Dans cette étude, nous avons développé un composé dérivé du NADPH, nommé Nanoshutter (NS). NS a été conçu pour inhiber l'activité catalytique de la NOS, c'est à dire la synthèse de NO, en occupant la place du NADPH dans le domaine réductase du NOS. La voie de synthèse de NO chez les mammifère correspond à l'oxydation de la L-arginine catalysée par la NOS, qui se produit dans son domaine oxygénase. Basée sur des données de modélisation moléculaire, la structure de NS est composée deux sous-unités: (i) le motif nucléotidique de reconnaissance du NADPH a été retenu, permettant au composé NS un ciblage approprié du site de liaison au NADPH de la NOS, (ii) le motif nicotinamide de NADPH a été remplacé par un groupe stilbène lié à un groupement terminal accepteur d'électrons. De plus, ce fragment est caractérisé par une très bonne section efficace d'absorption à deux photons (130 GM à 840 nm). NS1, le composé prototype de la famille NS, contient un groupe terminal NO2 en tant que groupe accepteur d'électrons. La valeur de Kd (~ 4,2 µM) a été estimée dans des expériences de titrage sous excitation un- ou deux-photons, et suggère une bonne affinité de liaison de NS1 à la NOS. De façon inattendue, NS1 présente une bonne sélectivité, en terme de rendement quantique de fluorescence, pour les isoformes de NOS par rapport à d'autres protéines qui contiennent ou non un site de liaison NADPH. En outre, il a été montré que NS1 inhibait de façon compétitive NOS par rapport au NADPH. Dans les expériences d'imagerie de fluorescence réalisées sur des cellules endothéliales (HUVEC), NS1 a démontré une internalisation rapide et efficace, avec un signal de fluorescence mis en évidence principalement dans la région périnucléaire, accompagné d’un signal plus sporadique à la membrane plasmique. Cette observation est en parfait accord avec la colocalisation de NS1 et eNOS mesurée par immunomarquage, démontrant ainsi que NS1 cible eNOS dans les cellules endothéliales. La vasoconstriction NO-dépendante attendue dans les anneaux aortiques isolés de souris a été montrée, mais uniquement en présence de catalase qui convertit H2O2 en H2O et O2. En revanche, en l'absence de catalase, la vasorelaxation a plutôt été observée. Ce résultat indique que la NOS n’est très certainement pas l’unique cible de NS1 dans le système endothélial, et que d’autres cibles en rapport avec la modulation de ROS (Reactive Oxygen Species) sont impliquées. En accord avec ce résultat, NS1 provoque une réponse biphasique de la production de ROS dans les cellules HUVEC : Une phase d'augmentation est observée aux faibles concentrations de NS1 (en dessous de 2 µM), suivie d'une diminution (inhibition de ROS) pour des concentrations de NS1 plus élevées. En outre, NS1 inhibe la production de O2- dans les macrophages de souris et les productions de H2O2 et de O2- survenant dans des conditions de découplage de nNOS in vitro. Des explications possibles pour interpréter ces données sont: NS1 probablement inhibe la production de ROS, soit produites au niveau de la NADPH oxydase ou (et) au cours du découplage de la NOS. L'origine de la phase d’augmentation reste plus difficile à interpréter, mais pourrait correspondre au ciblage de la glucose-6-phosphate deshydrogénase. Enfin, NS1 exerce un effet anti -angiogénique sur les cellules endothéliales et empêche la prolifération de cellules du mélanome. En conclusion, NS1 rempli l'objectif principal de cibler et inhiber la NOS en ciblant plus particulièrement le domaine réductase - il est aussi caractérisé par des propriétés d’absorption et de fluorescence à deux photons intéressantes permettant des applications in vitro et in vivo. L’ensemble de ces caractéristiques présentent un profil intéressant pour de futures applications d’imagerie en temps réel et non-invasive, avec également un fort potentiel pour des applications cliniques liées aux maladies NO-dépendantes. / In this study, we introduced a NADPH derivative named as Nanoshutter (NS). NS was designed to inhibit the catalytic activity of NOS, i.e. synthesis of NO, by occupying the NADPH site in the reductase domain of NOS. In mammals, NO participates in extensive physiological/pathological processes in the cardiovascular, nervous and immune systems. The pathway of mammal NO synthesis is the oxidation of L-arginine catalyzed by NOS, which occurs in its oxygenase domain. The catalysis requires three co-substrates (L-arginine, NADPH, and O2) and five cofactors groups (FAD, FMN, calmodulin, BH4 and heme). Guided by molecular modeling, the structure of NS contains two conjugated subunits: (i) the nucleotide recognition motif of NADPH was retained in NS, allowing a proper targeting to the NADPH binding site of NOS- (ii) the nicotinamide moiety of NADPH is replaced by a stilbene moiety linked with a terminal electron acceptor group, preventing electron flow from the reductase to the oxygenase domain of NOS. Furthermore, this moiety is characterized by a large two-photon absorption cross-section (130 at 840 nm). NS1, the first compound of the NS family, contains a NO2 terminal group as an electron acceptor group. NS1 displayed distinct fluorescence properties in its free and NOS-bound states. The Kd value (around 4.2 µM) was estimated in titration experiments performed under one- or two-photon excitation conditions, suggesting an effective binding of NS1 to NOS with a good affinity. Surprisingly, in terms of fluorescence quantum yield, NS1 displayed a good selectivity to the NOS isoforms over other proteins which contain or not a NADPH binding site. Furthermore, NS1 was shown to competitively inhibit nNOS in a dose-dependent manner. In fluorescence imaging experiments with endothelial cells (HUVEC), NS1 displayed a rapid and efficient internalization, with highlighted fluorescence signal at the perinucleus region and sporadic signal at the plasma membrane. This observation was in accordance with the colocalization imaging between NS1 and eNOS as shown by immunostaining, showing that NS1 actually targets eNOS in endothelial cells. The expected NO-dependent vasoconstriction in isolated mouse aortic rings was only evidenced in the presence of catalase, which converts H2O2 into H2O and O2. By contrast, in the absence of catalase, a contradictory vasorelaxation was observed. This result indicates that NS1 may target more than NOS in endothelium system, which is (are) likely related to Reactive Oxygen Species (ROS) production. Accordingly, NS1 led to a biphasic response of ROS production in HUVEC cells: An increasing phase occurred at low NS1 concentration (below 2 µM) and followed by a decreasing phase (ROS inhibition) at higher NS1 concentrations. Furthermore, NS1 was shown to inhibit O2- production in mouse macrophages and H2O2 and O2- production in uncoupled nNOS in vitro. Altogether, the possible but not exclusive explanations for current data are: in addition to its inhibition effect on NO production, NS1 probably also inhibits the ROS production either produced by NADPH Oxidase or by electron leakage from uncoupled NOS, or a combination of both. The origin of the increasing phase remains more elusive but could correspond to the targeting of glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6PD). Additionally, NS1 displayed anti-angiogenesis effect on endothelial cells and prevented proliferation of melanoma. In conclusion, NS1 fulfilled the goal as a new NOS inhibitor targeting the reductase domain and displayed a unique two-photon property in vitro and in vivo, these features may provide a promising future for non-invasive real-time imaging, and to potential clinical applications in the NO-dependent diseases.

Pour mettre en relation les propriétés rhéologiques et la structure méso/microscopique d'un système modèle ou complexe, l'utilisation de la rhéo-optique est indispensable. Nous avons donc développé une cellule d'observation sous cisaillement adaptée à la microscopie confocale. Ce dispositif, breveté et nommé RheOptiCAD®, permet le cisaillement contrôlé d'un échantillon quelconque placé entre 2 plans parallèles en translation. Grâce à un système à dépression, la mise en place de l'échantillon est simple et rapide tout en assurant des propriétés optiques répétables et reproductibles (planéité, parallélisme). Par ailleurs, la température au sein de l'échantillon peut être régulée de façon à imposer une contrainte thermique, cause de nombreuses modifications de la mésostructure d'un système alimentaire. La cellule d'observation sous cisaillement permet donc de suivre l'évolution et la dynamique des changements de structures conséquences d'un traitement thermo-mécanique imposé. Un logiciel de pilotage et d'acquisition des données a été développé pour rendre son utilisation plus conviviale. La validation du fonctionnement de l'outil et de ses fonctionnalités a tout d'abord été réalisée sans échantillon puis à l'aide d'un système modèle contenant des particules fluorescentes dont le mouvement était suivi. Par la suite, dans le but de tester les potentialités de ce nouvel outil tout en développant la méthodologie de son utilisation, et en particulier l'équilibre entre propriétés optiques et mécaniques des échantillons, nous avons travaillé avec de la pâte de farine. Ce système alimentaire bien connu et maîtrisé d'un point de vue rhéologique au laboratoire présente des caractéristiques intéressantes dans ce cadre. L'évolution du réseau de gluten au cours d'un cisaillement oscillatoire en fonction de la formulation de la pâte a été étudiée. Grâce à une analyse d'image basée sur la morphologie mathématique, nous avons pu mettre en évidence des changements de structures au cours du temps. De même, à l'aide des capacités thermiques de la cellule de cisaillement, nous avons étudié le positionnement et le mouvement des lipides endogènes à l'interface air-protéine lors de la fermentation. Notre cellule d'observation sous cisaillement constitue donc un nouvel outil de caractérisation dynamique de systèmes complexes couplant rhéologie et microscopie. Son optimisation principale réside dans la mise en place d'un capteur de force, mesurant les contraintes mises en jeu lors des déformations imposées. / Rheo-optic is a recent technique which can be used to create links between rheological properties and meso/microsctructures of model or complex (food) systems. A novel rheo-optical shearing device was designed for studying this relationships within complex food systems. The device has been build to be adapted on an inverted confocal microscope. Specifications of the shear cell are: a) a controlled translational shear between 2 parallel plates with three different motion modes (continuous, oscillatory, strain jump); b) a thermal control; and c) an observation on an inverted confocal microscope. Due to a vacuum system, the set up of an experiment is easy and fast ensuring reproducible optical properties (planarity, parallelism). Temperature, responsible of numerous modifications of structures in a food matrix, is also controlled. A piloting software allows an easy use of the shear cell. Validation of the motion modes has been carried out using a microgel, containing fluorescent probes (spheres) and tracking some of the particles. Next, in order to test and develop methods of observation under shear, taking into account the optical-mechanical balance, bread dough observation has been performed. Well known and described in the lab, bread dough is a dispersion of air bubbles and starch granules in a gluten network. Evolution on this gluten network depending on the formulation of the bread dough has been studied under oscillatory shearing. The composition effect on the microstructure and its evolution were observed and will be commented. Image analysis based on grayscale mathematical morphology has been carried out in order to try to quantify the rheological properties and microstructures. Finally, by a controlled increase of temperature, the growth of an air bubble in bread dough containing yeast was followed during proofing. The influence and the disposition of fat globules at the bubble air-protein interface along this growing process were followed. Thanks to the rheo-optical device, images of microstructures obtained under controlled shear are compared to their rheological behaviour.

Toutes les actions biologiques de l'hormone de croissance (GH) sont initiées par l'interaction de l'hormone avec un homodimère de son récepteur spécifique (GHR2) présent au niveau de la surface de ses cellules-cibles. Cette association conduit à l'activation de différentes voies de transduction du signal intracellulaire ainsi qu'à l'internalisation du complexe GH-GHR2, notamment au niveau de la mitochondrie. L'objectif de cette étude est de montrer le mécanisme et l'implication de l'internalisation par les cavéoles dans la régulation de l'action de la GH au niveau de la fonction mitochondriale. Nous avons montré l'importance de la boîte 1 du GHR dans la stimulation de l'activité respiratoire globale ; le transport de la GH par la voie des cavéoles dans la mitochondrie ; l'importance de la localisation intramitochondriale de la GH dans la régulation des complexes II et IV de la chaîne respiratoire. Ces résultats suggèrent une nouvelle voie d'action directe de la GH sur la mitochondrie

L'objectif de la thèse était d'étudier la mobilité de traceurs particulaires dans des milieuxcomplexes par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) combinée avec le suivi demultiple particules (MPT) et le recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP).Tout d'abord, nous avons étudié la diffusion de particules dans les gels formés par des protéinesglobulaires. Dans ce but, des gels avec structures variés ont été préparés en faisant varier lesconcentrations en protéine et en sel. La structure a été caractérisée par l'analyse des imagesobtenues par CLSM en termes de fonction de corrélation de paires. La mobilité de particulesavec une large gamme de tailles (2nm - 1 micron) a été étudiée à la fois dans des gels homogèneset hétérogènes et reliée à la structure du gel.Deuxièmement, nous avons étudié des émulsions eau dans eau préparées en mélangeant dessolutions aqueuses de PEO et de dextran. Il a été montré que lorsque des particules colloïdalessont ajoutées, elles sont emprisonnées à l'interface eau-eau, car elles réduisent la tensioninterfaciale. La structure et le déplacement des particules à l'interface ont été déterminés parCLSM combinée avec MPT.

Nous reportons ici le comportement rhéologique de suspensions concentrées - ou pâte - de particules granulaires ou colloïdales de ciment ou de silice sphérique et monodisperse. Le système modèle de particules de silice est utilisé pour pouvoir contrôler les propriétés physicochimiques de la suspension. Notre projet de recherche se centre sur deux points qui s'intéressent aux propriétés du coulis frais : (i) le premier est l'étude du processus de structuration par coagulation au repos et sa relation avec la prise. Nous avons utilisé des outils (ultrason, confocal) adaptés pour suivre et interpréter la coagulation et la prise du ciment.(ii). Le second est l'étude d'un phénomène de structuration dynamique, sous écoulement, typique des suspensions très concentrées et appelé " jamming ". Nous montrons que l'apparition de ce régime d'encombrement va de pair avec des fluctuations géantes de contraintes, avec une statistique caractéristique des événements critiques auto-organisés. L'état de surface des grains et du frottement intergranulaire est un paramètre important dans le blocage sous cisaillement. La simultanéité des fluctuations des efforts normaux et des efforts tangentiels aussi que des visualisations microscopiques suggère fortement que la formation de chaînes de contacts frottants est à l'origine du phénomène.

La membrane plasmique de la cellule est composée de lipides et interagit notamment avec le squelette de la cellule (le cytosquelette), par l'intermédiaire de protéines d'ancrages et de lipides clefs qui jouent un rôle spécifique dans certains types d'interactions. Parmi les protéines intervenant dans l'ancrage direct de la membrane plasmique au cytosquelette, des protéines de la famille des ERM (Ezrine, Radixine, Moésine) peuvent interagir spécifiquement avec un lipide, le phosphatidylinositol (4,5) biphosphate (PIP2), d'une part et avec l'actine du cytosquelette d'autre part. Dans le but de comprendre les interactions entre membrane plasmique et cytosquelette, nous avons réalisé des expériences in vitro sur des systèmes comportant un nombre minimal de constituants : des vésicules géantes (GUV) contenant du PIP2, de l'ezrine recombinante et de l'actine purifiée. Nous avons mis en évidence que la liaison au PIP2 induit des changements conformationnels de l'ezrine. L'ezrine est alors capable d'interagir avec les filaments d'actine. Nous avons caractérisé quantitativement l'incorporation de PIP2 dans la membrane de vésicule géantes, et montré que l'interaction de l'ezrine avec les vésicule géante contenant du PIP2, induit un partitionnement du lipide dans la bicouche lipidique et conduit à la formation d'agrégats de PIP2 et d'ezrine sur la membrane. La connaissance des effets de l'ezrine sur les membranes contenant du PIP2 et la connaissance des différents mécanismes se produisant lors des interactions permettra de définir plus précisément le rôle de l'ezrine in cellulo.

Vesicular delivery systems, like liposomes, represent an attractive approach to improving skin delivery of drugs. Liposomes are composed of one or several lipid bilayers surrounding an aqueous compartment. They are able to encapsulate hydrophilic compounds into their inner compartment and lipophilic compounds into their lipid bilayers. In the first part of this thesis, we developed a new dermal delivery system combining the advantages of cyclodextrin inclusion complexes and those of deformable liposomes. This system was called drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome. Betamethasone was chosen as the model drug. These systems were successfully developed and characterised. In vitro diffusion studies using Franz diffusion cells and polycarbonate membranes gave promising results. In order to better mimic the in vivo conditions, ex vivo penetration studies using pig ear skin and Franz diffusion cells were developed. The tape stripping method was used to determine the amount of drug in the stratum corneum. The amount of drug in the epidermis, dermis and receptor medium was also assayed. These methods were successfully validated. Unfortunately, ex vivo penetration studies of the developed skin delivery system could not confirm the promising in vitro results. Our research was then directed towards studies allowing a better understanding of liposome skin penetration mechanisms. In the second part of this thesis, the influence of several parameters on the skin penetration behaviour of liposomes was investigated. The formulation importance on skin penetration efficiency was highlighted by the comparison of two liposomal systems. In the first system, betamethasone is encapsulated by the help of cyclodextrin inclusion complexes in the aqueous compartment. In the second system, betamethasone is encapsulated alone in the lipid bilayer. The second system shows high membrane permeability of the encapsulated betamethasone. Despite this decreased drug retention, the second system enhances the skin penetration of betamethasone. This high membrane permeability and the better penetration of the second formulation support the mechanism of penetration as a free drug substance. In addition, no difference in penetration is observed between liposomes containing betamethasone alone and a non liposomal dispersion. Several surfactants or edge activators were incorporated in the lipid bilayer of liposomes in order to obtain deformable liposomes. Unfortunately, these deformable liposomes are unable to enhance skin penetration compared to classical non deformable liposomes. The addition of charged lipids in the lipid bilayer of liposomes encapsulating either betamethasone or betamethasone dipropionate was investigated. The addition of negatively charged lipids enhances the penetration of the encapsulated drug. The use of negatively charged liposomes enhanced the epidermis accumulation of betamethasone 9.3 times compared with the ethanolic solution. This improvement is not observed with the corresponding non liposomal dispersion, indicating that the vesicle form is of high importance. In the case of the ester, the use of negatively charged liposomes enhances the epidermis accumulation 5.5 times compared with the Diprosone® lotion and only 1.6 times compared with the ethanolic solution. The penetration of a more lipophilic drug, with a high intrinsic penetration, is less enhanceable when incorporated in liposomes. Confocal microscopy was performed to visualise skin penetration of fluorescently labelled liposomes. The lipophilic dye rhodamine B encapsulated in the lipid bilayer as betamethasone penetrates the epidermis at the same level as NBD-phosphatidylcholine. On the other hand, the hydrophilic dye calcein encapsulated in the aqueous compartment as betamethasone-cyclodextrin complexes does not penetrate the epidermis. These observations seem to confirm the ex vivo results. In addition, the skin penetration of rhodamine B seems to be improved by the incorporation in negatively charged liposomes compared with classical ones. Finally, the efficiency of the negatively charged vesicles was evaluated in vivo on volunteers by the skin blanching assay. Carbomer gel containing the negatively charged vesicles seems to enhance the blanching response of encapsulated betamethasone in comparison with the ethanolic hydroxypropylcellulose gel. However, results are not significantly different. This could be explained by the small number of volunteers. On the other hand, in the case of formulations containing betamethasone dipropionate, no tendency could be highlighted. These results seem to confirm that the use of negatively charged liposomes is more attractive for improving the efficiency of a lesser lipophilic drug, betamethasone, in comparison with the more lipophilic ester, betamethasone dipropionate. These results need to be confirmed using a higher number of volunteers./ Les systèmes vésiculaires, comme les liposomes, représentent une approche intéressante pour améliorer ladministration cutanée de médicaments. Les liposomes sont des vésicules sphériques composées dune ou plusieurs bicouches lipidiques entourant une cavité aqueuse. Ils sont capables dencapsuler des molécules hydrophiles dans leur cavité aqueuse, ainsi que de retenir des molécules hydrophobes dans leur bicouche lipidique. Dans la première partie de la thèse, nous nous sommes intéressés au développement dun nouveau système dadministration cutanée combinant les avantages des complexes dinclusion dans les cyclodextrines et ceux des liposomes déformables, aboutissant à un nouveau concept appelé : « drugs-in-cyclodextrin-in-deformable liposome». La bétaméthasone a été utilisée comme molécule modèle. Ces nouveaux systèmes ont été mis au point et caractérisés avec succès. Les premières études de diffusion réalisées in vitro, à travers des membranes synthétiques et au moyen des cellules de diffusion de Franz, étaient prometteuses. Afin de se rapprocher des conditions in vivo, des études de pénétration des liposomes ont alors été mises au point, ex-vivo, au moyen de cellules de diffusion et à travers des peaux doreilles de cochons. La méthode du « tape stripping » a permis de déterminer la quantité de bétaméthasone dans le stratum corneum. La quantité de substance active dans lépiderme, le derme et le mileu récepteur des cellules de Franz a également été déterminée. Ces méthodes ont été validées avec succés. Malheureusement, les études sur peaux doreilles de cochons nont pas permis de confirmer nos premières conclusions. Les recherches ont alors été orientées vers des études permettant de mieux comprendre les mécanismes de pénétration cutanée des liposomes. Dans la seconde partie de la thèse, linfluence de différents paramètres sur la pénétration cutanée a été étudiée. La comparaison de la pénétration cutanée de deux systèmes liposomiaux différents a mis en évidence limportance de la formulation des liposomes sur leur efficacité. Dans le premier, la bétaméthasone est encapsulée comme précédemment à laide de cyclodextrines dans la cavité aqueuse des liposomes déformables. Dans le second système, la bétaméthasone est encapsulée seule au niveau de la bicouche lipidique des liposomes. Ce second système a montré une plus grande perméabilité de la molécule modèle encapsulée. Malgré cette plus faible rétention, le deuxième système a permis daugmenter la pénétration de la molécule modèle. La plus grande perméabilité et la meilleure pénétration du deuxième système permettent de conclure que la bétaméthasone pénétrerait sous une forme non encapsulée dans les liposomes. De plus, aucune différence na été observée entre la pénétration cutanée des liposomes encapsulant la bétaméthasone dans leur bicouche et une dispersion non liposomale. Plusieurs tensio-actifs ont également été incorporés au niveau de la bicouche des liposomes afin dobtenir des liposomes déformables. Malheureusement, la faible augmentation de pénétration observée par rapport aux liposomes classiques non déformables nest pas significative. Lajout de lipides chargés au niveau de la bicouche lipidique de liposomes encapsulant soit la bétaméthasone soit le dipropionate de bétaméthasone a été investigué. Laddition de lipides chargés négativement a permis daugmenter la pénétration de la molécule encapsulée. Lutilisation de liposomes chargés négativement a permis daugmenter la quantité de bétaméthasone au niveau de lépiderme dun facteur 9,3 par rapport à une solution éthanolique de bétaméthasone. Cette augmentation na pas été observée avec la dispersion non liposomale correspondante, indiquant que la formulation sous forme de vésicules est très importante. En ce qui concerne le dipropionate de bétaméthasone, lencapsulation dans les liposomes chargés négativement a augmenté la quantité dester dans lépiderme dun facteur 5,5 par rapport à la spécialité Diprosone® lotion et seulement dun facteur 1,6 par rapport à la solution éthanolique. Lencapsulation dans les liposomes chargés négativement semble donc moins avantageuse dans le cas dune molécule plus lipophile, comme le dipropionate de bétaméthasone et qui possède déjà une bonne pénétration cutanée intrinsèque par rapport à une molécule plus hydrophile comme la bétamethasone. La pénétration de liposomes rendus fluorescents a été visualisée grâce à la microscopie confocale. Un marqueur lipophile, la rhodamine B, encapsulé dans la bicouche comme la bétaméthasone, pénètre bien dans la peau de la même façon que la phosphatidylcholine fluorescente. Par contre, un marqueur hydrophile, la calcéine, encapsulé dans la cavité des liposomes comme les complexes bétaméthasone-cyclodextrines, ne pénètre pas dans lépiderme. Ces observations confirment les résultats de dosage ex vivo au moyen des cellules de Franz. De plus, la pénétration dans la peau de la rhodamine B semble être plus importante lorsquelle est encapsulée dans les liposomes chargés négativement par rapport aux liposomes non chargés. Enfin, lefficacité des liposomes négatifs a été évaluée in vivo sur des volontaires grâce à lévaluation du pouvoir de blanchiement des corticostéroïdes. Le gel de carbomère contenant les liposomes chargés négativement semble augmenter la réponse de la bétaméthasone par rapport au gel éthanolique dhydroxypropylcellulose. Cependant, les résultats ne sont pas significatifs. Une explication pourrait être le faible nombre de volontaires. Par contre, dans le cas des liposomes contenant le dipropionate de bétaméthasone, il a été plus difficile de dégager une tendance. Ces résultats semblent confirmer que lutilisation des liposomes chargés négativement est plus intéressante dans le cas dune molécule moins lipophile comme la bétamethasone par rapport à une molécule plus lipophile comme le dipropionate de bétaméthasone. Ces résultats nécessitent cependant dêtre confirmés sur un plus grand nombre de volontaires.

Les nanostructures d'or peuvent être utilisées comme antennes optiques : elles se couplent à un émetteur ou récepteur de photons en champ proche et amplifient l'interaction de celui-ci avec le champ lointain. Nous montrons ici comment des dimères de nanoparticules d'or assemblés autour d'un brin d'ADN fonctionnent comme des antennes aux fréquences optiques, alimentées par un émetteur quantique unique. L'électrophorèse permet d'isoler des nanoparticules de 36 nm de diamètre fonctionnalisées par un seul monobrin d'ADN de 30 ou 50 bases et, après hybridation de séquences complémentaires, de dimères de géométries contrôlées. Les fréquences de résonance de ces assemblages indiquent un décalage spectral vers le rouge pour des distances interparticules réduites ; en excellent accord avec des calculs théoriques corrélés à une étude topologique par microscopie électronique cryogénique. En alimentant ces dimères par une unique molécule d'ATTO647N, nous produisons des sources de photons uniques dont les taux d'émission spontanée sont exaltés de deux ordres de grandeur par rapport à des fluorophores isolés. Les taux de désexcitation mesurés sur plusieurs centaines de molécules uniques (isolées et en présence d'une ou deux nanoparticules d'or) coïncident quantitativement avec les exaltations estimées en théorie de Mie. Des mesures d'ensemble par spectroscopie de corrélation de fluorescence indiquent également une exaltation de plus d'un ordre de grandeur des coefficients d'extinction molaire et un gain en signal de fluorescence pour les dimères les plus courts malgré une réduction notable du rendement quantique. En modifiant fondamentalement l'environnement électromagnétique local, ces nanostructures hybrides offrent une nouvelle voie d'ingénierie des propriétés photochimiques de systèmes moléculaires.

Nous étudions les propriétés optiques de boîtes quantiques GaN/AlN élaborées par épitaxie par jets moléculaires sur substrats Si(111). La spectroscopie résolue en temps de l'émission collective de plans de boîtes quantiques nous conduit à une détermination appropriée de l'état fondamental des boîtes quantiques et du champ électrique interne le long de l'axe de croissance. Nous observons et modélisons une dynamique de recombinaison non conventionnelle des porteurs. Ces résultats préliminaires nous permettent de sélectionner les boîtes quantiques idéales pour l'étude individuelle en micro-photoluminescence. Nos mesures sur boîte unique révèlent des effets de diffusion spectrale que nous étudions en détails. En analysant la polarisation linéaire, nous observons des propriétés liées à la structure fine excitonique, très différentes de celles de boîtes quantiques étudiées auparavant, ce que nous expliquons à l'aide d'un modèle tenant compte des effets d'échange et d'anisotropie.

Dans cette étude, nous avons développé un composé dérivé du NADPH, nommé Nanoshutter (NS). NS a été conçu pour inhiber l'activité catalytique de la NOS, c'est à dire la synthèse de NO, en occupant la place du NADPH dans le domaine réductase du NOS. La voie de synthèse de NO chez les mammifère correspond à l'oxydation de la L-arginine catalysée par la NOS, qui se produit dans son domaine oxygénase. Basée sur des données de modélisation moléculaire, la structure de NS est composée deux sous-unités: (i) le motif nucléotidique de reconnaissance du NADPH a été retenu, permettant au composé NS un ciblage approprié du site de liaison au NADPH de la NOS, (ii) le motif nicotinamide de NADPH a été remplacé par un groupe stilbène lié à un groupement terminal accepteur d'électrons. De plus, ce fragment est caractérisé par une très bonne section efficace d'absorption à deux photons (130 GM à 840 nm). NS1, le composé prototype de la famille NS, contient un groupe terminal NO2 en tant que groupe accepteur d'électrons. La valeur de Kd (~ 4,2 µM) a été estimée dans des expériences de titrage sous excitation un- ou deux-photons, et suggère une bonne affinité de liaison de NS1 à la NOS. De façon inattendue, NS1 présente une bonne sélectivité, en terme de rendement quantique de fluorescence, pour les isoformes de NOS par rapport à d'autres protéines qui contiennent ou non un site de liaison NADPH. En outre, il a été montré que NS1 inhibait de façon compétitive NOS par rapport au NADPH. Dans les expériences d'imagerie de fluorescence réalisées sur des cellules endothéliales (HUVEC), NS1 a démontré une internalisation rapide et efficace, avec un signal de fluorescence mis en évidence principalement dans la région périnucléaire, accompagné d'un signal plus sporadique à la membrane plasmique. Cette observation est en parfait accord avec la colocalisation de NS1 et eNOS mesurée par immunomarquage, démontrant ainsi que NS1 cible eNOS dans les cellules endothéliales. La vasoconstriction NO-dépendante attendue dans les anneaux aortiques isolés de souris a été montrée, mais uniquement en présence de catalase qui convertit H2O2 en H2O et O2. En revanche, en l'absence de catalase, la vasorelaxation a plutôt été observée. Ce résultat indique que la NOS n'est très certainement pas l'unique cible de NS1 dans le système endothélial, et que d'autres cibles en rapport avec la modulation de ROS (Reactive Oxygen Species) sont impliquées. En accord avec ce résultat, NS1 provoque une réponse biphasique de la production de ROS dans les cellules HUVEC : Une phase d'augmentation est observée aux faibles concentrations de NS1 (en dessous de 2 µM), suivie d'une diminution (inhibition de ROS) pour des concentrations de NS1 plus élevées. En outre, NS1 inhibe la production de O2- dans les macrophages de souris et les productions de H2O2 et de O2- survenant dans des conditions de découplage de nNOS in vitro. Des explications possibles pour interpréter ces données sont: NS1 probablement inhibe la production de ROS, soit produites au niveau de la NADPH oxydase ou (et) au cours du découplage de la NOS. L'origine de la phase d'augmentation reste plus difficile à interpréter, mais pourrait correspondre au ciblage de la glucose-6-phosphate deshydrogénase. Enfin, NS1 exerce un effet anti -angiogénique sur les cellules endothéliales et empêche la prolifération de cellules du mélanome. En conclusion, NS1 rempli l'objectif principal de cibler et inhiber la NOS en ciblant plus particulièrement le domaine réductase - il est aussi caractérisé par des propriétés d'absorption et de fluorescence à deux photons intéressantes permettant des applications in vitro et in vivo. L'ensemble de ces caractéristiques présentent un profil intéressant pour de futures applications d'imagerie en temps réel et non-invasive, avec également un fort potentiel pour des applications cliniques liées aux maladies NO-dépendantes.