Depuis une dizaine d’années, les technologies de champ proche appliquées à la spectroscopie infrarouge ont connu de rapides progrès permettant d’atteindre maintenant l’échelle du nanomètre. Dans le cadre de ma thèse, l’une de ces techniques, appelées AFM-IR et qui consiste à un couplage entre la microscopie à force atomique (AFM) et un laser accordable dans le domaine de l’infrarouge, va être présenté plus en détail.Le but de ma thèse va être de présenter les différents développements qui ont eu lieu dans le domaine de cette technique, comme l’AFM-IR en résonance forcée, l’AFM-IR en mode tapping ou les débuts du développement de l’AFM-IR avec des sources spectralement continues. Ces développements majeurs ont eu pour conséquence de populariser la technique et de voir une rapide augmentation du nombre d’utilisateurs. Cependant l’AFM-IR reste une technique récente et non triviale à maitriser, car elle demande à la fois des connaissances en AFM, mais aussi en spectroscopie infrarouge.Les dernières avancées technologiques ont permis de s’approcher de la résolution nanométrique. Les conséquences sont multiples et notamment cela permet d’ouvrir la technique à de nouveaux champs d’applications. Or qui dit nouveaux domaines dit nouvelles problématiques, mais surtout nouveaux challenges expérimentaux. Il est donc important d’identifier les verrous technologiques et limitations associés à ces développements pour garder un esprit critique sur ce qui peut être ou non obtenu en AFM-IR et éviter des erreurs d’interprétation et/ou d’analyse qui pourraient avoir des conséquences néfastes dans les champs d’applications étudiés. / For 10 years, near-field technologies applied to infrared spectroscopy have reached milestones and now are able to make analysis at nanoscale. In my PhD thesis, I will focus on one of these techniques: the so-called AFM-IR technique which combined an atomic force microscope (AFM) with a pulse laser tunable in the infrared spectral range.The main goal of my PhD thesis will be to present the last developments which appears for this technique such as resonance enhanced AFM-IR, tapping mode AFM-IR or the first measurements of AFM-IR with broadband sources. These developments are major in the field of the technique and have led to high increase of the numbers of users. However, AFM-IR remains a recent and complicated technique where user has to master in the same time atomic force microscopy and infrared spectroscopy.The last technological developments allow measurements at the nanoscale. This has multiple consequences, especially it opens new applications fields. It also generates new problematic and new experimental challenges. As a consequence, it is necessary to understand new technological limitations created by these new developments in order to stay critical of the results obtained with an AFM-IR measurement and avoid analysis and interpretation errors which can have bad consequences on the different fields of study.

Le processus de maturation et de dégradation des ARNm chez les bactéries implique différentes ribonucléases (RNases). Une endoribonucléase a été découverte en 2009 chez Bacillus subtilis appelée RNase Y. Cette RNase joue un rôle central en catalysant la réaction de clivage initiatrice, un clivage endonucléolytique. Les fragments d'ARN issus du clivage par la RNase Y deviennent alors plus sensibles à la dégradation, en 5' et 3', par les exonucléases. En combinant ces différentes techniques, il s'est avéré que la RNase Y semble s'organiser sous forme d'un oligomère ayant une forme en anneau. Cet oligomère est homogène en microscopie, globulaire et structuré en SAXS. Le domaine ID lui n'est pas complètement déstructuré comme le révèle son analyse en SAXS. Il contient des éléments de structure secondaire de type hélice α et ne possède pas de structure tertiaire, comme le concluent respectivement les analyses en CD et RMN. L'analyse en SAXS de la forme dimérique de la RNase Y révèle que le dimère est structuré mais qu'il possède une forme allongée. Les tests d'activité in vitro sur la forme dimérique et oligomérique montre que ces deux formes sont activent. Les images collectées en cryo-microscopie nous permettrons d'obtenir une structure de meilleure résolution de l'oligomère, qui semble être constitué de 8 dimères de RNase Y. / Messenger RNA decay and processing in bacteria involve a set of various ribonucleases (RNases). In Bacillus subtilis, a newly discovered endoribonuclease called RNase Y was shown to play a central role in mRNA decay by catalyzing the initial endonucleolytic cleavage reaction. Its action releases several RNA pieces that are more sensitive to degradation by exoribonucleases. By combination of these different approaches, it was found that RNase Y seems to be organized in a oligomeric form with a ring shape. This oligomer is homogenous in microscopy, globular and structured in SAXS. The intrinsically disordered domain is not completely disordered as we can conclude with the SAXS analysis. It contains some secondary structural elements (α helix) but it has no tertiary structure as we can conclude with CD and NMR analysis respectively. SAXS analysis of the RNase Y dimeric form show that this dimeric form is structured but have a very elongated shape. In vitro activity tests on both oligomeric and dimeric form reveal that these two forms are active. Oligomer cryomicroscopy pictures collected will allow us to get a structure with a better resolution. At the moment, this oligomer seems to be composed by eight RNase Y dimer.

Le 20ème siècle a vu le recul des maladies infectieuses grâce aux antibiotiques. Cependant leur importante utilisation a rendu certaines bactéries, comme Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa (multi)résistantes. Un des moyens de lutte est de réduire la consommation d’antibiotiques ou de cibler ceux qui seront actif sur une souche identifiée. Nous souhaitons développer des surfaces et des dispositifs sensibles pour la détection précoce, rapide de bactéries pathogènes dans des fluides. Cela permettra de limiter la contamination et donc l’usage de médicaments. Ce projet regroupe 3 partenaires qui travaillent en synergie en mettant à profit leur expertise en physico-chimie, chimie de synthèse et microbiologie. Des nano-objets fluorescents, biocompatibles, et sensibles à la croissance bactérienne seront immobilisés sur des surfaces de verre. Ils seront rendus sélectifs de bactéries pathogènes par des traitements post-synthétiques. Il s’agit in fine de mettre au point un dispositif de détection miniaturisé et de tester la résistance aux antibiotiques des pathogènes détectés. / Infectious diseases have recessed during the 20th century thanks to antibiotics. However, some bacterial strains like Staphylococcus aureus or Pseudomonas aeruginosa have become (multi)resistant to antibiotic treatments because of overuse. One way to combat this is to reduce consumption of drugs or to better target those that will eliminate a given strain. We wish to develop sensitive surfaces and devices for the early and rapid detection of pathogenic bacteria in fluids. They will help limit contaminations and the use of drugs. The project gathers 3 partners working in synergy because they combine expertise in physical-chemistry, synthetic chemistry and microbiology. Fluorescent nanoobjects that are biocompatible and sensitive to bacterial growth will be immobilized on glass surfaces. They will be selective for pathogenic bacteria by post-synthetic modifications. The final goal is to build miniaturized sensitive devices that can detect pathogens and further test their resistance to antibiotics.

Les nanostructures métalliques permettent de confiner la lumière à des échelles sub-longueur d’onde grâce à l'excitation de plasmons de surface. Elles ouvrent la voie à de nombreuses applications que ce soit en imagerie, en élaboration de composants photoniques ou en information quantique. Cette thèse porte sur l’étude de nanostructures métalliques, semi-continues ou constituées par des réseaux de trous au désordre contrôlé, et à leur interaction avec des nanocristaux semi-conducteurs colloïdaux particulièrement photostables. En associant plusieurs approches expérimentales complémentaires (spectroscopie en champ lointain, microscopie de champ proche optique, microscopie avec une sonde active de champ proche, caractérisation par microscopie confocale de l’émission de nanocristaux couplés aux surfaces métalliques), nous avons pu mettre en évidence les caractéristiques spécifiques des modes plasmons de ces différentes structures. Pour les réseaux au désordre contrôlé, nous avons en particulier analysé l’apparition progressive de modes localisés intenses et déterminé l’influence de paramètres tels que l’épaisseur de la couche d’or, le diamètre des trous ou la périodicité initiale du réseau. Les résultats expérimentaux obtenus se sont révélés en très bon accord avec les simulations numériques réalisées par FDTD. / Metallic nanostructures allow to confine light at subwavelength scales by the excitation of surface plasmon. They open the way for many applications in imaging, photonic components development and quantum information. This thesis deals with the study of metallic nanostructures, semi-continuous or based on holes gratings with a controlled disorder, and their interaction with colloidal semiconductor nanocrystals that are very photostable. Combining several complementary experimental approaches (far-field spectroscopy, near-field optical microscopy, near-field active probe microscopy, characterization by confocal microscopy of the emission of nanocrystals coupled to the metallic surfaces), we were able to highlight specific characteristics of the plasmon modes of these different structures. For the gratings with a controlled disorder, we have in particular analyzed the emergence of intense localized modes and determined the influence of parameters such as the thickness of the gold layer, the diameter of the holes or the initial periodicity of the grating. The experimental results are in very good agreement with the numerical simulations carried out by FDTD.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 octobre 2023) / Le mémoire s'inscrit dans un contexte de segmentation vasculaire en trois dimensions. Il s'intéresse à l'analyse d'angiogrammes cérébraux de souris acquis par microscopie deux photons in vivo. Le projet vise à départager automatiquement l'appartenance d'un voxel à l'architecture vasculaire cérébrale ou aux autres tissus. La littérature spécifique à la segmentation vasculaire d'angiogrammes acquis par microscopie deux-photons est émergente. Les modèles existants tentent de s'adapter aux limites physiques et biologiques de cette modalité afin d'extraire l'information vasculaire. La performance d'un modèle d'apprentissage profond récent est quantifiée. Les résultats motivent l'exploration des paramètres susceptibles de limiter la qualité et la robustesse de la segmentation. Un nouvel algorithme de segmentation est développé en intégrant la géométrie des vaisseaux sanguins au sein du processus de classification. La pertinence des métriques de segmentation est discutée dans un contexte de débalancement entre la classe vasculaire et les tissus. Le mémoire vise à fournir et comparer des outils numériques permettant de guider la segmentation automatique d'angiogrammes cérébraux acquis par microscopie deux-photons.

Titre de l'écran-titre (visionné le 18 mars 2024) / Depuis plusieurs années, il y a un intérêt croissant pour l'utilisation de l'apprentissage automatique afin d'automatiser différentes tâches d'analyse quantitative d'images en biophotonique. Cependant, les images de microscopie à fluorescence présentent des défis particuliers qui complexifient l'application d'approches d'apprentissage automatique. Notamment, l'acquisition de ces images est coûteuse, leur annotation est complexe, fastidieuse et souvent bruitée, et il peut être difficile de déterminer quel type d'analyse permettra de répondre à la question biologique d'intérêt. Il est donc nécessaire de développer des approches permettant la génération de jeux de données adaptés aux différents défis propres au domaine de l'imagerie en biophotonique. Mon projet consiste à explorer des pistes aidant à considérer les problèmes propres aux données en biophotonique afin de faciliter l'application de l'apprentissage automatique à l'analyse d'images de microscopie. Afin de limiter le temps d'annotation requis lors de la génération d'un jeu de données, une approche d'apprentissage actif considérant le coût d'annotation est développée et évaluée sur un jeu de données simple. Ensuite, un jeu de données d'images de jonction serrée intestinale est généré avec des annotations adaptées, puis analysé à l'aide d'approches d'apprentissage non supervisé. Finalement, un riche jeu de données annoté d'images de super-résolution de protéines synaptiques est construit à l'aide d'un projet de science citoyenne, permettant de prendre en compte la distribution du bruit dans les annotations. Les résultats obtenus témoignent de l'importance d'un jeu de données bien conçu lors de l'application d'approches d'apprentissage actif à l'analyse de données d'imagerie en biophotonique. Notamment, l'inclusion d'experts dans le processus de conception du jeu de données est essentielle à l'acquisition d'annotations significatives permettant de répondre à des questions biologiques. / For several years, there has been growing interest in using machine learning to automate various quantitative image analysis tasks in biophotonics. However, fluorescence microscopy images present particular challenges that complicate the application of machine learning ap-proaches. Notably, the acquisition of these images is costly, their annotation is complex, tedious and often noisy, and it can be difficult to determine which type of analysis will answer the biological question of interest. It is therefore necessary to develop approaches that allow the generation of datasets adapted to the various challenges specific to the field of biophotonics imaging. My project consists in exploring ways to consider the challenges specific to biophotonics datain order to facilitate the application of machine learning to the quantitative analysis of mi-croscopy images. In order to limit the annotation time required when generating a dataset,an active learning approach considering the annotation cost is developed and evaluated on asimple dataset. Then, a dataset of intestinal tight junction images is generated with adapted annotations and analyzed using unsupervised learning approaches. Finally, a rich annotated dataset of super-resolution images of synaptic proteins is constructed using a citizen science crowdsourcing project, allowing a measure of the distribution of noise in the annotations.The results obtained demonstrate the importance of a well-designed dataset when applying active learning approaches to the analysis of imaging data in biophotonics. In particular, the inclusion of experts in the dataset design process is essential for the acquisition of meaningful annotations to answer biological questions.

Les techniques d'apprentissage machine se posent de plus en plus comme des outils importants pour l'automatisation de diverses tâches, allant de tâches de contrôle à des tâches d'analyse de données. Le domaine de la microscopie à fluorescence est aussi un domaine qui avance rapidement, avec de plus en plus de techniques de fine pointe à super-résolution permettant de résoudre des structures biologiques de plus en plus petites. Or, l'expertise requise pour générer de bonnes acquisitions peut sembler une épreuve difficile à surmonter, ce qui peut limiter l'application de ces techniques. Il y a donc un intérêt croissant à utiliser des techniques d'apprentissage machine pour assister le microscopiste, ou même contrôler les acquisitions. Mon projet consiste au développement d'outils qui facilitent l'entrainement des méthodes d'apprentissage machine. Vu la quantité importante de données nécessaires pour entrainer ces méthodes, il est d'intérêt de développer des outils permettant de générer des données d'entrainement. Dans cette optique, pySTED, un simulateur de microscopie de super-résolution STED a été développé. Le simulateur permet de générer des données synthétiques d'images STED, ce qui pourrait permettre d'augmenter des jeux de données. Additionnellement, pySTED a été développé dans le but de permettre l'entrainement d'agents d'apprentissage par renforcement en simulation, dans le but éventuel de déployer ces agents pour contrôler un vrai microscope STED. Les résultats obtenus témoignent de l'utilité d'avoir un simulateur pour l'entrainement d'algorithmes d'apprentissage machine. En effet, le nombre de données requises en entrainement démontre l'importance du simulateur dans un domaine où l'acquisition de données peut être couteuse. / Machine learning techniques are increasingly emerging as important tools for automating a variety of tasks, from control tasks to data analysis. Fluorescence microscopy is also a fast-moving field, with more and more cutting-edge, super-resolution techniques making it possible to resolve ever-smaller biological structures. However, the expertise required to generate good acquisitions can be difficult to acquire, which can limit the application of these techniques. There is therefore growing interest in using machine learning techniques to assist the microscopist, or even control acquisitions. My project involves the development of tools to facilitate the training of machine learning methods. Given the large amount of data needed to train these methods, it is of interest to develop tools for generating training data. With this in mind, pySTED, the STED super-resolution microscopy simulator, has been developed. The simulator can be used to generate synthetic data from STED images, which could be used to augment datasets. In addition, pySTED has been developed to enable the training of reinforcement learning agents in simulation, with the eventual aim of deploying these agents to control a real STED microscope. The results of this work demonstrate the difficulty and importance of using a simulator to train machine learning methods. Indeed, the amount of data required to train machine learning models highlights the importance of having access to a simulation platform for domains where data acquisition can be costly.

Les méthodes actuelles pour détecter et identifier des microorganismes dans un échantillon sont lentes et complexes. Les techniques d'identification bactérienne, par exemple, nécessitent généralement une étape de culture bactérienne, introduisant des délais pouvant dépasser les 48 heures. Dans plusieurs domaines, telles la recherche arctique, la santé et l'industrie agroalimentaire, la lenteur des analyses bactériologiques peut avoir de lourdes conséquences humaines ou financières. Il existe donc un réel intérêt pour la conception de capteurs sensibles permettant d'outrepasser l'étape de culture bactérienne. Par le passé, notre groupe de recherche a développé une technique de biodétection basée sur les modes de galerie de multiples microsphères fluorescentes en suspension libre dans un échantillon. La sensibilité et la robustesse de cette approche permettent d'envisager son intégration dans un biocapteur rapide et portatif. Cependant, la technologie n'est pas assez mature sous sa forme actuelle pour permettre cette intégration. L'objectif de nos travaux de recherche était donc d'intégrer notre technologie dans un système de laboratoire efficace. Pour ce faire, une nouvelle instrumentation optofluidique est proposée. Cette dernière joint un microscope à fluorescence et un système microfluidique conçu pour mélanger une solution de microsphères avec un échantillon contenant des bactéries. Le mélange est réalisé par un micromélangeur utilisant des rainures dont l'orientation et la position sont optimisées pour favoriser la dispersion de particules solides en suspension dans un fluide. Différentes méthodes d'apprentissage machine servant à analyser les modes de galerie de microsphères fluorescentes sont également décrites. En termes de rapidité, ces dernières surpassent de loin l'algorithme IMARI originellement proposé par notre groupe. Au final, l'instrumentation optofluidique et les méthodes d'analyses présentées dans ce mémoire ont permis de détecter la présence de deux types de picocyanobactéries nordiques. Les avancées réalisées pendant la maîtrise confirment donc le potentiel de notre approche et son intégration éventuelle dans un capteur portatif. / The detection and the identification of microorganisms in a liquid sample is, more often than not, a slow and complex process. The current bacterial identification methodologies, for instance, typically require bacterial growth on culture media, a step which introduces delays of 48 hours or more. In fields such as arctic research, healthcare or food production, these delays can beget serious human and financial consequences. Thus, there is a growing interest for sensitive biosensors capable of bypassing the bacterial growth step. Our research group as previously presented a biodetection scheme based on the analysis of the whispering gallery modes of multiple fluorescent microspheres free-floating in the solution under test. The sensitivity and the robustness of this approach promote its eventual use in a fast and portable biosensing device. However, under its current form, our technology still lacks the appropiate maturity to be integrated in such a device. The research presented in this thesis thus aimed at integrating our technology in an effective laboratory system. To that end, an improved optofluidic instrumentation is proposed. It joins a fluorescent microscope to a microfluidic chip capabe of mixing a solution of microspheres with a sample containing bacteria. The mixing if achived via a staggered herringbone mixer with a groove orientation optimized to promote the dispersion of solide microparticles in suspension. Several machine learning algorithms are also proposed to analyse the whispering gallery modes of our free-floating fluorescent microspheres. In terms of analysis speed, these methods outperform, by a great margin, the IMARI algorithm previously proposed by our group. In the end, the proposed instrumentation and algorithms were used to sucessfully detect the presence of two types of arctic picocyanobacteria. The contributions presented in this thesis thus confirm the potential of our biodetection scheme and further pave the way towards portable biosensors.

La microscopie optique permet de visualiser des échantillons biologiques avec une bonne sensibilité et une résolution spatiale élevée tout en interférant peu avec les échantillons. La microscopie par diffusion Raman cohérente (CARS) est une technique de microscopie non linéaire basée sur l’effet Raman qui a comme avantage de fournir un mécanisme de contraste endogène sensible aux vibrations moléculaires. La microscopie CARS est maintenant une modalité d’imagerie reconnue, en particulier pour les expériences in vivo, car elle élimine la nécessité d’utiliser des agents de contraste exogènes, et donc les problèmes liés à leur distribution, spécificité et caractère invasif. Cependant, il existe encore plusieurs obstacles à l’adoption à grande échelle de la microscopie CARS en biologie et en médecine : le coût et la complexité des systèmes actuels, les difficultés d’utilisation et d’entretient, la rigidité du mécanisme de contraste, la vitesse de syntonisation limitée et le faible nombre de méthodes d’analyse d’image adaptées. Cette thèse de doctorat vise à aller au-delà de certaines des limites actuelles de l’imagerie CARS dans l’espoir que cela encourage son adoption par un public plus large. Tout d’abord, nous avons introduit un nouveau système d’imagerie spectrale CARS ayant une vitesse de syntonisation de longueur d’onde beaucoup plus rapide que les autres techniques similaires. Ce système est basé sur un laser à fibre picoseconde synchronisé qui est à la fois robuste et portable. Il peut accéder à des lignes de vibration Raman sur une plage importante (2700–2950 cm-1) à des taux allant jusqu’à 10 000 points spectrales par seconde. Il est parfaitement adapté pour l’acquisition d’images spectrales dans les tissus épais. En second lieu, nous avons proposé une nouvelle méthode d’analyse d’images pour l’évaluation de la structure de la myéline dans des images de sections longitudinales de moelle épinière. Nous avons introduit un indicateur quantitatif sensible à l’organisation de la myéline et démontré comment il pourrait être utilisé pour étudier certaines pathologies. Enfin, nous avons développé une méthode automatisé pour la segmentation d’axones myélinisés dans des images CARS de coupes transversales de tissu nerveux. Cette méthode a été utilisée pour extraire des informations morphologique des fibres nerveuses dans des images CARS de grande échelle. / Optical-based microscopy techniques can sample biological specimens using many contrast mechanisms providing good sensitivity and high spatial resolution while minimally interfering with the samples. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy is a nonlinear microscopy technique based on the Raman effect. It shares common characteristics of other optical microscopy modalities with the added benefit of providing an endogenous contrast mechanism sensitive to molecular vibrations. CARS is now recognized as a great imaging modality, especially for in vivo experiments since it eliminates the need for exogenous contrast agents, and hence problems related to the delivery, specificity, and invasiveness of those markers. However, there are still several obstacles preventing the wide-scale adoption of CARS in biology and medicine: cost and complexity of current systems as well as difficulty to operate and maintain them, lack of flexibility of the contrast mechanism, low tuning speed and finally, poor accessibility to adapted image analysis methods. This doctoral thesis strives to move beyond some of the current limitations of CARS imaging in the hope that it might encourage a wider adoption of CARS as a microscopy technique. First, we introduced a new CARS spectral imaging system with vibrational tuning speed many orders of magnitude faster than other narrowband techniques. The system presented in this original contribution is based on a synchronized picosecond fibre laser that is both robust and portable. It can access Raman lines over a significant portion of the highwavenumber region (2700–2950 cm-1) at rates of up to 10,000 spectral points per second and is perfectly suitable for the acquisition of CARS spectral images in thick tissue. Secondly, we proposed a new image analysis method for the assessment of myelin health in images of longitudinal sections of spinal cord. We introduced a metric sensitive to the organization/disorganization of the myelin structure and showed how it could be used to study pathologies such as multiple sclerosis. Finally, we have developped a fully automated segmentation method specifically designed for CARS images of transverse cross sections of nerve tissue.We used our method to extract nerve fibre morphology information from large scale CARS images.

Les avancées technologiques concernant la microscopie ont permis la création d'une grande variété de systèmes optiques dédiés à l'investigation du comportement dynamique des cellules in vivo. En neuroscience, le dé réside dans l'observation des interactions entre des neurones marqués d'un fluorophore qui sont situés à différentes profondeurs dans le tissu. Afin d'y arriver, il est nécessaire de balayer l'échantillon sur plusieurs plans transverses pour couvrir entièrement son volume. Puisque cette procédure diminue la résolution temporelle, il a été proposé d'utiliser un axicon pour augmenter la profondeur de champ du microscope et réduire le nombre de balayages à effectuer. Cependant, l'axicon est di cile à fabriquer et possède généralement des défauts sur la pointe du cône, dégradant ainsi la qualité de la composante. En vue de remplacer l'axicon par une autre composante optique dont la fabrication n'entraîne pas de défaut, il a été envisagé d'utiliser une lentille à gradient d'indice couplée à une lentille simple (GRIN-axicon). Des simulations ont montré que le GRIN-axicon a le potentiel de produire un faisceau Bessel de bonne qualité. Toutefois, les tests expérimentaux ont été très brefs et il est nécessaire d'investiguer davantage le comportement de cette nouvelle composante en laboratoire. L'objectif de ce projet de maîtrise est donc de concevoir, fabriquer et caractériser un GRIN-axicon pour une application en microscopie multiphotonique. Comme objectif secondaire, on souhaite approfondir la théorie reliée à cette nouvelle composante. / Technological advances in microscopy have led to the creation of a wide variety of optical systems dedicated to the investigation of the dynamic behavior of cells in vivo. In neuroscience, the challenge lies in the observation of interactions between labeled neurons located at different depths in the tissue. In order to achieve this, it is necessary to scan the sample on several transverse planes to fully cover its volume. Since this procedure decreases the temporal resolution, it has been proposed to use an axicon to increase the depth of field of the microscope and reduce the number of scans to be performed. However, the axicon is di cult to manufacture and usually has defects on the tip of the cone, thus degrading the quality of the component. In order to replace the axicon by another optical component easier to manufacture, the use of a graded index lens coupled to a single lens (GRIN-axicon) was considered. Simulations have shown that the GRIN-axicon has the potential to produce a good quality Bessel beam. However, experimental tests have been very limited and it is necessary to further investigate the behaviour of this new component in the laboratory. The objective of this master's project is therefore to design, manufacture and characterize a GRIN-axicon for application in multiphoton microscopy. As a secondary objective, we wish to deepen the theory related to this new component.