Le coenzyme Q (ubiquinone ou Q) est une molécule organique lipophile composée d'une benzoquinone substituée et d'une chaîne polyisoprényle contenant 6 unités chez Saccharomyces cerevisiae (Q6), 8 chez Escherichia coli (Q8) et 10 chez l'homme (Q10). Q a un rôle bien connu de transporteur d'électrons dans les chaînes respiratoires et fonctionne également comme un antioxydant membranaire. La déficience primaire en Q10 a maintenant été attribuée à des mutations dans 6 gènes de la biosynthèse de Q10 et cause des pathologies sévères. La biosynthèse de Q6 est mitochondriale et nécessite au moins 9 protéines organisées au sein d'un complexe multiprotéique chez la levure (Coq1-Coq9). L'acide 4-hydroxybenzoique (4-HB) et l'acide para-aminobenzoique (pABA) sont les deux précurseurs connus du noyau aromatique de Q6. Malgré de nombreuses recherches et l'importance cruciale de Q dans le métabolisme eucaryote, certaines étapes de la voie de biosynthèse de Q ne sont pas connues. L'étude présentée dans ce manuscrit a permis de montrer l'implication de la protéine Coq6, proposée comme étant une mono-oxygénase à flavine, dans une seule des trois réactions d'hydroxylation que compte la voie de biosynthèse de Q6: l'hydroxylation en C5. De plus, notre étude sur Coq8, une protéine kinase dont sa surexpression stabilise le complexe multiprotéique, nous a permis de confirmer les fonctions de certaines protéines Coq (Coq5, Coq7), de découvrir la fonction de Coq6 et d'éclaircir le rôle des autres (Coq4, Coq9). Nous rapportons également que des analogues hydroxylés ou méthoxylés de 4-HB et du pABA peuvent court-circuiter des étapes déficientes des mutants particuliers conduisant ainsi à la synthèse du coenzyme Q6 dans ces derniers. Ce résultat ouvre de nouvelles perspectives pour traiter les déficiences en coenzyme Q10 qui jusqu'à présent sont traitées par supplémentation en Q. Finalement, la réaction de déamination, essentielle à la biosynthèse de Q6 à partir du pABA, reste incomprise mais nos résultats suggèrent fortement l'implication de Coq6 dans cette étape.

Blastocystis sp., est un straménopile parasite anaérobie fréquemment rencontré dans le tractus gastro-intestinal de l'homme et de divers animaux. Ce microorganisme, parfois responsable de désordres digestifs aigus, pourrait conduire à des troubles fonctionnels intestinaux tels que le syndrome de l'intestin irritable (IBS). Le génome de Blastocystis sp., qui a fait l'objet d'un projet de séquençage en collaboration avec le Génoscope d'Evry, nous a permis de caractériser le plus petit génome de straménopile séquencé à ce jour (18,8 Mpb), avec une capacité codante de 6020 gènes. L'acquisition de nombreux gènes par transferts horizontaux est une caractéristique majeure de ce génome, qui montre d'abondants réarrangements génomiques. Bien qu'évoluant en anaérobiose, Blastocystis sp. possède des organites morphologiquement proches des mitochondries, appelés mitochondrion-like organelles (MLOs). Nous avons montré que ces organites comportaient un génome circulaire de type mitochondrial de 29,27 kpb, mais dépourvu des gènes codant pour les cytochromes. Des analyses in silico nous ont permis de caractériser le protéome des MLOs (365 protéines), conduisant à l'établissement d'un modèle prédictif des voies métaboliques associées à ces organites, avec notamment une chaine respiratoire limitée aux complexes I et II. Nous avons ainsi montré que les MLOs présentent des caractères communs aux mitochondries anaérobies et aux hydrogénosomes (présence d'une PFOR et d'une hydrogénase à fer), suggérant que Blastocystis sp. comporte des mitochondries anaérobies modifiées, qui résulteraient d'une adaptation du parasite à son environnement. Par ailleurs, la prédiction du sécrétome de Blastocystis sp. révèle la présence de facteurs de virulence potentiels, pouvant être impliqués dans l'altération de l'épithélium intestinal et le contournement du système immunitaire de l'hôte.

Le maintien ou le renforcement de la masse et de la fonction musculaire, altérées chez les patients BPCO, est un objectif primordial pour préserver, voire améliorer leur tolérance à l'effort, leur qualité de vie et leur survie. Afin d'optimiser la prise en charge de cette dysfonction musculaire, la réhabilitation est complétée par des interventions nutritionnelles, encore appelées réhabilitations nutritionnelles. Dans ce contexte, l'apport d'acides gras polyinsaturés de la série n-3, et plus particulièrement d'acide docosahexaénoïque (DHA), pourrait s'avérer intéressant en raison de leurs effets bénéfiques démontrés dans plusieurs pathologies chroniques. L'objectif de ce travail était donc de caractériser les effets d'une supplémentation en DHA sur la tolérance à l'effort et sur le métabolisme énergétique des muscles squelettiques de rats adultes exposés à une hypoxie comme modèle de muscle de patient BPCO au stade de l'insuffisance respiratoire chronique. La tolérance à l'effort est améliorée par le DHA, que les rats soient conditionnés en normoxie ou en hypoxie. En normoxie, les mécanismes impliqués seraient liés à un effet du DHA mimétique de celui d'un exercice d'endurance, avec une activation de l'AMPK et une amélioration de la fonction mitochondriale étudiée sur fibres musculaires perméabilisées. En hypoxie, le DHA agirait différemment, réduisant les effets de l'hypoxie sur le muscle, sans que les mécanismes mimétiques de l'exercice d'endurance ne soient clairement retrouvés. La prise de DHA chez des rats entrainés et conditionnés en hypoxie permet également un gain d'endurance mais les mécanismes à l'origine de cet effet ne sont pas élucidés et nécessitent des travaux complémentaires. Au vu des résultats sur le muscle, la supplémentation en DHA pourrait donc être bénéfique dans la prise en charge de la dysfonction musculaire dans les maladies chroniques telles que la BPCO.

Depuis plusieurs décennies, la médecine constate une augmentation des pathologies prolifératives, de surcharge lipidiques et neurodégénératives. Les maladies métaboliques sont les plus fréquentes, insulinorésistance, diabètes de type 2 ou encore obésités pathologiques. Il est évident que ces pathologies sont d'origine multifactorielle. Une cause environnementale est de plus en plus fréquemment évoquée, comme facteur causal ou comme facteur aggravant. Ces dernières décennies ont vu une inflation de d'utilisation des produits phytosanitaires dans des usages industriels ou agricoles. Ces xénobiotiques sont suspectés de favoriser les pathologies dites "environnementales". Il apparaît que même les doses faibles de ces produits induisent des effets métaboliques. Nous avons étudié l'effet de 2 organochlorés, le lindane et le chlordécone, sur la fonction mitochondrial et le métabolisme énergétique cellulaire. Cette étude a été menée sur des cellules HepG2, et des durées courtes avec des doses correspondant aux concentrations plasmatiques moyennes retrouvées dans les zones d'exposition. Ces molécules pesticides induisent un stress mitochondrial qui semble se résoudre sur une durée courte. Pourtant certaines perturbation des régulations métaboliques mitochondriales et du dialogue nucléo-mitochondrial perdurent sur des durées plus longues. Il en va ainsi de l'expression des facteurs régulateurs, anomalies favorisant des dysfonctionnements cellulaires pouvant être à l'origine de maladies "environnementales". Nous proposons que l'analyse de la fonction mitochondriale pourrait être une approche intéressante pour l'étude des effets toxiques des faibles doses de xénobiotiques.

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples. / The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection.

L'altération de la fonction mitochondriale, β-cellules pancréatiques, et l'homéostasie du glucose de la descendance de rat de l'exerciceContexte. Il est connu que l'environnement gestationnel est reconnue comme un facteur essentiel pour le développement du fœtus et étroitement liée à l'état de santé dans la vie plus tard. Environnement inadéquat pour le fœtus tels que le stress oxydatif intra-utérine est très nocif pour le développement du fœtus. Par conséquent, un effort de prévention de surmonter ce problème est nécessaire en modifiant l'environnement autour de la gestation par l'exercice durant cette période.Objectifs. Le but de cette étude était de connaître le rôle des mitochondries dans la prévention du stress oxydatif pendant la grossesse, en augmentant système antioxydant et la fonction du pancréas et dans l'amélioration de l'homéostasie du glucose de l'enfant de la mère qui a été induite par l'exercice régulier d'intensité modérée.Méthodes. Cette étude a été réalisée au Laboratoire de bioénergétique appliquée et fondamentale Inserm U1055, Université Joseph Fourier, Grenoble-France. Les sujets étaient rat Wistar femelle qui ont été divisés en 2 groupes, le groupe sédentaire et l'exercice. L'entraînement physique a été effectué 4 semaines avant et jusqu'à ce que le 18e jour de la gestation. Thiol et GPx ont été mesurées en utilisant un dosage biochimique. Consommation d'O2 a été mesurée avec oxygraphie. L'activité du complexe respiratoire, cytochrome et ROS ont été mesurées par spectrophotométrie. Citrate synthase, la protéine kinase B (PKB), quinone et tocophérol ont été mesurées en utilisant un dosage biochimique. La graisse viscérale et du pancréas total ont été pesés, et la taille de l'île de Langerhans a été analysé par la préparation de l'histologie. Les résultats ont été analysés en utilisant le test t.Résultats. Il a été constaté que l'état redox du nouveau-né est égal. La diminution de thiol suivie par une augmentation de l'activité antioxydante GPx (p <0,001). L'efficacité de la consommation et de l'activité du complexe respiratoire, suivie par une augmentation de cytochrome, la quinone et du tocopherol oxygène provoque la diminution de la production de ROS de la progéniture de rat de levées mère (p <0,001). La sécrétion d'insuline a augmenté de 74% et l'activité PKB était plus élevée (p <0,05). Tolérance au glucose et de l'insuline (âgés de 3 mois) étaient mieux (p <0,05), la taille de l'île de Langerhans et le poids du pancréas étaient plus petits (p = 0,021) chez la progéniture de rat de l'exercice mère. À l'âge de 3 mois, le taux de glucose dans le sang était inférieur de 8% (p = 0,046), l'insuline à jeun était plus élevé de 72% (p = 0,009) et le poids corporel était inférieur (p = 0,041) de la progéniture de rat de l'exercice mère par rapport à ceux de la mère sédentaire, mais le total de graisse viscérale était pas différente (p> 0,05).Conclusion. L'exercice régulier d'intensité modérée pour la mère de 4 semaines avant et jusqu'à ce que le 18e jour de la gestation a été très efficace pour augmenter le système antioxydant et réduire le stress oxydatif dans la grossesse qui est en mesure de réduire le risque d'obésité pour la progéniture par l'amélioration de l'homéostasie du glucose à travers l'augmentation des mitochondries et la fonction pancréatique de la progéniture de rat. L'altération des mitochondries et la fonction du pancréas que l'impact de l'exercice régulier de la mère est permanente pendant l'observation puisque le bébé est né, âgé de 21 jours et 3 mois.Mots-clés: exercice, programmation fœtale, l'homéostasie du glucose, insuline, les mitochondries, l'obésité, le stress oxydatif, β-cellules pancréatiques, les espèces réactives de l'oxygène. / Influence de l'environnement (exercice et nutrition) durant la gestation sur l’état de stress oxydant et le métabolisme du glucose de la descendance.Les maladies métaboliques sont en pleine expansion dans nos sociétés actuelles et constituent un enjeu de santé publique majeur. Les antécédents familiaux, l'environnement et les habitudes de vie de l'individu vont jouer un rôle dans la susceptibilité à certains de ces désordres métaboliques. Sur la base de données épidémiologiques, un lien a été établi entre environnement durant les premières phases de la vie et survenue de pathologies à l'âge adulte conduisant au concept des "Developmental Origins of Health and Diseases" (DOHaD). Le premier objectif de ce travail était d'étudier, à partir d'un modèle murin, les conséquences de l'exercice physique quotidien de la mère pendant la gestation sur la composition corporelle, le statut oxydant, la fonction pancréatique et mitochondriale du foie et du muscle et la gestion des substrats énergétiques de la descendance. Un deuxième objectif était de valider un modèle de diabète gestationnel à partir d’un régime riche en fructose et d’étudier l’effet d’une supplémentation en fer durant ce diabète gestationnel sur le statut oxydant et la tolérance au glucose des mères et de la descendance. Nos résultats montrent une réduction significative de la production mitochondriale d’H2O2, un indicateur de la production d’espèces réactives de l’oxygène, dans le foie et dans le muscle des petits de mères entrainées. Ces changements sont reliés à des altérations de la consommation d’oxygène mitochondriale, de la composition des membranes mitochondriales et de l’activité des enzymes antioxydantes. De plus, l'entraînement maternel avant et pendant la gestation est associé à des modifications de la structure et de la fonction du pancréas de la descendance et semble modifier sa gestion des substrats énergétiques.Nous avons également confirmé qu’une diète riche en fructose durant la gestation peut être utilisée comme un modèle induisant un diabète gestationnel. Nous avons ainsi démontré chez les petits nés de mères nourries avec un régime riche en fructose et en fer, que les activités des enzymes antioxydantes comme la glutathion peroxidase (GPx), la glutathion-S-transferase dans le foie et la GPx dans le cerveau étaient altérées, les résultats étant différents selon le sexe des petits. Les différents résultats obtenus chez la descendance montrent que dans le cas d’un diabète gestationnel, les fœtus sont plus sensibles que leurs mères aux effets d’un régime riche en fer. Ce travail de thèse vient compléter les travaux menés dans le cadre des DOHaD et renforce l'idée que l'environnement lors des premières phases de la vie va avoir des conséquences sur la santé de l'individu.Mots-clés : exercice, gestation, descendance, mitochondries, stress oxydant, diabète gestationnel, fer, régime riche en fructose.

Le VDAC (Voltage-Dependent Anion-selective Channel) est un canal ionique de la membrane externe de la mitochondrie. Il est caractérisé par une haute conductance (4nS dans du KCl 1M) à des faibles différences de potentiel et des fermetures vers des niveaux de conductance inférieurs suite à l’application de voltages élevés. La selectivité de l’état de haute conductance est anionique alors que celle du principal état de faible conductance est fortement cationique. La structure secondaire et la fonction est bien conservée chez les animaux, les plantes et les champignons alors que les séquences sont très différentes (moins de 30% d’identités). Au sein des différents groupes, quelques isoformes coexistent.<p>La première partie du travail consiste à étudier l’évolution des isoformes de VDAC, à déterminer le nombre et les propriétés des isoformes. Nous montrons que les végétaux possèdent plus d’isoformes que les mammifères et que celles-ci sont également moins bien conservées. Nous avons défini trois classes d’isoformes sur base de leur charge nette :faiblement, moyennement ou fortement chargées. Les VDAC fortement exprimés et très bien conservés chez les champignons, les plantes et les animaux sont moyennement chargés. A l’opposé, les isoformes portant les plus hautes charges nettes sont très divergentes et peu exprimées. Ces particularités permettent pour la première fois de comparer les isoformes de groupes évolutivement distants.<p>Ensuite, pour relier la structure et la topologie du VDAC à sa fonction, nous avons construit un modèle topologique. Il consiste en feuillet bêta de 18 brins antiparallèles reployés de manière à former un tonneau transmembranaire présentant une courte hélice alpha à son extrémité aminoterminale. Le modèle est compatible avec les séquences de VDAC fongiques, végétaux et animaux. Il rend compte des résultats expérimentaux obtenus par spectroscopie infrarouge et par microscopie électronique de cristaux 2D. Enfin, les résultats d’études topologiques et fonctionnelles publiées dans la littérature supportent également notre modèle.<p>Nos travaux concernant le VDAC32 de Phaseolus coccineus a permis d’améliorer le protocole de purification et d’en obtenir la séquence. La structure et la stabilité du VDAC32 a été étudiée par spectroscopie infrarouge. L’étude de l’orientation du VDAC à l’aide de lumière infrarouge polarisée se base sur des modèles définissant deux angles, alpha et bêta correspondant à l’inclinaison de l’axe du tonneau par rapport à la normale à la membrane et l’inclinaison des brins par rapport à l’axe du tonneau. Nous proposons que l’angle alpha dépend également de l’asymétrie de la protéine. Nos mesures en spectroscopie infrarouge indiquent que la présence du VDAC diminue la température de transition de la membrane et que la structure protéique est sensible à la transition de phase des lipides membranaires. Enfin, nous montrons que la structure du VDAC est modifiée quand le rapport lipides/protéines diminue. L’orientation des brins bêta se rapproche de l’axe et les chaînes latérales des tyrosines deviennent moins ordonnées.<p>Les VDAC sont insérés dans la membrane mitochondriale qui contient environ 5% de stérols. Certains auteurs ont détecté le VDAC dans les membranes plasmiques. Ces dernières sont beaucoup plus riches en stérols. Nous montrons dans ce travail que le VDAC possède la même fonction dans des membranes contenant 0% ou 5% de stérols alors que sa structure est légèrement modifiée. Par contre, en présence de hautes concentrations en stérols, la fonction du VDAC est sensiblement altérée. Ces résultats suggèrent que le VDAC a des propriétés différentes dans la membrane plasmique et dans l’enveloppe de la mitochondrie.<p> / Doctorat en sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La cachexie est un syndrome complexe caractérisé par une balance énergétique négative. Le rôle joué par le métabolisme énergétique mitochondrial dans ce syndrome est peu connu. Nos précédents travaux montraient une diminution de la synthèse de l’ATP dans les mitochondries hépatiques en stade de cachexie cancéreuse sévère. Dans ce travail, nous démontrons, in vitro, que l’augmentation de la production d’espèce réactive de l’oxygène et du contenu en cardiolipine dans des mitochondries hépatiques saines, mime partiellement les mécanismes observés lors d’un stade cachexie sévère. Nous observons cependant que l’altération du métabolisme mitochondrial hépatique apparait à un stade tardif du développement de la cachexie. En stade sévère les mitochondries musculaires ne développent pas d’altération de leur efficacité de synthèse d’ATP mais une diminution des leurs capacités oxydatives. / Cancer cachexia is a composite syndrome, characterized by a negative energetic balance. The role played by mitochondrial energetic metabolism in this syndrome is poor known. Our past work showed a decrease of ATP synthesis efficiency in hepatic mitochondria in severe state of cancer cachexia. In this work, we demonstrate, in vitro, that increase of reactive oxygen species and cardiolipine content, in healthy mitochondria, can partly mimic the mechanisms observed in severe state of cancer cachexia. We observe that alteration of hepatic mitochondrial metabolism appear last during the development of cancer cachexia. In sever state of cancer cachexia, skeletal muscle mitochondria don’t develop this alteration but demonstrated a decrease of oxidative capacities.

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Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses voies métaboliques, et des mutations au sein de leur génome (ADNmt) conduisent à l’apparition de nombreuses pathologies. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement contre ces affections mais différentes pistes thérapeutiques sont envisagées. L’objectif de ce travail a consisté en la mise au point d’une telle stratégie, dite anti-réplicative via l’exploitation de la voie d’import naturelle des ARN dans les mitochondries. De petits ARN artificiels importables dans les mitochondries humaines ont ainsi été utilisés comme vecteurs pour y importer une séquence capable de s’hybrider spécifiquement à l’ADNmt mutant et d’en stopper sa réplication. Les résultats obtenus ont permis de prouver la validité de cette stratégie vis-à-vis d’une large délétion et de mutations ponctuelles liées à divers cas pathologiques et de caractériser l’effet de modifications chimiques sur la stabilité, l’import et l’efficacité de ces ARN recombinants. / Mitochondria are involved in many metabolic pathways, and mutations in their genome (mtDNA) can cause a wide range of human disorders. No efficient treatment against these pathologies is currently available. The objective of this work consisted in the development of a therapeutic approach, called anti-replicative, based on the use of the natural pathway of RNA import into mitochondria. Small artificial RNA molecules able to be imported into human mitochondria have been used as vectors to address oligoribonucleotides capable to hybridize specifically to mutant mtDNA and to stop its replication. The effect of various chemical modifications on the stability, import and efficiency of these recombinant RNA has been characterized. All the data obtained prove the validity of the anti-replicative strategy for mtDNA containing a large deletion or pathogenic point mutations and can be considered as an important step to further develop an efficient therapy of mitochondrial diseases.