La maturation des fruits est un processus complexe, principalement régulé par l'hormone végétal éthylène, qui entraîne d'importants changements métaboliques et physiologiques, ayant pour résultat la dispersion des graines. Le changement le plus visible qui se produit pendant la maturation des fruits est le changement de couleur. L'organite responsable de ce phénomène est le chromoplaste, lieu d’accumulation des caroténoïdes. Toutefois, ce n'est pas son unique rôle. Il a été montré qu’il est aussi impliqué dans la biosynthèse des lipides, de l’amidon, des vitamines et des arômes. Parce que la plupart des protéines (95%) qui composent le protéome du chromoplaste sont codées par le noyau, l’approche génomique n'est pas suffisante pour connaître les fonctions de chromoplaste dans la synthèse des métabolites d'intérêt. La protéomique de haut débit associée à la bio- nformatique a été utilisée pour caractériser le chromoplaste de tomate. L’analyse du protéome de chromoplastes de fruits de tomate rouges a révélé la présence de 988 protéines correspondantes à 802 unigènes d’Arabidopsis, dont 209 n’ont pas été répertoriés jusqu'à présent dans des banques de données plastidiales. Ces données ont révélé plusieurs caractéristiques du chromoplaste. Les protéines du métabolisme des lipides et de trafic sont bien représentées, y compris toutes les protéines de la voie de la lipoxygénase nécessaire à la synthèse des arômes volatiles dérivés de lipides. Les protéines impliquées dans la synthèse de l'amidon coexistent avec plusieurs protéines qui dégradent l'amidon. Les chromoplastes ne contiennent plus les protéines de biosynthèse de la chlorophylle mais contiennent des protéines impliquées dans la dégradation de la chlorophylle. Aucun des protéines impliquées dans le mécanisme de transport thylacoïdal n’ont été trouvées. Étonnamment, les chromoplastes contiennent l'ensemble des protéines du cycle de Calvin, y compris la Rubisco, ainsi que la voie des pentoses phosphates (OxPPP). L'analyse de l'évolution du transcriptome des gènes codant pour des protéines chromoplastiques a été réalisée. Ces données ont confirmé la réduction de la photosynthèse et le maintien du cycle de Calvin, ainsi que la biosynthèse de l'amidon et des lipides. Des analyses biochimiques complémentaires ont montré dans des chromoplastes isolés la présence d’une activité de deux enzymes importantes dans la biosynthèse des arômes (lipoxygénase et l'alcool déshydrogénase). Par ailleurs, à l’aide du couplage de protéines à la GFP et à leur expression dans des protoplastes, nous avons montré que des protéines ne présentant pas de peptide signal peuvent être localisées dans le chromoplaste. Enfin, un protocole d'isolement des plastes de fruits de tomate à différents stades de maturation a été mis au point et les fractions plastidiales ainsi obtenues ont été caractérisées par la microscopie confocale à balayage laser. La transition du chloroplaste à chromoplaste est un processus qui n'a jamais été décrit par la protéomique. Ce travail est en cours et devrait répondre à certaines questions concernant les changements qui ont lieu dans l'organite, et apporter des informations nouvelles pour la compréhension de la maturation des fruits. / Fruit ripening is a complex process, mainly regulated by the fruit hormone ethylene, resulting in significant metabolic and physiological changes, having as outcome seed dispersal. The most flagrant change taking place during ripening is the change in color. The organelle responsible for this is the chromoplast, the place of carotenoids accumulation. However this is not its unique role. It was found to be involved in lipid, starch, vitamins and aroma biosynthesis. Due to the fact that most proteins (95%) composing the chromoplast are codified by the nucleus knowledge on gene expression and genome sequences is not useful in the investigation of the functions of chromoplast in the synthesis of the metabolites of interest. High- hroughput proteomics associated with bio-informatics was used to characterize the tomato chromoplast and to reveal its intimate structure. Analysis of the proteome of red fruit chromoplasts revealed the presence of 988 proteins corresponding to 802 Arabidopsis unigenes, among which 209 had not been listed so far in plastidial data banks. These data revealed several features of the chromoplast. Proteins of lipid metabolism and trafficking were well represented, including all the proteins of the lipoxygenase pathway required for the synthesis of lipid-derived aroma volatiles. Proteins involved in starch synthesis co- xisted with several starch-degrading proteins and starch excess proteins. Chromoplasts lacked proteins of the chlorophyll biosynthesis branch and contained proteins involved in chlorophyll degradation. None of the proteins involved in the thylakoid transport machinery were discovered. Surprisingly, chromoplasts contain the entire set of Calvin cycle proteins including Rubisco, as well as the oxidative pentose phosphate pathway (OxPPP). The analysis of the evolution of the transcriptome of chromoplastic protein-encoding genes was performed. This data confirmed the reduction of the photosynthesis and the maintenance of the Calvin cycle, and of the lipid and starch biosynthesis. Further analysis is performed showing the activity of two important actors in the aroma biosynthesis (lipoxygenase and alcohol dehydrogenase). Several proteins with possible chromoplastic location were coupled with the GFP and expressed in the single cell system. A protocol for isolating tomato fruit chloroplasts and immature chromoplasts was described along with the characterization of the plastidial fractions by confocal microscopy. The transition of the chloroplast to chromoplast is a process that was never described by means of proteomics. This work answers some questions regarding the changes that take place in the organelle, and brings novel information for the understanding of fruit ripening process

Le virus de la mosaïque jaune du navet (TYMV) possède un génome monopartite constitué d’ARN de polarité positive codant pour trois protéines, dont seule la polyprotéine 206K est indispensable à la réplication virale.Elle subit une maturation protéolytique, générant les protéines 140K et 66K, localisées au niveau de l’enveloppe des chloroplastes, siège de la réplication virale.Adressée aux chloroplastes, la protéine 140K y recrute la 66K et se comporte comme une protéine intégrale membranaire.Le domaine d’adressage aux chloroplastes (DAC) de la protéine 140K a été défini grâce à la transfection et à des protoplastes d’Arabidopsis thaliana par différentes constructions codantpour des versions délétées de la protéine fusionnées à l’EGFP, et à leur observation en microscopie confocale. Le DAC comprend deux hélices alpha amphipathiques dont la présence a été attestée par dichroïsme circulaire. Leur nécessité pour la localisation aux chloroplastes, l’association aux membranes et la réplication virale, a été étudiée. Différents patterns de distribution subcellulaire de la protéine 140K ont été observés. Ils sont corrélés au taux d’expression de la protéine. Sa dimérisation a également été démontrée.L’implication d’autres résidus du DAC dans la localisation subcellulaire, la dimérisation et la réplication virale, a également été recherchée. / Turnip yellow mosaic virus (TYMV) is a positive single-stranded RNA virus. Among the three ORFs encoded by the TYMV genome, 206K is the only protein required for viral replication. It is cleaved into 140K and 66K, which are both present at the chloroplast envelope membrane, where viral replication takes place.The 140K protein is targeted to chloroplasts, where it recruits 66K, and behaves as an integral membrane protein. The chloroplast targeting domain (DAC) of the 140K protein was defined using Arabidopsis thaliana protoplasts transfected by various constructs encoding deleted versions of 140Kfused to EGFP and subsequent confocal microscopy. The DAC comprises two amphipathic alpha helices, as confirmed by circular dichroism. Their involvement in chloroplast localisation and membrane association has been assessed, as well as their contribution to viral replication.We observed different subcellular distribution patterns of 140K protein, which correlate with the expression level of the protein. Its capability to dimerize has also been demonstrated.The involvement of other DAC residues in subcellular localisation, dimerization and viral replication has been studied.

Soils represent an essential habitat for a wide diversity of invertebrates. Among these organisms, termites are considered ecosystem engineers for their impact on nutrient cycling and soil functioning, stemming from their wide feeding habits. For instance, soil/litter-feeding termites are one of the groups that incorporate the most organic matter from the soil. Thus, the high abundance and diversity of this group of termites does not only indicate its ecological success, but also its high value for the ecosystem. TheApicotermitinae subfamily (family Termitidae) is a highly diverse group of soil-feeding termites widespread in Afro- and Neotropical regions. However, due to taxonomic difficulties in soldierless groups and poor sampling of species living deep in the soil, it is also one of the most understudied subfamilies. In this thesis, I addressed phylogenetic, anatomical, and ecological aspects of the Apicotermitinae, with the ultimate goal of explaining their high diversity and ecological success. In the first axis, we investigated the phylogenetic relationships of Apicotermitinae species by using de novo mitochondrial genomes. African taxa with soldiers form several basal branches. We confirmed the monophyly of Asian and neotropical lineages, resulting from two independent dispersal events from tropical Africa, and established the relationships of the main lineages in the subfamily. The relationships among and within some genera remain unresolved, probably revealing an explosive radiation. Some genera appear as polyphyletic, showing the need for further taxonomic revision. In the second axis, we described for the first time in detail the anatomical structures of the gizzard. Thepulvillar belt bears a highly diverse, sclerotized and autofluorescent structures. These structures and the ornamentation patterns remain limited to African species since the Neotropical species do not present such specialized structures. Consequently, these ornamentations are proposed as a new complementary taxonomic tool, which can prove useful in the future revisions of genera with phylogenetic incongruences. In the third axis, we characterized the content of crop-gizzard and inferred the isotopic niche of species. Slight variations in the food content suggested that Apicotermitinae can be considered as a single feeding group, with mineralized soil as a primary source. Variations in the crop-gizzard volume can be related to food-collecting behavior. The neotropical species exhibited the broadest isotopic spaces, indicating flexibility to explore large organic matter humification gradients. The broad overlap of isotopic niches and co-occurrence with other termites suggests that this group could be affected by spatial segregation. Finally, in an evolutionary context, it was inferred that the Neotropical soldierless taxa underwent an explosive radiation during the early-middle Miocene. While the reduction of sclerotized structures in the gizzard is associated with the dispersal towards the Neotropics, the African soldierless species developed a pulvillar armature. All of these results provide an overview of the understanding of Apicotermitinae and open up new perspectives on the evolutionary and functional aspects of associations in favor of diet as an agent of their success. / Les sols représentent un habitat essentiel pour une grande diversité d'invertébrés. Parmi ceux-ci, les termitessont considérés comme des ingénieurs de l'écosystème, pour leur impact sur le cycle des nutriments ainsique sur le fonctionnement du sol. Ce rôle écologique majeur est du fait entre autres de la grande diversitéde leur régime alimentaire. Les termites qui se nourrissent de sol et/ou de litière constituent l'un des groupesqui incorpore le plus de matière organique depuis le sol. Ainsi, l'abondance et la diversité élevées de cegroupe de termites indiquent non seulement leur succès écologique, mais aussi leur forte valeur pour lesécosystèmes. La sous-famille des Apicotermitinae (Termitidae) constitue un groupe de termites humivorestrès abondant et diversifié dans les régions afrotropicale et néotropicale. Cette sous-famille est pourtant peuétudiée, du fait des difficultés taxonomiques rencontrées pour les termites sans soldats, mais aussi desdifficultés d’échantillonnage associées aux espèces propres aux sols plus profonds. Le présent travail dethèse se veut être une étude de la diversité des Apicotermitinae selon trois axes, à savoir phylogénétique,anatomique et écologique, dans le but d'expliquer les tenants et aboutissants de la grande diversité desApicotermitinae, ainsi que les raisons de leur succès écologique.Dans le premier axe de la thèse, nous avons étudié les relations phylogénétiques entres les différentesespèces d’Apicotermitinae à l’aide de génome mitochondriaux assemblé de novo. Les taxa africains avecsoldats forment plusieurs branches basales. Nous avons confirmé la monophylie des lignées asiatique etnéotropicale, qui résultent de deux colonisations indépendantes au départ de l'Afrique, et établi les relationsentre les principales lignées de la sous-famille. Les relations, entre ou au sein, de certains genres sont malrésolues et correspondraient à une explosion radiative. Plusieurs genres apparaissent commepolyphylétiques, montrant le besoin d’une révision taxonomique future.Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons décrit pour la première fois en détail les différentesstructures anatomiques du gésier. La ceinture pulvillaire porte des structures très diverses, sclérifiées etauto-fluorescentes. Ces ornementations sont proposées comme un nouvel outil taxonomiquecomplémentaire, qui serait utile pour les révisions requises dans les genres problématiques susmentionnés.Ces structures et les motifs d'ornementation restent toutefois limités aux espèces africaines, les espècesnéotropicales ne présentant pas de structures spécialisées.Concernant le troisième axe de la thèse, nous avons caractérisé le contenu du jabot-gésier et estimé la nicheisotopique de différentes espèces. Les légères variations du contenu suggèrent que les Apicotermitinaepartagent sensiblement le même régime alimentaire, en ingérant une quantité importante de sol minéralisé.Les variations du volume du jabot-gésier peuvent être liées au comportement de collecte des aliments. Lesespèces néotropicales montrent une étendue des niches isotopiques plus large, ce qui indique la possibilitéd'exploiter plusieurs niveaux d’humification de la matière organique. Le large chevauchement des nichesisotopiques et la co-occurrence avec d'autres termites suggèrent que les espèces de ce groupe tendraient àse ségréger spatialement.Enfin, dans un contexte évolutif, il a été estimé que le groupe des espèces néotropicales sans soldats a subiune explosion radiative au début du Miocène moyen. Alors que la réduction des structures fortementsclérifiées dans le gésier est associée à la dispersion vers les Néo-tropiques, les espèces africaines sanssoldats ont développé une armature pulvillaire. L'ensemble de ces résultats donne un aperçu de lacompréhension des Apicotermitinae et ouvre de nouvelles perspectives quant à des aspects évolutifs etfonctionnels des associations en faveur du régime alimentaire en tant qu'agent de leur succès. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules murales du cerveau sont un groupe de cellules neurovasculaires qui présentent une hétérogénéité moléculaire, morphologique et fonctionnelle exceptionnelle. Celles en contact avec les plus petis vaisseaux du cerveau, les péricytes du lit capillaire moyen sont connues pour être essentielles à l'homéostasie cérébrale, bien que leur capacité contractile ait longtemps été débattue. Cependant, nombre de leurs propriétés physiologiques, telles que leurs mécanismes de signalisation calcique, n'ont pas encore été élucidées. Cette thèse vise donc à identifier les mécanismes cellulaires de la signalisation calcique des péricytes des capillaires cérébraux. Dans le chapitre 2, nous utilisons la pharmacologie et l'imagerie des péricytes cérébraux exprimant l'indicateur de calcium GCaMP6f (provenant de souris transgéniques PDGFRβ-Cre::GCaMP6f) pour découvrir ces mécanismes. Contrairement aux péricytes engainants dont la signalisation du calcique dépend des canaux calcique voltage-dépendants, nous constatons que les signaux calcique des péricytes capillaire moyen sont indépendants des canaux calcique voltage-dépendants. Au contraire, nous constatons que les signaux calciques transitoires des pericytes du lit capillaire moyen sont inhibés par l'élimination du Ca2+ extracellulaire, l'inhibition des canaux Orai opérés par les réserves, le blocage du remplissage des réserves du réticulum endoplasmique, ainsi que l'inhibition des récepteurs de la ryanodine (RyRs) et des récepteurs de l'inositol trisphosphate (IP3Rs). Nous constatons également que l'entrée de Ca2+ opérée par les réserves peut être induite par la déplétion des réserves du réticulum endoplasmique et inhibée par les bloqueurs d'Orai dans les pericytes du lit capillaire moyen, et que l'influx basal de Ca2+ est largement dépendant de la déplétion des réserves. Enfin, nous montrons que l'entrée de Ca2+ opérée par les réserves d'Orai amplifie les élévations de Ca2+ cytosolique en réponse au vasoconstricteur endothéline-1. Nous concluons que la signalisation calcique dans les pericytes du lit capillaire moyen, qu'elle soit spontanée ou induite de façon agoniste, est régulée par le couplage entre la libération des réserves du réticulum endoplasmique et les voies d'influx opérées par les réserves. / Brain mural cells are a grouping of neurovascular cells that display exceptional molecular, morphological, and functional heterogeneity. Mid-capillary pericytes, the mural cells which contact the smallest vessels of the brain, are known to be critical to brain homeostasis, and their contractile ability has long been debated. However, many of their physiological properties, such as their Ca2+ signaling mechanisms, have not been elucidated. This thesis aims to uncover the cellular mechanisms of brain mid-capillary pericyte Ca2+ signaling. In chapter 2, we harness pharmacology and imaging of brain pericytes expressing the calcium indicator GCaMP6f (from transgenic PDGFRβ-Cre::GCaMP6f mice) to uncover these mechanisms. In contrast to ensheathing pericytes whose Ca2+ signaling is dependent on voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs), we find that mid-capillary pericyte Ca2+ signals are independent of VGCCs. Instead, we find that mid-capillary pericyte Ca2+ transients are inhibited by removal of extracellular Ca2+, inhibition of store-operated Orai channels, blockade of endoplasmic reticulum store filling, as well as inhibition of ryanodine receptors (RyRs) and inositol triphosphate receptors (IP3Rs). We further find that store-operated Ca2+ entry can be induced by endoplasmic reticulum store depletion and inhibited by Orai blockers in mid-capillary pericytes, and that basal Ca2+ influx is largely dependent on store depletion. Finally, we show that Orai store-operated Ca2+ entry amplifies cytosolic Ca2+ elevations in response to the vasoconstrictor endothelin-1. We conclude that both spontaneous and Gq-coupled protein receptor agonist-induced Ca2+ signaling in mid-capillary pericytes is regulated by coupling between endoplasmic reticulum store release and store-operated influx pathways.

Notre projet vise à élucider la relation complexe entre la morphologie des nerfs cornéens et la sensibilité cornéenne, afin d'améliorer la compréhension et le diagnostic des pathologies oculaires. En utilisant deux types d'esthésiomètres : l'esthésiomètre sans contact (NCCA) et le Cochet-Bonnet (CBA) pour mesurer la sensibilité, et en analysant les images de microscopie confocale (IVCM) via le logiciel CCMetrics, nous avons étudié 23 individus, y compris ceux souffrant de diabète et de kératite neurotrophique. Des corrélations négatives significatives entre certains attributs neuronaux et la sensibilité cornéenne ont été identifiées. L'utilisation d'algorithmes d'apprentissage automatique, tels que K-Plus Proches Voisins (KNN), les Réseaux de Neurones (MLP), la Régression à Vecteurs de Support (SVR) et les arbres de décision, a révélé des relations non linéaires complexes. Notre étude encourage l'utilisation de l’apprentissage automatique pour détecter ces relations complexes dans le domaine médical en général et en ophtalmologie en particulier. / Our project aims to clarify the complex relationship between the morphology of corneal nerves and corneal sensitivity, to improve understanding and diagnosis of eye pathologies. We used two types of esthesiometers: a non-contact esthesiometer (NCCA) and Cochet-Bonnet (CBA) for sensitivity measurement and analyzed confocal microscopy (IVCM) images using the software CCMetrics. We studied 23 individuals, including those with diabetes and neurotrophic keratitis. Significant negative correlations between certain neuronal attributes and corneal sensitivity were identified. The use of machine learning algorithms, such as K-Nearest Neighbors (KNN), Neural Networks (MLP), Support Vector Regression (SVR), and decision trees, revealed complex non-linear relationships. Our study advocates using machine learning to detect these complex relationships in the medical field, especially in ophthalmology.

Les neurones sont des cellules excitables capables de coder et transmettre l’information sous forme d’oscillations du potentiel membranaire. Cette activité électrique est produite par une modification des flux ioniques transmembranaires. Les neurones constituent un exemple d’oscillateur cellulaire dont la dynamique non linéaire permet l’apparition d’une activité électrique complexe. Dans ce système, les ions calciques sont des messagers intracellulaires importants. Ils servent de médiateur entre un signal électrique et un signal chimique, par une modulation de l’activité enzymatique de certaines protéines. Ils interviennent dans de nombreuses fonctions neuronales, dont l’excitabilité électrique. Un des mécanismes mis en place par les neurones pour contrôler l’homéostasie du calcium intracellulaire provient de protéines cytoplasmiques capables de lier les ions calciques. Ces protéines jouent un rôle de « tampon » du calcium. Cependant, toutes leurs fonctions n’ont pas encore été mises en évidence. C’est l’objectif de notre travail. Nous avons voulu comprendre le rôle joué par une protéine « tampon » particulière, la calrétinine, sur le mode de décharge électrique d’un neurone où elle est exprimée en abondance, le grain cérébelleux. Pour cela, nous avons utilisé une approche théorique et expérimentale. <p>Au niveau théorique, nous avons élaboré un modèle mathématique de l’activité électrique du grain cérébelleux, prenant en compte la chélation du calcium intracellulaire. Il permet de clarifier le rôle de la chélation du calcium intracellulaire sur les oscillations du potentiel membranaire. La modélisation de l’activité électrique du grain cérébelleux repose sur le formalisme développé par Hodgkin et Huxley pour l’axone géant de calmar. Dans ce contexte, l’application de la conservation de la charge au circuit équivalent de la membrane cellulaire fournit un système d’équations différentielles ordinaires, non linéaires. Dès lors, notre modèle nous a permis d’étudier l’impact des variations de la concentration de chélateur calcique sur les oscillations du potentiel membranaire. Nous avons ainsi pu constater qu’une diminution de la concentration en chélateur calcique induisait une augmentation de l’excitabilité électrique du grain cérébelleux, sans altérer le régime d’oscillations. Par contre, en augmentant fortement la concentration en chélateur calcique, nous avons montré que le grain cérébelleux changeait de dynamique oscillatoire, montrant des transitions d’un mode de décharge périodique régulier vers des oscillations en salve du potentiel membranaire.<p>Au niveau expérimental, nous avons vérifié les résultats prévus par le modèle théorique. Nous avons ainsi montré que des grains de souris transgéniques déficientes en calrétinine présentaient une excitabilité électrique accrue par rapport aux grains contrôles.<p>Puis, en restaurant un niveau de chélation calcique normal dans ces grains, par perfusion intracellulaire de chélateur calcique, nous montrons qu’ils retrouvent un niveau d’excitabilité normal. Ensuite, nous avons introduit dans des grains cérébelleux de souris sauvages, une forte concentration en chélateur calcique exogène. Conformément aux résultats théoriques, nous avons pu observer des transitions vers des oscillations en salve du potentiel membranaire. Enfin, nous avons montré que l’absence de calrétinine affecte les paramètres morphologiques du grain cérébelleux des souris transgéniques déficientes en calrétinine.<p>En conclusion, ces résultats suggèrent que le mode de décharge des cellules excitables peut être modulé d’une façon importante par les protéines liant le calcium. De ce fait, des changements dans le niveau d’expression et/ou dans la localisation subcellulaire des protéines liant le calcium pourraient aussi jouer un rôle critique dans la régulation de processus physiologiques contrôlés par l’excitabilité membranaire. De plus, les mécanismes que nous avons mis en évidence pourraient être à l’origine d’un nouveau principe de régulation de la signalisation dans les circuits neuronaux et pourraient jouer un rôle fonctionnel dans le contrôle du codage de l’information et de son stockage dans le système nerveux central. / Doctorat en sciences, Spécialisation physique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La gélification thermique de protéines globulaires (albumine de sérum bovin (SAB) et β-Lactoglobuline) en mélange avec la pectine faiblement méthylée (pectine LM) a été étudiée par rhéologie et microscopie confocale à balayage laser couplée à une analyse d'image par la méthode de co-occurrences. Les propriétés des biopolymères seuls ont également été décrites. La différence entre le comportement des deux protéines globulaires en mélange a également été étudiée. La structure des gels de SAB, caractérisée par diffusion de la lumière, varie fortement selon la teneur en NaCl ou CaCl₂. Dans les mélanges, une compétition entre les cinétiques de gélification protéique et de séparation de phase est observée. Celle-ci est fortement dépendante des facteurs intrinsèques et extrinsèques du système, et en particulier de la teneur et la nature des sels ajoutés (NaCl et/ou CaCl₂). L'augmentation de concentration en pectine se traduit par une séparation de phase plus marquée. Selon les conditions de concentrations en biopolymères et la nature des sels dans le milieu, le gel de protéine est affaibli ou renforcé par la présence du polyoside. En présence de calcium, les deux biopolymères présentent une affinité spécifique pour ce cation qui se traduit, pour les pectines LM, par leur capacité à gélifier. En mélange, un gel composite est alors formé. Selon la teneur en NaCl, la gélification du mélange est gouvernée par celle des protéines ou celle des pectines LM. L'ensemble des résultats permet de proposer un schéma d'interprétation des mécanismes impliqués dans la formation des gels en mélange au cours du processus thermique basée sur la séparation de phase et la gélification des biopolymères.

Le syndrome de l'intestin irritable (SII) touche près de 10% de la population. Nous avons utilisé un modèle animal de SII induit par le butyrate développé au laboratoire afin de décortiquer les mécanismes de l'hypersensibilité colique (HSC) dans le SII. Le blocage du NGF par des anticorps anti-NGF prévient l'HSC induite par le butyrate, évaluée par le test de distension colorectale. Le NGF, quantifié par immunohistochimie (IHC), est surexprimé dans les ganglions rachidiens dorsaux (GRD) innervant le côlon des rats butyrate. Le blocage des canaux ASIC par amiloride prévient l'HSC induite par le butyrate. L'expression des ARNm ASIC1a et ASIC1b, évaluée par RT-PCR, est augmentée dans les GDR des rats butyrate. Cette augmentation est corrélée à une augmentation de l'expression de la protéine ASIC1A dans les neurones nociceptifs, quantifiée par IHC. Le blocage du NGF par des anticorps anti-NGF prévient la surexpression de ASIC1A dans les GRD. L'absence de variation d'expression du NGF et de ASIC1A au niveau colique suggère que ces moléciles ont une implication dans l'élément présynaptique plutôt que dans les terminaisons libres coliques. L'étude de l'expression spinale de la protéine Fos après stimulation des fibres coliques a montré que l'HSC induite par le butyrate est associée à une activation spécifique des segments thoraciques T10-T11-T12 de la moëlle épinière (MEp). Le blocage spinal du canal ASIC1A par la PcTx1 prévient l'HSC induite par le butyrate. L'expression de ASIC1a, évaluée par RT-PCR et Western blot, est augmentée dans la MEp des rats butyrate. Comme à la périphérie, l'expression de ASIC1a est modulée par le NGF puisque le blocage du NGF prévient la surexpression des ARNm et de la protéine ASIC1A dans la MEp des rats butyrate. En conclusion, ce travail de thèse suggère que le NGF et le canal ASIC1A jouent un rôle critique dans le développement de douleurs viscérales en contribuant à la fois à la sensibilisation périphérique et centrale.

Au cours des dernières années, un intérêt grandissant concernant les rôles physiologiques des endocannabinoïdes (eCBs) a été observé. Le système eCB est une cible attrayante pour la modulation du système immunitaire et de la douleur périphérique. Bien que le récepteur CB1 soit distribué dans le système nerveux, le récepteur CB2 est traditionnellement associé au système immunitaire. Ce dogme fait maintenant l’objet d’un débat depuis la découverte de l’expression du récepteur CB2 dans certains neurones. La rétine est un modèle important pour l’étude de processus neuronaux. La présence du récepteur CB1 y a été démontrée. Des études fonctionnelles rapportent que l’activation des récepteurs cannabinoïdes affecte le fonctionnement de plusieurs cellules rétiniennes. À ce jour, aucune étude ne s’est intéressée au rôle global des récepteurs CB1 et CB2 dans la rétine. Nous avons investigué les conséquences de l’élimination du récepteur CB1 (cnr1-/-) ou du récepteur CB2 (cnr2-/-) sur la fonction rétinienne mesurée par électrorétinographie. Nous avons également caractérisé la distribution du récepteur CB2 dans la rétine. Pour ce faire, nous avons comparé la spécificité de plusieurs anticorps dirigés contre le récepteur CB2. Seulement l’un des anticorps testés a montré une spécificité satisfaisante. Il a permis de détecter la présence du récepteur CB2 dans les cônes, les bâtonnets, les cellules horizontales, amacrines, bipolaires et ganglionnaires. Nos résultats d’électrorétinographie indiquent que seules les souris cnr2-/- présentent une amplitude accrue de l’onde a des ERG, en conditions scotopiques. En conditions photopiques, l’amplitude de l’onde b des souris cnr2-/- montre un schéma d’adaptation à la lumière différent des autres groupes. Aucun effet significatif n’a été observé chez les animaux cnr1-/-. Ces résultats permettent de conclure que les récepteurs CB1 et CB2 jouent des rôles différents dans le traitement visuel et que le récepteur CB2 semble être impliqué dans l’établissement des réponses rétiniennes. / Cannabinoid receptors (CB1R and CB2R) are among the most abundant G-protein coupled receptors in the central nervous system. The endocannabinoid system is an attractive target for immune system modulation and peripheral pain management. While CB1R is distributed in the nervous system, CB2R has traditionally been associated to the immune system. This dogma is currently a subject of debate since the discovery of CB2R expression in neurons. The retina is an interesting model for neuronal processes’ study. The activation of cannabinoid receptors modulates neurotransmitter release from photoreceptors and could also affect bipolar cell synaptic release. However, the impact of CB1r and CB2R on the retinal function as a whole is currently unknown. In the present study, we investigated the function of cannabinoid receptors in the retina by recording electroretinographic responses (ERG) from mice lacking either CB1 or CB2 receptors (cnr1-/- and cnr2-/-, respectively). We also documented the precise distribution of CB2R by comparing the specificity of library of CB2R antibodies. One of the antibodies tested exhibited a valuable specificity and localized CB2R expression in cones and rods photoreceptors, horizontal cells, some amacrine cells, and bipolar and ganglion cells. In scotopic conditions, the amplitudes of the awave of the ERG were increased in cnr2-/- mice, while they remained unchanged in cnr1-/- mice. Under photopic conditions, b-wave amplitudes of cnr2-/- mice required more light adaptation time to reach stable values. No effect was observed in cnr1-/- mice. These data indicate that CB2R is likely to be involved in shaping retinal responses to light and suggest that CB1 and CB2 receptors could have different roles in visual processing.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de mortalité dans les pays industrialisés. L'hypercholestérolémie constitue un facteur de risque majeur pour les MCV. Elle est caractérisée par des niveaux élevés de lipoprotéines de faible densité (LDL, aussi appelé “mauvais cholestérol”). La présence prolongée de haut niveaux de LDL dans la circulation augmente le risque de formation de plaques athérosclérotiques, ce qui peut conduire à l'obstruction des artères et l'infarctus du myocarde. Le LDL est normalement extrait du sang par sa liaison au récepteur du LDL (LDLR) qui est responsable de son endocytose dans les hépatocytes. Des études génétiques humaines ont identifié PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) comme le troisième locus responsable de l'hypercholestérolémie autosomique dominante après le LDLR et son ligand l’apolipoprotéine B-100. PCSK9 interagit avec le LDLR et induit sa dégradation, augmentant ainsi les niveaux plasmatiques de LDL. Les mutations gain de fonction (GF) de PCSK9 sont associées à des niveaux plasmatiques élevés de LDL et à l'apparition précoce des MCV, alors que les mutations perte de fonction (PF) de PCSK9 diminuent le risque de MCV jusqu’à ~ 88% grâce à une réduction du LDL circulant. De ce fait, PCSK9 constitue une cible pharmacologique importante pour réduire le risque de MCV. PCSK9 lie le LDLR à la surface cellulaire et/ou dans l'appareil de Golgi des hépatocytes et provoque sa dégradation dans les lysosomes par un mécanisme encore mal compris. Le but de cette étude est de déterminer pourquoi certaines mutations humaines de PCSK9 sont incapables de dégrader le LDLR tandis que d'autres augmentent sa dégradation dans les lysosomes. Plusieurs mutations GF et PF de PCSK9 ont été fusionnées à la protéine fluorecente mCherry dans le but d'étudier leur mobilité moléculaire dans les cellules hépatiques vivantes. Nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ont montré que les mutations GF (S127R et D129G) avaient une mobilité protéique plus élevée (> 35% par rapport au WT) dans le réseau trans- Golgien. En outre, nos analyses quantitatives de recouvrement de fluorescence inverse après photoblanchiment (iFRAP) ont montré que les mutations PF de PCSK9 (R46L) avaient une mobilité protéique plus lente (<22% par rapport au WT) et une fraction mobile beaucoup plus petite (<40% par rapport au WT). Par ailleurs, nos analyses de microscopie confocale et électronique démontrent pour la toute première fois que PCSK9 est localisée et concentrée dans le TGN des hépatocytes humains via son domaine Cterminal (CHRD) qui est essentiel à la dégradation du LDLR. De plus, nos analyses sur des cellules vivantes démontrent pour la première fois que le CHRD n'est pas nécessaire à l'internalisation de PCSK9. Ces résultats apportent de nouveaux éléments importants sur le mécanisme d'action de PCSK9 et pourront contribuer ultimement au développement d'inhibiteurs de la dégradation du LDLR induite par PCSK9. / Coronary heart diseases (CHD) are a leading cause of death in Western societies. Hypercholesterolemia is a major risk factor for CHD. It is characterized by high levels of circulating low-density lipoprotein cholesterol (LDL, also called "bad cholesterol"). The prolonged presence of elevated levels of LDL in the circulation increases the risk of formation of atherosclerotic plaques, which can lead to obstruction of arteries and myocardial infarction. LDL is normally cleared from the blood through the binding of its sole protein constituent apolipoprotein B100 to hepatic LDL receptor (LDLR), which mediates its endocytosis in the liver. Human genetic studies have identified PCSK9 as the third gene responsible of autosomal dominant hypercholesterolemia after LDLR and its ligand apolipoprotein B100. PCSK9 interacts with the LDLR and induces its degradation thereby causing plasma LDL levels to rise. PCSK9 gain-of-function (GOF) mutations are associated with elevated plasma LDL levels and premature CHD while PCSK9 loss-offunction (LOF) mutations reduce the risk of CHD up to ~88% owing to reduction of circulating LDL. Accordingly, PCSK9 is recognized as a major pharmacological target to lower the risk of CHD. PCSK9 binds the LDLR at the cell surface and/or in the Golgi apparatus of hepatocytes and causes its degradation in lysosomes by a mechanism not yet clearly understood. The goal of this study was to determine why some human PCSK9 mutations fail to induce LDLR degradation while others increase it in lysosomes. Several PCSK9 LOF and GOF mutations were fused to the fluorescent protein mCherry to study their molecular mobility in living human liver cells. Our quantitative analysis of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) showed that PCSK9 GOF mutations S127R and D129G have a higher protein mobility (>35% compared to WT) at the trans- Golgi network (TGN). Our quantitative analysis of inverse fluorescence recovery after photobleaching (iFRAP) showed that PCSK9 LOF mutation R46L presented a much slower protein mobility (<22% compared to WT) and a much slower mobile fraction (<40% compared to WT). In addition, our confocal and electron microscopy analyses demonstrate for the first time that PCSK9 is localized and concentrated at the TGN of human hepatocytes. Furthermore, our results demonstrate that PCSK9 localization in the TGN is mediated through its C-terminal cysteine and histidine-rich domain (CHRD), which is essential for LDLR degradation. Also, our live-cell analyses demonstrate for the first time that the CHRD is not required for internalization of PCSK9. These results provide important new information on the mechanism of action of PCSK9 and may ultimately help in the development of inhibitors of the PCSK9-induced LDLR degradation.