Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos son las principales células impulsoras del proceso fibrótico en el corazón. Estas células son activadas tanto por estrés mecánico, como también por citoquinas, entre ellas TGF-β1, que actúa promoviendo la diferenciación celular a miofibroblastos y la síntesis de diferentes proteínas y sustancias que originan el proceso fibrótico. Antecedentes de nuestro laboratorio han revelado que el receptor B1 de cininas se encuentra levemente expresado en fibroblastos y su expresión se induce en los miofibroblastos cardiacos. Este receptor es parte del sistema cinina-calicreína, que de modo general, actúa de manera opuesta al sistema renina-angiotensina, y que contrarresta el efecto pro-fibrótico de angiotensina II, tanto en los fibroblastos como en los miofibroblastos cardiacos. Utilizando técnicas de western blot determinamos que TGF-β1 induce la expresión de B1R a las 48 horas y que este fenómeno estaría mediado por la vía de las MAPK y también por ALK5. Utilizando técnicas de adhesión sobre placa demostramos que tanto BK o DAKD no aumentan la adhesión de fibroblastos o miofibroblastos cardiacos. Por otro lado, utilizando el método de migración en placa (método de la herida), BK aumenta el comportamiento de migración en los fibroblastos, no así de los miofibroblastos. Finalmente, a partir de este trabajo concluimos que TGF-β1, a través de las vías transduccionales MAPK y ALK5; y no por la vía PI3-Akt ni a través de Smad 3; induce la expresión de B1R. Por otro lado, las cininas no median el comportamiento de adhesión celular de fibroblastos ni de miofibroblastos cardiacos. Sin embargo, BK induce la migración celular solo en fibroblastos cardiacos, mientras que DAKD, no media migración en fibroblastos ni miofibroblastos cardiacos. Estos resultados en conjunto, fortalecen el concepto de que las cininas son importantes mediadores del remodelado cardiaco. / Fibroblasts are the main drivers of cells in the heart fibrotic process. These cells are activated either by mechanical stress as well as by cytokines, including TGF-β1, which acts by promoting cell differentiation to myofibroblasts and the synthesis of different proteins and substances that originate the fibrotic process. History of our laboratory has shown that the kinin B1 receptor is slightly expressed in fibroblasts and its expression is induced in cardiac myofibroblasts. This receptor is part of the kininkallikrein system, which in general, acts opposite to the renin-angiotensin system, and counteracts the pro-fibrotic effect of angiotensin II in fibroblasts and cardiac myofibroblasts. Using western blot techniques, we determined that TGF-β1 induces the expression of B1R at 48 hours and that this phenomenon would be mediated by the MAPK pathway and by ALK5. Using plate adhesion techniques demonstrated that either BK or DAKD not increase the adhesion of cardiac fibroblasts or myofibroblasts. Furthermore, using the migration plate method (wound healing), BK increases the migration behavior in fibroblasts, but not of myofibroblasts. Finally, from this work, we conclude that TGF-β1, through MAPK signal transduction pathways and ALK5, and not through PI3-Akt or Smad 3, induces the expression of B1R. Furthermore, kinins do not mediate cell adhesion behavior of cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, BK induces cell migration only in cardiac fibroblasts, while DAKD doesn’t mediate migration in fibroblasts and myofibroblasts heart. These results, taken together reinforce the concept that kinins are important mediators of cardiac remodeling.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El inflamasoma NLRP3 es un complejo multiproteico que tiene como objetivo producir la fragmentación de la citoquina pro-inflamatoria, proIL-1, a su forma activa IL-1, facilitar su secreción al espacio extracelular y, de esta forma, regular y activar el sistema inmune innato. Este complejo está conformado por el receptor NLRP3, la proteína adaptadora ASC y la enzima llamada procaspasa-1. El inflamasoma puede ser encontrado en diversos tipos celulares, incluyendo los fibroblastos cardíacos (FC). Estas células, participan activamente en la homeostasis de la matriz extracelular (MEC) y responden a frente a estímulos patofisiológicos. Entre ellos, a TGF-1, el cual promueve la diferenciación de los FC a su forma más activa, los miofibroblastos cardiacos (MFC). Con la finalidad de conocer las principales diferencias del inflamasoma NLRP3 entre FC y MFC, empleamos diversas metodologías experimentales de carácter analítica. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias en los niveles proteicos de ASC, NLRP3 y en la secreción de IL-1, tanto en FC como en MFC. Sin embargo, tanto los niveles proteicos de procaspasa-1, así como también la actividad de caspasa-1, fueron mayores en MFC respecto de FC. Por otra parte, se observaron mayores niveles proteicos de proIL-1 en FC, en comparación con los MFC. Finalmente, en base a los resultados obtenidos, se puede concluir que los MFC, presentan mayores niveles de expresión y actividad del inflamasoma NLRP3 que los FC / The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex that aims to produce fragmentation of the pro-inflammatory, pro-IL-1, cytokine to its active IL-1, facilitating its secretion to the extracellular space and, thus, regulating and activating the innate immune system. The complex consists of: NLRP3 receptor, ASC adapter protein and an enzyme called pro-caspase-1. The inflammasome can be found in various cell types, including cardiac fibroblast (FC). These cells are actively involved in the homeostasis of extracellular matrix (ECM) and responds against pathophysiological stimuli, including TGF-1, which promotes the differentiation of FC to its active form, cardiac myofibroblast (MFC). In order to know the NLRP3 inflammasome main differences between FC and MFC, we use various experimental methods of analytical character. The results showed no difference in protein levels of ASC, NLRP3 and secretion of IL - 1, either FC or MFC. However both, protein levels of pro-caspase-1 as well as the activity of caspase-1, were higher in MFC regarding FC. Moreover, higher protein levels of pro- IL- 1 in FC were observed compared to the MFC. Finally, based on the results obtained, it can be concluded that the MFC, have higher levels of expression and activity of the inflammasome NLRP3 than FC

Submitted by Programa de Pós-Graduação em Odontologia Saúde (mestrodo@ufba.br) on 2017-04-04T15:06:18Z No. of bitstreams: 1 pdf final.pdf: 2399331 bytes, checksum: 1a144def38498f9edb85ce2273368827 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-07-06T12:54:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pdf final.pdf: 2399331 bytes, checksum: 1a144def38498f9edb85ce2273368827 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-06T12:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pdf final.pdf: 2399331 bytes, checksum: 1a144def38498f9edb85ce2273368827 (MD5) / CAPES / As neoplasias de glândulas salivares representam um importante grupo de neoplasias cujos aspectos morfológicos são diversos, no entanto, o seu conteúdo estromal tem sido pouco investigado. Este estudo visa estudar a distribuição de mastócitos e proteínas relacionadas (SMA, PAR-2, TGFβ1, IL-6), bem como a sua contribuição na diferenciação miofibroblástica em diferentes neoplasias de glândulas salivares com e sem conteúdo mioepitelial e com alto e baixo índice proliferativo. Técnica imunohistoquímica para triptase de células mastocitárias, SMA, PAR-2, TGFβ1, IL- 6 foi realizada em 10 casos de Adenoma Pleomórfico (AP), nove casos de Adenoma de Células Basais (AB), 10 casos de Adenocarcinoma Polimorfo de Baixo Grau (APBG), 14 casos de Carcinoma Mucoepidermóide (CME) e 10 casos de Carcinoma Adenóide Cístico (CAC), sendo inicialmente os tumores classificados de acordo com o seu conteúdo mioepitelial (<50% ou ≥ 50%) e de proliferação celular (alto ou baixo), por meio da calponina e do Ki-67, respectivamente. Adicionalmente foi realizada dupla marcação imunohistoquímica para mastócitos e actina alfa de músculo liso (SMA). A densidade de mastócitos foi maior na região periparenquimal em todos os tumores, sendo mais elevada nos tumores malignos (p=0,025), especialmente no CME. Foi encontrada uma correlação positiva entre mastócitos intraparenquimais e periparenquimais nos tumores benignos (p=0,020), e uma correlação negativa nos tumores malignos (p >0,05). Tumores benignos com alto índice proliferativo apresentaram alta expressão de PAR-2 e TGFβ1, baixa expressão de SMA e IL-6, e menor densidade de mastócitos periparenquimais quando comparados aos tumores de baixo índice proliferativo; nos tumores benignos com conteúdo mioepitelial <50% observou-se alta expressão de TGFβ1, alta expressão de PAR-2 em 50% dos casos, baixa expressão de SMA e IL-6 e menor densidade de mastócitos periparenquimais quando comparados aos tumores com conteúdo mioepitelial >50% (p>0,05). Tumores malignos com alto índice proliferativo apresentaram alta expressão de PAR-2, baixa expressão de SMA, IL-6 e TGFβ1 e maior densidade de mastócitos totais, intra e periparenquimais quando comparados aos tumores de baixo índice proliferativo; no CME, tumores com baixo índice proliferativo apresentaram maior expressão de SMA (p=0,031); nos tumores malignos com conteúdo mioepitelial <50% observou-se alta expressão de PAR-2, baixa expressão de SMA, IL-6, TGFβ1, e maior densidade de mastócitos totais, intra e periparenquimais quando comparados aos tumores com conteúdo mioepitelial >50% (p>0,05). Quando comparada a densidade de mastócitos com a marcação miofibroblástica (SMA), tumores benignos e malignos com alta expressão de SMA apresentaram maior densidade de mastócitos totais e periparenquimais, com destaque para a densidade periparenquimal no APBG (p=0,017). Em relação à expressão das proteínas PAR-2, IL-6 e TGFβ1 e a densidade de mastócitos e SMA não foi observada diferença estatisticamente significante (p>0,05). Os resultados do presente trabalho apontam para uma possível participação dos mastócitos no desenvolvimento tumoral de tumores de glândula salivar. No entanto, não foi possível estabelecer a relação entre os mastócitos e a diferenciação miofibroblástica em tumores de glândula salivar. / Salivary gland neoplasms represent an important group of neoplasms whose morphology is different, however, its content stromal has been little investigated. This study aims to study the distribution of mast cells and related proteins (SMA, PAR-2, TGFβ1, IL-6), as well as their contribution to the myofibroblastic differentiation in different tumors of the salivary glands with and without myoepithelial content and high and low proliferative index. Immunohistochemistry for tryptase mast cells, SMA, PAR- 2, TGFβ1, IL-6 was performed in 10 cases of Pleomorphic Adenoma (PA), nine cases of Basal Cell Adenoma (AB), 10 cases of Polymorphous Low- Grade Adenocarcinoma (PLGA), 14 cases of Mucoepidermoid Carcinoma (MEC) and 10 cases of adenoid cystic carcinoma (ACC) initially being tumors were classified according to their myoepithelial content (<50%, or ≥ 50%) and cellular proliferation (high or low) by means of calponin and Ki-67, respectively. Additionally Double labeling immunohistochemistry was performed to mast cells and alpha smooth muscle actin (SMA). The density of mast cells was larger in the region periparenquimal all tumors and is higher in malignant tumors (p = 0.025), especially in MEC. A positive correlation between intraparenchymal and periparenchymal mast cells in benign tumors were found (p = 0.020), and a negative correlation in malignant tumors (p> 0.05). Benign tumors with high proliferation index showed high expression of PAR-2 and TGFβ1, low expression of SMA and IL-6, and lower density periparenchymal mast cells tumors compared to low proliferative index; in benign tumors with myoepithelial content of <50% was observed high expression of TGFβ1, high PAR-2 expression in 50% of cases, low SMA expression and IL-6 and lower density periparenchymal mast cells when compared to tumors with myoepithelial content > 50% (p> 0.05). Malignant tumors with high proliferative index showed high expression of PAR-2, low-SMA expression, IL-6 and TGFβ1 and higher density of total mast cells, intra and periparenchymal when compared to tumors of low proliferation index; the MEC, tumors with low proliferation index showed higher expression of SMA (p = 0.031); in malignant tumors with myoepithelial content <50% was observed high expression PAR- 2, low-SMA expression, IL-6, TGFβ1, and higher density of total mast cells, intra and periparenchymal when compared to tumors with myoepithelial content> 50% (p> 0.05). Compared the density of mast cells with myofibroblastic marking (SMA), benign and malignant tumors with high expression of SMA showed a higher density of total and periparenchymal mast cells, highlighting the periparenchymal density in PLGA (p = 0.017). Regarding the expression of PAR-2 protein, IL-6 and TGFβ1 and the density of mast cells and SMA was no statistically significant difference (p> 0.05). The results of this study point to a possible role of mast cells in tumor development of salivary gland tumors. However, it was not possible to establish the relationship between mast cells and myofibroblast differentiation in salivary gland tumors.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está compuesto por varios tipos celulares, de los cuales aproximadamente el 90% corresponde a cardiomiocitos y a fibroblastos. Los fibroblastos representan 2/3 de la población total de células del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Este tipo celular puede responder frente a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores, indicativo de una respuesta autocrina. Por acción del TGF-β1 se diferencian a un fenotipo celular altamente secretor de colágeno, el miofibroblasto, principal célula encargada del proceso de cicatrización. Por otra parte, existen antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardíacos la activación de las vías transduccionales que conducen a un aumento en los niveles de AMPc contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Para estos efectos, el AMPc es crítico debido al rol que juegan dos proteínas que se activan cuando aumentan los niveles de éste; estas son Epac (Exchange protein activated by cAMP/ proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc) y PKA (proteína quinasa A). Anteriormente se estudió el rol desempeñando por la Epac en los procesos de adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos, en donde se vio que Epac aumenta la adhesión en ambos fenotipos celulares, y con respecto a migración, se vio que los estímulos que aumentan los niveles de AMPc aumentan la migración en fibroblastos, pero no así en miofibroblastos. Con esto surge la interrogante de saber cómo modula la PKA estos procesos. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol que juega la PKA en adhesión, migración y expresión de colágeno. Se utilizaron estímulos que aumentan los niveles de AMPc (isoproterenol y forskolina), el agonista de la PKA 6-Bz-AMPc y su inhibidor H-89. Nuestros resultados mostraron que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos, hubo un aumento de la adhesión al estimular con isoproterenol y forskolina, pero con 6-Bz-AMPc no se observó un cambio significativo con respecto al control, aunque sí tendió a disminuir lo que indica que la PKA no regula la adhesión celular. En migración no se observa efecto alguno con el agonista de la PKA y en la expresión de colágeno se vio una disminución con isoproterenol, forskolina, 6-Bz-AMPc y Me-AMPc tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. Conclusión: PKA no interviene dentro de los procesos de adhesión y migración, pero sí lo hace en la expresión de colágeno. / The heart is composed by many types of cells, mainly cardiomyocytes and fibroblasts (almost 90% of total cells). Fibroblasts represent two thirds of the whole heart cell population and are responsible for the constant turnover of extracellular matrix proteins. This kind of cells can respond to many cytokines, growth factors and express their receptors indicating an autocrine answer. By the action of TGF-β1, they can be differentiated into a new phenotype called myofibroblasts, highly secreting of collagen and main cell involved into the healing process. Otherwise, there are numerous reports indicating that in cardiac fibroblasts, activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes like adhesion, migration and myofibroblast differentiation. For these effects cAMP is critical due to the role played by two proteins whose activation depends on the increase in the cAMP levels. These proteins are Epac (Exchange protein activated by cAMP) and PKA (protein kinase A). Formerly it was studied the role played by Epac in adhesion and migration of fibroblasts and myofibroblasts. Epac increased cell adhesion in both phenotypes, and about migration, in fibroblasts this phenomenon was increased with all the stimuli that increased the cAMP levels, whereas in myofibroblasts were no effect. So, we can ask about the role lead by PKA in these processes. The objective in this work was determined which role plays PKA in adhesion, migration and collagen expression. We used stimuli that increase cAMP levels (isoproterenol and forskolin), PKA’s agonist 6-ph-cAMP and its inhibitor H-89. Our results showed that both fibroblasts and in myofibroblasts there was an increase in cell adhesion in response to isoproterenol, forskolin and H-89, but with 6-ph-cAMP no significant change was observed respect control but tended to decrease, indicating that PKA is not involved in cell adhesion. In migration no effect was observed with 6-ph-cAMP, and finally in collagen expression these stimuli decreased the expression (we tried with Epac agonist Me-cAMP too) in both phenotypes. Conclusion: PKA does not intervene in adhesion and migration processes, but it does in collagen expression.

Submitted by Programa de Pós-Graduação em Odontologia Saúde (mestrodo@ufba.br) on 2017-04-03T14:12:58Z No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T14:28:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T14:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF Final.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / FAPESB / O presente trabalho teve como objetivo estudar, por meio da imunohistoquímica, a participação de componentes celulares estromais a exemplo dos mastócitos (mast cell triptase), miofibroblastos (alfa-SMA) e macrófagos (CD163) e componentes vasculares (CD34 e D2-40) em uma série de tumores odontogênicos queratocísticos (TOQ), na tentativa de fornecer subsídios para compreender a interação entre esses componentes e o comportamento biológico distinto desta lesão. Para fins comparativos, cistos radiculares (CRs) e folículos pericoronários (FPs) também foram incluídos. A amostra foi composta por 30 TOQs, 15 CRs e 07 FPs. Para a avaliação dos mastócitos, miofibroblastos e macrófagos, foram quantificadas as células imunorreativas aos marcadores mast cell triptase, alfa-SMA e CD163, respectivamente, em 10 campos (400x). Os índices angiogênico e linfangiogênico foram avaliados por meio da densidade microvascular (MVD) e densidade microvascular linfática (MVDL) dos microvasos marcados, respectivamente, pelos marcadores CD34 e D2- 40. Foi utilizado o teste ANOVA com pós-teste de correção de Tukey, para análise estatística entre os marcadores segundo o tipo de lesão. Para a análise da correlação entre os marcadores dentro da mesma lesão, utilizamos a correlação de Pearson. Para a associação, no TOQ, entre os marcadores e a presença de inflamação, utilizamos o Teste T de Student. A análise da expressão do marcador mast cell triptase revelou existir diferenças significativas (p<0,05) entre a densidade de células mastocitárias presentes nos CRs (22,7) em relação aos FPs (1,23) e TOQs (7,39), e entre a densidade de mastócitos presentes no TOQs e FPs. Houve também diferença significativa (P<0,05) entre a densidade de miofibroblastos em TOQs (29,25) em relação aos CRs (4,66) e os FPs (1,50). A diferença da densidade de miofibroblastos entre os CRs e FPs não foi significativa (p>0,05). A respeito dos macrófagos, não houve diferenças significativas (p= 0,084) entre as densidades de macrófagos presentes nos TOQs (2,31), CRs (1,42) e FPs (0,14). Na avaliação do índice angiogênico, não houve diferenças significativas da MVD entre as três lesões estudadas. No entanto, para o índice linfangiogênico, houve diferença significativa (p<0,05) entre a MVDL presentes nos TOQs (11,64) em relação aos CRs (4,19) e aos FPs (0,167). A diferença entre a MVDL dos CRs em relação aos FPs não foi estatisticamente significante (p>0,05). Não foi encontrada associação significativa (p>0,05) entre os marcadores estudados com a presença de inflamação no TOQ. No presente trabalho, encontramos uma correlação positiva e moderada entre os marcadores mast cell triptase e o CD34 nos TOQ (p = 0,025). Já nos CRs encontramos uma correlação inversa e moderada entre os marcadores SMA x CD34 (p = 0,017). Nos FPs também encontramos uma correlação inversa entre os mesmos marcadores anteriores, porém forte (p=0,049). Embora os componentes celulares estromais e microvasculares aqui representados por mastócitos, miofibroblastos, macrófagos CD163 positivos e vasos CD34 e D240, respectivamente, sejam importantes para manutenção do arcabouço estrutural do TOQ e CR, existiu uma interação significante entre mast cell triptase e CD34 no TOQ e entre CD34 e o alfa –SMA no CR. / The present study aimed to investigate, by immunohistochemistry, the participation of stromal cell components such mast cell (mast cell tryptase), myofibroblasts (alpha- SMA) and macrophages (CD163) and vascular components (CD34 and D2-40) in a series of keratocysts odontogenic tumors (OKT) in an attempt to provide information to understand the interaction between these components and the biological behavior of this lesion. For comparative purposes, radicular cysts (RCs) and pericoronal follicles (PFs) were also included. The sample comprised 30 OKTs, 15 RCs and 07 PFs. For the evaluation of mast cells, myofibroblasts and macrophages, the cells immunoreactive with biomarkers mast cell tryptase, alpha- SMA and CD163 were quantified, respectively, in 10 fields (400x). The angiogenic and lymphangiogenic index were assessed by microvessel density (MVD) and lymphatic microvessel density (MVDL) of microvessels marked respectively by for CD34 and D2-40. ANOVA with post-test Tukey correction for statistical analysis between markers was used according to the type of injury. To analyze the correlation between markers within the same lesion, we used the Pearson correlation. For the association, the OKT between markers and the presence of inflammation, we used the Student's t test. The analysis of expression of mast cell tryptase shows any significant differences (p < 0.05) between the density of mast cells present in RCs (22.7) than FPs (1.23) and TOQs (7.39) and the density of mast cells present in TOQs and FPs. There was also a significant difference (P < 0.05) between the density of myofibroblasts in TOQs (29.25) compared to CRs (4.66) and FPs (1.50). The difference in density between the RCs of myofibroblasts and PFs was not significant (p> 0.05). With respect to macrophages, no significant differences (p = 0.084) between the densities of macrophages present in TOQs (2.31), CR (1.42) and FPs (0.14). With respect to the angiogenic index, there were no significant differences in MVD between the three lesions studied. However, for the lymphangiogenic index, a significant difference (p < 0.05) between MVDL present in TOQs (11.64) compared to CRs (4.19) and FPs (0.167). The difference between MVDL of CRs compared to FPs was not statistically significant (p > 0.05). No significant association (p > 0.05) between the biomarkers studied in the presence of inflammation in the OKT was found. In the present study, we found a moderate positive correlation between mast cell tryptase and CD34 markers in OKT (p = 0.025). Have the CR and found an inverse correlation between moderate SMA x CD34 (p = 0.017). In PFs also found an inverse correlation between the SMA x CD34, but strong (p = 0.049). Although stromal microvascular and cellular components represented here by mast cells, myofibroblasts, and CD163 positive macrophages and vessels CD34 and D240 are important for maintaining the structural framework of the OKT and RC, a significant interaction between mast cell tryptase x CD34 existed in OKT and between CD34 x alpha- SMA in RC.

Orientadora: Profª. Drª. Antônio Carlos L. Campos / Coorientador: Prof. Dr. Jorge Eduardo Fouto Matias / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 19/12/2016 / Inclui referências: f. 75-82 / Resumo: Introdução: A cicatrização é um processo complexo que resulta na formação de novo tecido para o reparo de uma solução de continuidade. A desnutrição e as deficiências nutricionais específicas podem ter grande impacto no resultado final de feridas cirúrgicas ou traumáticas. Estudos mostram que o uso do ácido graxo poliinsaturado ômega-3 pode criar um microambiente mais favorável à cicatrização de feridas. Em outros, devido à sua capacidade de competir pela produção de eicosanoides menos pró-inflamatórios, foi relatado prejuízo à cicatrização. Portanto a influência do ômega-3 sobre a cicatrização cutânea permanece indefinida. Objetivo: Avaliar o processo de cicatrização da ferida excisional e incisional da pele de ratos sob o efeito do uso da suplementação nutricional com ácido graxo ômega-3. Método: Sessenta ratos fêmeas foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de 15 (Epre, Eper, Cpre, Cper) conforme o lipídeo de suplementação (E - óleo de peixe e C - óleo de soja) e o momento de suplementação (pre - somente nos 7 dias antecedentes ao procedimento, per - 7 dias antes e 7 dias após o procedimento). A suplementação do óleo (peixe ou soja) foi administrada através de gavagem diariamente, além da dieta ad libitum. Sob anestesia geral, após 7 dias de suplementação nutricional inicial, as ratas foram submetidas a procedimento cirúrgico com confecção de ferida em dorso (2x2cm) que foi deixada cicatrizar por segunda intenção, e ferimento incisional (5cm) no ventre, fechado por meio de sutura. Fotografou-se de forma padronizada a ferida no pós-operatório imediato, assim como no 1º,3º, 5º e 7º dias para cálculo de área e taxa de contração da ferida. Após a eutanásia no 7º dia, a ferida do dorso foi enviada para estudo imunoistoquímico (miofibroblasto e neovasos) e de colágeno. A ferida do ventre foi submetida a teste tensiométrico utilizando máquina universal de ensaio mecânico Emic®. Os resultados foram analisados estatisticamente, com nível de significância de 5%. Resultados: O peso dos animais não mostrou diferença significativa entre os grupos. Na análise da contração nos primeiros dias após o procedimento, o grupo Cpre apresentouse com maiores taxas de contração da ferida (p= 0,017 para diferença 1PO- 3PO e p=0,004 para diferença 3PO-5PO). O grupo Epre mostrou as maiores taxas de contração na avaliação entre o período de pós-operatório imediato e o 7º dia (p= 0,002). O estudo tensiométrico (força máxima e de ruptura) não mostrou diferença entre os grupos, assim como as análises de miofibroblasto e neoangiogênese. Houve associação entre maior força tênsil com maior número de miofibroblastos para o grupo Epre (p=0,011) e maior força com maior número de CD34 para o grupo Cpré (p=0,03). Para o colágeno, não houve diferença entre os momentos "pré" e "per", somente entre os grupos experimento e controle, com o primeiro apresentando maior quantidade de colágeno tipo III (imaturo - p<0,001). Conclusão: A utilização da suplementação enteral com ômega-3 em ratos sem desnutrição não altera o peso, força tênsil da cicatriz, quantidade de miofibroblastos e neoangiogênese. Promove maior taxa de contração da ferida e atraso na deposição de colágeno maduro, em relação à suplementação com óleo de soja. Palavras-chave: Cicatrização. Ácidos Graxos Ômega-3 Estado Nutricional. Rato. Colágeno. Miofibroblastos. Resistência à Tração. / Abstract: Background: Healing is a complex process that results in new tissue formation for repair of a continuity solution. Malnutrition and specific nutritional deficiencies can have a major impact on the final outcome of surgical or traumatic wounds. Some studies show that the use of omega-3 polyunsaturated fatty acid can create a microenvironment that is more conducive to wound healing. In others, due to its ability to compete for the production of less proinflammatory eicosanoids, damage to healing has been reported. Therefore, the influence of omega-3 on cutaneous healing remains undefined. Aim: To evaluate the healing process of excisional and incisional wounds of the skin of rats under the effect of nutritional supplementation with omega-3 fatty acid. Method: Sixty female rats were randomly divided into four groups of 15 (Epre, Eper, Cpre, Cper) according to the supplementation lipid (E - fish oil and C - soybean oil) and the moment of supplementation (pre - 7 days prior to the procedure, per - 7 days before and 7 days after the procedure). Oil supplementation (fish or soybean) was administered through orogastric gavage daily, in addition to the ad libitum diet. Under general anesthesia, after 7 days of initial nutritional supplementation, the rats were submitted to a surgical procedure with a wound on the back (2x2cm) that was allowed to heal by second intention, and incisional wound (5cm) in the abdomen, closed by suture. The wound was photographed in a standardized way in the immediate postoperative period, as well as in the 1st, 3rd, 5th and 7th days to calculate the area and rate of wound contraction. After euthanasia on the 7th day, the back wound was sent to immunohistochemical study (myofibroblasts and neoangiogenesis) and collagen study. The abdomen wound was submitted to a tensile test using the Emic® universal mechanical test machine. The results were statistically analyzed, with a significance level of 5%. Results: The weight of the animals did not show any significant difference between the groups. In the analysis of the contraction in the first days after the procedure, the Cpre group presented with higher rates of wound contraction (p = 0.017 for 1PO-3PO difference and p = 0.004 for 3PO-5PO difference). The Epre group showed the highest rates of contraction in the evaluation between the immediate postoperative period and the 7th day (p = 0.002). The tensiometric study (maximum and rupture force) showed no difference between groups, as well as the myofibroblast and neoangiogenesis analyzes. There was an association between greater tensile strength with greater number of myofibroblasts for the Epre group (p = 0.011) and higher strength with greater number of CD34 for the Cpre group (p = 0.03). For the collagen, there was no difference between the "pre" and "per" moments, only between the experimental and control groups, with the first showing higher levels of collagen type III (immature - p <0.001). Conclusion: The use of enteral supplementation with omega-3 in rats without malnutrition does not alter the weight, tensile strength of the scar, myofibroblasts and neoangiogenesis. It promotes a higher rate of wound contraction and a delay in the deposition of mature collagen in relation to soybean oil supplementation. Key-Words: Wound-Healing. Fatty Acids Omega-3. Nutritional Status. Rats. Collagen. Myofibroblasts.Tensile Strength.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los miofibroblastos cardíacos, son células diferenciadas desde fibroblastos por efecto del TGF-β1 durante 84 horas, y secretan una gran variedad de mediadores inflamatorios, citoquinas, y proteínas de la matriz extracelular (colágeno tipo I, fibronectina, etc.). Además, presentan una amplia variedad de receptores, entre ellos receptores de angiotensina y bradicinina. Se han descritos 2 subtipos de receptores de bradicininas, B2R, receptor clásico y constitutivo y B1R, receptor inducible en condiciones de exposición a citoquinas inflamatorias y daño tisular. En este trabajo se estudió la presencia de B1R en miofibroblastos, y tras su estimulación por agonistas específicos, su efecto sobre proteínas de la matriz extracelular.Nuestros resultados mostraron que el receptor B1 de bradicininas está presente en los miofibroblastos, mientras que está ausente en fibroblastos cardiacos. El receptor B1, presente en miofibroblastos, es funcional ya que DAKD y DABK agonistas selectivos B1R, activaron de forma temprana y transitoria la vía de señalización que aumenta los niveles intracelulares de Ca2+. En respuesta a la activación de B1R con DAKD se observó en forma tardía una disminución en el colágeno soluble secretado al medio de cultivo, siendo este evento independiente de la actividad de MMP-2 y de la viabilidad celular. Últimamente se ha planteado un nuevo mecanismo de acción de iECAs en la cual enalaprilato (molécula activa del enalapril) y captopril, pero no lisinopril, activan al B1R. Nuestros resultados indican que captopril activó B1R, produciendo un aumento temprano y transitorio de Ca2+ intracelular. Al igual que DAKD, captopril redujo la secreción de colágeno en miofibroblastos, independiente de la acción de MMP-2 y de la viabilidad celular. Captopril y lisinopril también redujeron el colágeno secretado en fibroblastos cardiacos, y debido a la ausencia de B1R en fibroblastos, nuestros resultados sugieren que ello se debería a la capacidad de los iECAs de bloquear la degradación de bradicininas secretadas en forma endógena, las que activarían B2R, induciendo una disminución en la secreción de colágeno soluble. Estos resultados agregan un nuevo mecanismo por el cual los fármacos iECA serían capaces de modular el remodelamiento cardiaco en pacientes hipertensos y/o con infarto cardiaco

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en el mundo. Los elevados niveles de colesterol y lipoproteína de baja densidad (LDL), que se han relacionado a un aumento de la cantidad de LDL oxidado (oxLDL) destacan entre los factores de riesgo. OxLDL se ha relacionado con el desarrollo de fibrosis cardíaca posterior al daño miocárdico y a la activación o inhibición del proceso autofágico en diferentes modelos celulares. Los miofibroblastos cardíacos (MFC) son células diferenciadas de fibroblastos cardíacos. Son los principales productores de matriz extracelular (MEC) luego del daño tisular, formando un tejido de cicatriz. Una vez terminada su función, los MFC mueren por apoptosis. Sin embargo, se ha identificado la persistencia de MFC en el corazón después del daño, condición que favorece el desarrollo de fibrosis. No hay evidencias que relacionen oxLDL, autofagia y sobrevida celular. En esta memoria se propuso la siguiente hipótesis: “oxLDL induce autofagia y aumenta la sobrevida en miofibroblastos cardiacos”. Los objetivos a desarrollar fueron: a) Evaluar el efecto de oxLDL en autofagia de MFC y b) Determinar el efecto de autofagia y oxLDL en sobrevida de MFC. Se trabajó con MFC estimulados con oxLDL a diferentes concentraciones y tiempos, con el fin de evaluar el efecto en el flujo autofágico. Para ello, se cuantificaron los niveles de LC3-I y LC3-II mediante Western blot. Se utilizó H2O2 como estímulo de muerte para estudiar los efectos de oxLDL y autofagia en la viabilidad celular por conteo con azul de Tripán. Los resultados de este trabajo indicaron que: a) oxLDL por sí solo no indujo activación de la autofagia, sin embargo disminuye la acumulación de LC3-II inducida por cloroquina. b) Autofagia inducida por rapamicina disminuye la viabilidad celular ante estímulo de muerte de H2O2. c) oxLDL no afecta la viabilidad celular ante estímulo de muerte H2O2, no obstante disminuye la muerte celular inducida por rapamicina y H202 / Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide. A major risk factor in these diseases is high levels of cholesterol and low-density lipoprotein (LDL), and this has been correlated with high levels of oxidized low-density lipoprotein (oxLDL). OxLDL is linked to fibrosis development after myocardial injury and this has been correlated with activation or inhibition of autophagic process in various cellular models. Cardiac myofibroblasts (CMF) are a differentiated phenotype from cardiac fibroblasts (CF). They are the main extracellular matrix producers after tisular injury, MFC make a scar and then die via apoptosis. Nevertheless, CMF in cardiac tissue have been identified after their work, this condition promotes fibrosis development and cardiac failure. There is no evidence of relationship between oxLDL, autophagy and cellular survival. The following hypothesis was proposed to this work: “oxLDL induces autophagy activation and enhances cardiac myofibroblast survival”. Specifics objectives to answer the hypothesis were: a) To evaluate the effect of oxLDL on autophagy of MFC, and b) To determine the effects of oxLDL and autophagy on MFC survival. To fulfill the proposed objectives MFC were stimulated with oxLDL and its effects were observed on autophagic flux. LC3-I and LC3-II levels were quantified by Western blot. H2O2 was used as a death stimulus to observe oxLDL and rapamycin-induced autophagy on cellular survival the viable cells where counted by tripan blue method. The results of this works show that: a) oxLDL has no effect on LC3-II levels under normal conditions, but dimish LC3-II chloroquine-induced LC3-II accumulation. b) Rapamycin-induced autophagy dimishes cell survival on death stimulus H2O2. c) oxLDL has no effect on cell survival, but reverts loss of cell viability on MFC treated with H2O2 and rapamycin

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-10Bitstream added on 2014-06-13T21:06:01Z : No. of bitstreams: 1 mainenti_p_dr_sjc.pdf: 825103 bytes, checksum: cb4ac2ce4ddd387d52a086efa8ec1795 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A carcinogênese química em glândulas salivares animais não se apresenta como um modelo novo de pesquisa. O uso de DMBA em glândulas submandibulares de ratos produz carcinomas e sarcomas, associados ou não. Apesar de bem estudada a histopatologia deste tipo de carcinogênese, pouco se sabe em relação a imunoistoquímica das neoplasias. Este estudo se propõe a revisar pesquisa pregressa realizada por Mainenti (2006), na tentativa de melhor entender a formação de tumores induzidos por DMBA. O estudo original diagnosticou lesões não neoplásicas, principalmente sialadenites, e tumores como carcinomas, carcinossarcomas e um caso de sarcoma. O presente trabalho fez uso de lâminas e material de estoque em formol. Foram comparadas as lâminas originais com novas lâminas coradas em hematoxilina e eosina. Para a pesquisa de fibras colágenas utilizou-se a coloração pelo método do tricrômico de Gomori. A imunoistoquímica foi realizada utilizando os seguintes anticorpos: AE1/AE3, vimentina, α-SMA, calponina, desmina, miogenina, S-100, CerbB-2 e EMA. Certas lesões, previamente diagnosticadas como sialadenites, foram reclassificadas como carcinomas. A imunoistoquímica foi positiva para os seguintes anticorpos: AE1/AE3 para neoplasia epitelial, vimentina para tecido conjuntivo e tumores mesenquimais, α-SMA e calponina para poucas células fusiformes pleomórficas no estroma dos carcinomas e nas neoplasias mesenquimais. Concluiu-se que a imunoistoquímica revelou diferenciação muito sugestiva de miofibroblastos no estroma dos carcinomas e miofibroblastos compondo o fibrossarcoma e os carcinosarcomas. Estas células produziram colágeno revelado pelo tricrômico de Gomori. O componente epitelial neoplásico foi sugerido como derivado de células luminais. / The chemical carcinogenesis, addressed to animal salivary gland, is not a novel research. The use of DMBA in rat’s submandibular salivary gland is known to produce neoplasms like sarcomas and carcinomas either intermingled or not. Despite of the good amount of information regarding DMBA carcinogenesis histopathology in rat’s submandibular parenchyma, little is known about the immunohistochemistry in such tumors. We proposed a revision of a previous research conduced by Mainenti (2006), in attempt to better understand the neoplasm formation after DMBA. The original experiment disclosed non neoplastic lesions, mainly sialadenitis, and tumors like carcinomas, carcinosarcomas and one case of sarcoma. The present work used all the material from the first research like surgical specimens in formol and slides. We compared the previous hematoxylin and eosin slides with new ones. We also used Gomori’s trichrome in order to disclose collagen fibers. The immunohistochemistry was performed using the following antibodies: AE1/AE3, vimentin, α-SMA, calponin, desmin, myogenin, S-100, CerbB-2 and EMA. Some previous lesions, presented as benign ones, were diagnosed as carcinomas. The immunohistochemistry was positive as shown: AE1/AE3 for epithelial neoplasm, vimentin for connective tissue in mesenchymal tumors, α-SMA and calponin for scarce pleomorphic fusiform cells in the stroma of the carcinomas and in the mesenchymal neoplasms. We concluded that the immunohistochemistry strongly suggested myofibroblast differentiation in the stroma of the carcinomas and myofibroblast cells related to the fibrosarcoma and carcinosarcomas. These cells produced collagen shown after Gomori’s trichrome. The epithelial neoplasm component was suggested as derived from luminal cells.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de la matriz extracelular del corazón. Luego de un daño al miocardio, además, participan activamente del remodelado cardiaco como tal o diferenciándose a miofibroblasto, un fenotipo celular que presenta características que lo hacen apto para funciones de cicatrización. Se ha observado que luego de un daño al miocardio, el corazón está expuesto a un mayor tono adrenérgico con la finalidad de compensar la disfunción adquirida por la injuria del tejido. Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol induce autofagia en fibroblastos cardiacos de rata adulta, un proceso degradativo que se ha reportado capaz de perder su equilibrio en diversas patologías cardiovasculares. Por esto, se vuelve interesante determinar si estos mismos estímulos son capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos, células que aparecen sólo cuando hay daño al miocardio. Los resultados muestran que tanto fibroblastos como miofibroblastos cardiacos presentan receptores adrenérgicos sólo del subtipo β2. Miofibroblastos cardiacos presentaron mayor número de receptores β2-adrenérgicos y con mayor afinidad por sus ligandos que fibroblastos cardiacos. En ambos fenotipos celulares los receptores mencionados se encuentran funcionales. En cuanto a la autofagia, los estímulos clásicos inductores de autofagia (rapamicina y/o privación de nutrientes) y la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol inducen autofagia en fibroblastos. De modo distinto, estos inductores no fueron capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos de rata adulta, aunque se encontró que en condiciones basales presentaban mayor nivel de autofagia que los fibroblastos. Los resultados demuestran que los miofibroblastos cardiacos son resistentes a la inducción de autofagia por estimulación β2-adrenérgica, lo que puede abrir una puerta para el entendimiento del rol de este proceso en estados patológicos del corazón.