerie du ribosome. Cette approche diffère des méthodes conventionnelles qui utilisent des protéines fluorescentes puisque l’ARN ribosomal 16S contient un aptamère qui rend fluorescent un composé fluorogène. Une étude comparative de la performance de différents aptamères Spinach a été réalisée. Un deuxième outil se focalise sur l’accumulation d’un antibiotique de la famille des aminoglycosides (ligand du ribosome) conjugué à un fluorophore. Ce nouveau conjugué, qui a conservé son activité bactéricide permet pour la première fois de visualiser l’accumulation de l’antibiotique sur bactérie vivante. Cela permet une analyse au niveau de la cellule unique d’une population bactérienne exposée à l’antibiotique. Nous avons également obtenu des données sur la localisation de l’antibiotique une fois qu’il a pénétré dans la bactérie à une résolution inégalée par microscopie super-résolutive. Nous espérons que ces deux méthodes vont maintenant permettre une meilleure compréhension de la synthèse des protéines et fournir une vue nouvelle de la pénétration des antibiotiques dans les bactéries pour y produire leur action bactéricide. / Various visualizing techniques have previously enabled monitoring the fate of molecules of interest: their expression, localization, degradation and other activities in live or fixed cells. In this study, we have developed two fluorescent tools to study protein synthesis in live bacterial cell. The first one describes the application of Spinach system to ribosomes imaging. This is different from conventional methods (that use fluorescent proteins) in that 16S rRNA contains an inserted RNA aptamer that elicits fluorescence of a fluorogenic compound. A comparative study of the performance of different Spinach aptamers was performed here. A second system focuses on the uptake of a fluorescently labeled ligand of the ribosome, an antibiotic of the class of aminoglycosides. This novel conjugate, which kept its bactericidal activity allows for the first time imaging of aminoglycoside uptake on live bacteria. This opened the door to a single cell analysis of bacterial cell populations. We also obtained data about the localization of the antibiotic once inside the bacteria to an unprecedented resolution using super resolution microscopy. We hope that both of these methods will contribute to a better understanding of protein synthesis as well as provide a novel view on the way antibiotics penetrate into cells and perform their bactericidal action.
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Resolution improvement in fluorescence and phase optical microscopyMudry, Emeric 25 September 2012 (has links)
La microscopie optique est une technique essentielle pour de nombreuses disciplines des sciences expérimentales qui nécessitent des résolutions sans cesse plus petites. Dans ce travail de thèse sont présentés plusieurs travaux pour l'amélioration de la résolution en microscopie de fluorescence et en microscopie tomographique par diffraction (MTD), une récente technique de microscopie de phase. Dans un premier temps, il est montré que déposer l'échantillon sur un miroir permet d'augmenter la résolution axiale en MTD et en microscopie confocale de fluorescence. En microscopie confocale, il faut pour cela mettre en forme le faisceau incident grâce à un modulateur spatial de lumière. En MTD, il suffit d'adapter le programme de reconstruction. La deuxième partie présente des algorithmes pour reconstruire des images haute résolution à partir de mesures en éclairement structuré avec de champs d'illumination inconnus, à la fois en microscopie de fluorescence (algorithme blind-SIM) et en MTD. En microscopie de fluorescence, ces algorithmes permettent de simplifier drastiquement les montages expérimentaux produisant l'éclairement structuré et en MTD, d'obtenir des images d'échantillons à fort indice. / Various fields of experimental science are constantly requiring smaller resolution for optical microscopy. In this thesis are presented several works for improving resolution in fluorescence microscopy and in Tomographic Diffraction Microscopy (TDM), an emerging phase microscopy technique. In the first part it is shown that one can improve the axial resolution in depositing the sample on a mirror. In confocal fluorescence microscopy, this is done by shaping the illumination beam with a Spatial Light Modulator. In TDM this is done by adapting the reconstruction method. Then algorithms are proposed for reconstructing high-resolution images from structured illumination measurements with unknown illumination fields, both in fluorescence imaging (blind-SIM algorithm) and in TDM. This allows a dramatical simplification of the experimental set-ups in fluorescence structured illumination and the image reconstruction of high optical index samples in TDM.
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Propriétés structurelles et électroniques du graphène sur SiC(0001) étudiées par microscopie combinée STM/AFM / Structural and electronic properties of graphene on SiC(0001) studied by combined STM/AFM microscopyMorán Meza, José Antonio 16 October 2013 (has links)
Le graphène, un feuillet élémentaire de graphite, est un matériau très étudié par la communauté scientifique car ses propriétés physiques sont nouvelles et uniques. Il apparaît comme un matériau très prometteur pour des applications technologiques. Nous présentons une étude des propriétés structurelles et électroniques du graphène épitaxial sur 6H-SiC(0001) au moyen d’un microscope STM/AFM combiné basé sur un diapason en quartz avec une pointe conductrice en Pt/Ir ou en fibre de carbone. Les pointes fabriquées par attaque électrochimique présentent un rayon d’apex de quelques nanomètres et ont été caractérisées par SEM, TEM et émission électronique par effet de champ. On s’est d’abord focalisé sur les propriétés d’un échantillon qui présente des terrasses partiellement recouvertes de graphène. Dans ce cas, l’image STM ne donne pas la topographie de la surface. Celle-ci est donnée par l’AFM en mode répulsif. Les différentes propriétés électroniques de chaque terrasse sont confirmées par des mesures spectroscopiques I=f(V). Puis, l’étude à haute résolution par FM-AFM sur une terrasse lisse a révélé la structure ondulée et périodique de la reconstruction 6√3x6√3R30° du SiC(0001) recouverte de graphène. Nous montrons que les maxima des nappes d’iso-densité locale d’états électroniques au niveau de Fermi observés dans l’image STM ne se superposent pas avec les zones associées aux maxima des nappes d’iso-densité d’états totaux (Topographie AFM). Ils apparaissent décalés de ~1 nm le long de la direction [11] de la quasi-maille 6x6 de la reconstruction 6√3x6√3R30°. Comme l’amplitude mesurée des ondulations de la surface augmente avec le gradient de force appliqué, on montre que la surface du graphène est déformée par la pointe AFM. Cette déformation qui modifie le couplage électronique entre le graphène et la couche tampon influence fortement le contraste des images STM/AFM. Les conséquences de cette déformation sur les images STM résolvant le réseau du graphène sont aussi discutées. / The graphene, a basic sheet of graphite, is a new material intensively studied by the scientific community because of its new and unique physical properties. Furthermore it appears as a very promising material for technological applications. We present a study of structural and electronic properties of epitaxial graphene on 6H-SiC(0001) using a combined STM/AFM microscope based on a quartz tuning fork with a conductive tip. The tips made from electrochemical etched Pt/Ir wire or carbon fiber have an apex radius of few nanometers and were characterized by SEM, TEM and by field electron emission. First, we focused on the properties of a sample showing terraces partially covered with graphene. In this case, the STM images do not provide the real surface topography, which is given by the AFM topography working in repulsive mode. The electronic properties of each terrace are confirmed by local spectroscopic I=f(V) measurements. Then, the high-resolution FM-AFM study on a smooth terrace revealed the corrugated structure due to the periodic 6√3x6√3R30° reconstruction of SiC (0001) covered with graphene. We show that the maxima of the local density of electronic states at the Fermi level observed in STM image do not overlap with the zones associated with maxima of total states density (AFM Topography). They appear shifted by ~1 nm along the direction [11] of the 6x6 nanomesh of the 6√3x6√3R30° reconstruction. As the corrugation amplitude of the surface increases with the applied force gradient, we show that the surface of graphene is distorted by the AFM tip. This deformation modifies the electronic coupling between the graphene and the buffer layer and strongly influences the contrast in STM/AFM images. The consequences of this deformation are also discussed in the STM images showing the lattice of graphene.
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Microscopie de molécules uniques avec des nanoparticules à conversion ascendante / Single-molecule imaging with upconverting nanoparticlesDukhno, Oleksii 13 November 2018 (has links)
La microscopie de molécule unique (single-molecule microscopy, SMM) regroupe un ensemble de techniques pour la biologie moléculaire et cellulaire permettant de visualiser le mouvement de molécules biologiques individuelles. Néanmoins, les techniques SMM imposent de fortes contraintes en ce qui concerne les luminophores utilisés. Récemment, un nouveau luminophore appelé «particule à conversion ascendante» (upconverting nanoparticles, UCNP) a attiré l'attention de la communauté scientifique en raison de son émission efficace de lumière visible après une excitation par de la lumière infrarouge. Cette propriété fait des UCNPs un luminophore très intéressant pour les applications biologiques : l'excitation infrarouge permet d'éliminer l’autofluorescence, généralement associé à une excitation dans la gamme du visible. De plus, la photostabilité extrême des UCNP et l’absence de photoclignotement sont également de précieux atouts pour les expériences SMM. L’objectif de cette thèse était d’adapter les UCNPs aux applications SMM, avec le but ultime d’exploiter leurs propriétés uniques pour améliorer les performances des expériences SMM. Au cours du projet, les protocoles de dispersion des UCNPs dans des tampons aqueux ont été optimisées pour conserver une bonne monodispersité des particules; l'efficacité des UCNPs dans les expériences de transfert résonant d'énergie en particule unique a été estimée; des protocoles pour l'imagerie d'UCNPs uniques ont été développés; et la preuve de concept de l'utilisation des UCNPs dans des expériences de suivi de molécules uniques à la surface de cellules vivantes a été réalisée. Finalement, ces résultats forment une base solide pour de futures expériences SMM utilisant les UCNPs. / Single-molecule microscopy (SMM) is a powerful set of techniques for molecular and cell biology that allows visualizing the movement of individual biological molecules, but has strict requirements towards the utilized luminophores. Recently, a new luminophore called upconverting particles (UCNPs) gained attention of the research community due to their efficient emission of visible light upon excitation with infrared light. This property makes UCNPs a valuable luminophore for biological applications due to the elimination of autofluorescence background, commonly associated with regular visible light excitation. Extreme photostability of UCNPs and absence of sporadic photoswitching are also valuable for SMM experiments. The objective of this thesis was to adapt UCNPs to SMM applications, with the ultimate goal of exploiting their unique properties towards superior performance of SMM experiments. During the project, protocols for dispersing UCNPs in aqueous buffers were streamlined to provide superior particle monodispersity; the efficiency of UCNPs in single-molecule resonance energy transfer experiments was estimated; protocols for single-molecule imaging with UCNPs were developed; and a proof-of-concept system for targeted single-molecule tracking with UCNPs in live cells was demonstrated. Overall, these findings will serve as a foundation towards robust SMM assays based on UCNPs.
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Microscopie par génération de troisième harmonique appliquée à la biologie.Debarre, Delphine 15 September 2006 (has links) (PDF)
Cette thèse a porté sur le développement pour la biologie de la microscopie par génération de troisième harmonique (THG), qui permet la visualisation sans marquage de cellules et de tissus avec une résolution sub-micrométrique. Son application en biologie était jusqu'à présent limitée par le manque d'études du mode de création du signal dans l'échantillon, des sources de contrastes biologiques endogènes ainsi que de la phototoxicité induite. Le travail présenté ici a essentiellement porté sur ces trois questions. Nous avons d'abord étudié théoriquement et expérimentalement l'influence de la structure de l'échantillon et de la focalisation du faisceau excitateur sur le signal THG. Nous avons montré que l'imagerie THG agit sur l'échantillon comme un filtre passe! -bande pour les fréquences spatiales et qu'ajuster la focalisation de l'excitation permet de moduler la visibilité de structures au sein d'un système complexe selon leur forme. Par ailleurs, nous avons caractérisé les propriétés optiques de différents liquides biologiques, qui prédisent qu'un corps lipidique dans un environnement aqueux doit constituer une source efficace de signal intracellulaire. Nous avons démontré que de telles structures peuvent effectivement être suivies et quantifiées par microscopie THG dans de nombreux types de tissus biologiques non marqués, ouvrant la voie à des applications en physiopathologie. Finalement, nous avons appliqué la microscopie THG à la visualisation in vivo et sans marquage du développement embryonnaire précoce chez la drosophile. Sur ce modèle, nous avons étudié les mécanismes de phototoxicité liés à l'imagerie THG et démontré la possibilité de visualiser les embryons en 3D sans perturbation du développement et de quantifier les mouvements morphogénétiques à partir des séquences obtenues.
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Etude et réalisation d'un micro-nano manipulateur avec retour de force : contribution à son intégration dans une plateforme multicapteursFriedt, Jean-Michel 03 October 2000 (has links) (PDF)
Nous avons développé les méthodes et instruments permettant de manipuler avec retour de force des objets de très petites dimensions (échelles micrométriques et nanométriques). L'utilisation de leviers de microscope à force atomique piézorésistifs permet de travailler dans un volume réduit et avec un minimum d'instruments extérieurs : l'introduction dans un microscope à balayage électronique de notre dispositif permet, en plus du retour de force traduisant la déflection du levier, d'avoir une rétroaction visuelle sur les manipulations opérées sur des billes de silice. Nous avons alors tenté de combiner ce manipulateur avec divers autres capteurs travaillant à des échelles différentes : plasmons de surface pour les échelles micrométriques, ondes acoustiques pour les échelles millimétriques. La réalisation d'instruments de mesure utilisant ces deux techniques nous a permis de mieux appréhender les difficultés à les combiner en un seul et même instrument de mesure simultanée sur un même échantillon. Nous nous sommes efforcés de décrire toutes les méthodes expérimentales mises en oeuvre : un nombre important d'annexes développent l'électronique et les logiciels mis en place lors de ces expériences. Un souci particulier a toujours été maintenu de rendre ces instruments aussi autonomes et transportables que possible.
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Étude de propriétés électroniques de nanostructures par microscopie à force atomique sous ultra-videBorowik, Łukasz 14 December 2009 (has links) (PDF)
Cette thèse est consacrée à l'étude des propriétés électroniques de nanostructures par microscopie à force atomique (AFM) en ultra-vide. La première partie de ce travail a consisté à caractériser localement des nanofils de silicium par technique d'AFM conducteur. Les expériences de conduction locale sur nanofils inclinés montrent que la conduction des nanofils intrinsèques est dominée par un transport en surface, associé à la présence de résidus catalytiques métalliques. Cette conduction peut être partiellement supprimée (par désoxydation) ou exaltée (par traitement thermique). Une caractérisation qualitative du dopage de ces nanostructures est présentée, par technique de microscopie à sonde de Kelvin. La deuxième partie de la thèse a consisté à étudier le transfert de charges et les propriétés d'ionisation de nanocristaux de silicium passivés hydrogène, dopés de type n (P) ou p (B), fabriqués par dépôt plasma. L'analyse des images de microscopie à sonde de Kelvin en modulation d'amplitude sous ultra-vide montre que le transfert de charges des nanocristaux de silicium correspond à un mécanisme de compensation d'énergie, exalté par le confinement quantique. Les résultats expérimentaux fournissent une mesure de l'ouverture de la bande interdite des nanocristaux due au confinement quantique, dans la gamme 2-50 nm, en accord quantitatif avec des calculs en liaisons fortes. Ils mettent en avant la possibilité d'utiliser des nanocristaux dopés comme sources d'électrons pour réaliser un dopage sélectif contrôlé de nanostructures ou nanodispositifs, avec des densités dans les gammes de 2×10^11-10^14 cm^-2 ou 8×10^5-2×10^7 cm^-1.
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Propriétés structurelles et électroniques du graphène sur SiC(0001) étudiées par microscopie combinée STM/AFMMorán Meza, José Antonio 16 October 2013 (has links) (PDF)
Le graphène, un feuillet élémentaire de graphite, est un matériau très étudié par la communauté scientifique car ses propriétés physiques sont nouvelles et uniques. Il apparaît comme un matériau très prometteur pour des applications technologiques. Nous présentons une étude des propriétés structurelles et électroniques du graphène épitaxial sur 6H-SiC(0001) au moyen d'un microscope STM/AFM combiné basé sur un diapason en quartz avec une pointe conductrice en Pt/Ir ou en fibre de carbone. Les pointes fabriquées par attaque électrochimique présentent un rayon d'apex de quelques nanomètres et ont été caractérisées par SEM, TEM et émission électronique par effet de champ. On s'est d'abord focalisé sur les propriétés d'un échantillon qui présente des terrasses partiellement recouvertes de graphène. Dans ce cas, l'image STM ne donne pas la topographie de la surface. Celle-ci est donnée par l'AFM en mode répulsif. Les différentes propriétés électroniques de chaque terrasse sont confirmées par des mesures spectroscopiques I=f(V). Puis, l'étude à haute résolution par FM-AFM sur une terrasse lisse a révélé la structure ondulée et périodique de la reconstruction 6√3x6√3R30° du SiC(0001) recouverte de graphène. Nous montrons que les maxima des nappes d'iso-densité locale d'états électroniques au niveau de Fermi observés dans l'image STM ne se superposent pas avec les zones associées aux maxima des nappes d'iso-densité d'états totaux (Topographie AFM). Ils apparaissent décalés de ~1 nm le long de la direction [11] de la quasi-maille 6x6 de la reconstruction 6√3x6√3R30°. Comme l'amplitude mesurée des ondulations de la surface augmente avec le gradient de force appliqué, on montre que la surface du graphène est déformée par la pointe AFM. Cette déformation qui modifie le couplage électronique entre le graphène et la couche tampon influence fortement le contraste des images STM/AFM. Les conséquences de cette déformation sur les images STM résolvant le réseau du graphène sont aussi discutées.
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Apports de la microscopie biphotonique intravitale pulmonaire à l'étude de la physiopathologie de la maladie du charbonFiole, Daniel 10 June 2013 (has links) (PDF)
Bacillus anthracis, l'agent infectieux responsable de la maladie du charbon, est un agent pathogène majeur du risque biologique provoqué, notamment en raison de la sévérité de la forme respiratoire de la maladie. Celle-ci résulte de l'inhalation de spores dont les mécanismes de pénétration au niveau pulmonaire sont mal connus à l'heure actuelle. Cette thèse présente les apports des microscopies confocale et biphotonique à l'étude de ces mécanismes de pénétration des spores inhalées. Le modèle murin CX3CR1+/gfp, dont la sous-population CD11b+ de cellules dendritiques (DCs) exprime constitutivement la protéine de fluorescence verte (GFP), a été utilisé dans ces travaux. Une première partie présente le développement d'une méthode automatisée de discrimination des DCs parmi d'autres populations cellulaires exprimant le même fluorophore, en se basant sur le calcul d'un coefficient morphologique. Cette méthode a permis d'étudier dans un deuxième temps le comportement spécifique de la sous-population de DCs CD11b, après infection par des spores de B. anthracis. L'étude microscopique a été d'abord effectuée in situ, c'est-à-dire sur des explants pulmonaires maintenus dans des conditions favorables à la préservation de l'activité cellulaire, puis in vivo, sur des souris anesthésiées et ventilées. Le protocole d'imagerie tire profit d'une stratégie d'acquisition et de traitement a posteriori des données permettant de surmonter, sans contrainte mécanique appliquée à l'organe, les problèmes de focalisation liés aux mouvements thoraciques durant la ventilation de l'animal. Cette stratégie originale utilise un sur-échantillonnage de l'acquisition et profite du signal de seconde harmonique généré par le collagène comme référence spatiale ; elle a permis l'observation in vivo d'interactions entre DCs et macrophages au niveau pulmonaire. Ces interactions, de type synapse immunologique, sont favorisées par l'infection et présentent donc un rôle fonctionnel qui reste à définir. La formation de synapses immunologiques entre macrophages et DCs pourrait non seulement représenter un chaînon manquant à l'explication de la pénétration des spores de B. anthracis au niveau pulmonaire, mais pourrait aussi constituer un enjeu crucial dans la compréhension de la réponse immunitaire associée aux infections pulmonaires.
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Développement de nouvelles méthodes pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseur FRET par microscopie de fluorescence quantitative / Development of new methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensor by quantitative fluorescence microscopyDéméautis, Claire 22 September 2016 (has links)
La microscopie de fluorescence est devenue un outil incontournable en biologie. En particulier, il est possible de suivre dans le temps et dans l’espace en cellules vivantes l’activité de protéines en utilisant des biosenseurs FRET génétiquement encodés. Mon travail de thèse a consisté à développer de nouvelles méthodes de microscopie de fluorescence quantitative pour dépasser les limitations rencontrées dans le suivi de biosenseurs FRET. En premier lieu, j’ai eu à développer une méthodologie pour le suivi de deux biosenseurs FRET génétiquement encodés par mesure de durée de vie (FLIM) en simultané avec une seule longueur d’onde d’excitation. En effet, il n’est pas facile de suivre deux activités biochimiques par biosenseurs FRET dans un même échantillon vivant par microscopie de fluorescence à cause de l’existence de fuites spectrales dans les canaux de détection des différentes protéines fluorescentes et l’utilisation de deux longueurs d’onde d’excitation pour chacun des deux donneurs. En combinant les deux couples de protéines fluorescentes mTFP1/ShadowG et LSSmOrange/mKate2, les artefacts de fuite spectrale ont pu être négligés. Il a été possible de suivre les activités kinases des protéines ERK et PKA en simultané par FLIM. À l’aide de cette méthodologie, nous avons pu mettre en évidence une activation de la voie PKA lors d’une stimulation à l’EGF. En second lieu, j’ai développé une méthode pour le suivi de biosenseur FRET par la technique de spectroscopie à corrélation croisée de fluorescence (FCCS). Le suivi d’activité de certaines protéines peut s’avérer difficile du fait de leur faible expression au sein de l’échantillon vivant et de leur localisation. La méthode de FCCS nécessite une faible concentration de fluorophores et peut donc s’adapter à ces échantillons. Le FRET a un effet direct sur l’amplitude de corrélation croisée lorsque celle-ci est mesurée en suivant la co-diffusion de deux protéines fluorescentes attachées à un même biosenseur. Une diminution de ratio d’amplitude des courbes d’autocorrélation (verte ou rouge) sur l’amplitude de la courbe de corrélation croisée correspond à la présence de FRET. Nous avons pu mesurer cette diminution dans des cellules exprimant le biosenseur FRET Aurora A WT (FRET) en comparaison avec un mutant K162M (non FRET). Ces premiers résultats sont très prometteurs pour l’utilisation de cette approche au suivi d’un biosenseur faiblement exprimé en cellules vivantes. L’amélioration du suivi de biosenseur FRET, par les méthodes de microscopie de fluorescence quantitative présentées dans ce travail, doit pouvoir permettre la réponse à des questions d’intérêt biologiques nécessitant le suivi multiplex de FRET ou la mesure de biosenseurs à faible niveau d’expression, là où les techniques conventionnelles se heurtaient à leur limitation. / Fluorescence microscopy has become an invaluable tool in biology. In particular, it allows to follow in time and space the activity of proteins, using genetically encoded FRET biosensors, in live cell imaging. In my thesis work, I have developed new quantitative fluorescence microscopy methods to overcome the limitations encountered in monitoring FRET biosensors. First, I developed a methodology to monitor simultaneously two genetically encoded FRET biosensors by lifetime measures (FLIM) with a single excitation wavelength. Previously, it was not easy to follow two biochemical activities by FRET biosensors in the same live sample by fluorescence microscopy. Two reasons for that: the existence of spectral bleed through in the detection channel of each fluorescent proteins and the use of two excitation wavelengths for the two donors. By combining two fluorescent proteins pairs: mTFP1 / ShadowG and LSSmOrange / mKate2, the “spectral bleed through” artifact became negligible. It became then possible to follow the kinase activity of PKA and ERK proteins simultaneously by FLIM. Using this methodology, we were able to show an activation of the PKA pathway upon stimulation with EGF. Second, I developed a method to monitor FRET biosensor by fluorescence cross-correlation spectroscopy technique (FCCS). Monitoring the activity of certain proteins may be difficult due to their low expression in living sample and their sub-cellular localization. The FCCS methods requires a low concentration of fluorophores and can therefore be adapted to these samples. FRET has a direct effect on the cross-correlation amplitude when it is measured by following the co-diffusion of two fluorescent proteins attached to a same biosensor. An amplitude ratio decrease, of the autocorrelation curves (green or red) on the amplitude of the cross-correlation curve, corresponds to the presence of FRET. We were able to measure this ratio decreases in cells expressing the FRET biosensor Aurora A wild type (FRET) compared to the K162M mutant one (non-FRET). These first results are very promising to monitor the activity of a weakly expressed protein in living cells biosensor using this approach. The improvement of FRET biosensor monitoring, by quantitative fluorescence microscopy methods presented in this work, will help to answer biological questions of interest requiring the measurement of multiplex FRET monitoring or biosensors at low level expression, where conventional techniques are facing these limitations
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