Chez les plantes, les protéines à centre fer-soufre (Fe-S) sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires (e.g. photosynthèse, respiration). La maturation de ces protéines nécessite la synthèse de novo des centres Fe-S à l’aide de machineries d’assemblage spécifiques. Les plantes possèdent trois machineries d’assemblage nommées SUF, ISC et CIA, dédiées à la maturation des protéines plastidiales, mitochondriales et nucléaires ou cytosoliques, respectivement. Lors de la maturation des protéines mitochondriales, un centre [2Fe-2S] est initialement assemblé sur la protéine d’échafaudage ISU puis transféré vers les apoprotéines cibles à l’aide de chaperons et de diverses protéines de transfert. Si ces étapes semblent suffisantes pour la maturation de protéines incorporant des centres [2Fe-2S], un couplage réductif de deux centres [2Fe-2S] est nécessaire pour la maturation des protéines de type [4Fe-4S]. Cette conversion nécessite des protéines de transfert et un donneur d’électrons, potentiellement la même ferrédoxine que celle qui agit déjà lors des étapes précoces pour la réduction du soufre. En combinant des approches moléculaires, biochimiques et génétiques, l’implication des protéines de transfert NFU et ISCA et des ferrédoxines mitochondriales (mFDX) dans les étapes tardives de transfert et de conversion a été explorée au cours de cette thèse chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Des expériences de complémentation en levure ont démontré que les protéines NFU et ISCA de plantes peuvent assurer les mêmes fonctions que leurs orthologues respectifs, suggérant que ces étapes tardives ont été conservées. Cependant, contrairement à la levure, l’analyse de lignées n’exprimant pas les deux protéines NFU indiquent qu’elles sont essentielles pour le développement de l’embryon. Au niveau moléculaire, les analyses effectuées à l’aide d’approches in vivo et/ou in vitro ont permis d’identifier une interaction entre ISCA1a ou ISCA1b et ISCA2, NFU4 et NFU5 mais aucune interaction avec les deux mFDX dont le rôle dans les dernières étapes d’assemblage des centres Fe-S reste donc incertain. La formation d’holo-hétérocomplexes entre ISCA1 et ISCA2 a été confirmée par co-expression chez E. coli et purification des protéines recombinantes. Globalement, en associant la littérature à propos de la machinerie ISC et les résultats obtenus, le modèle qui ressort est que des hétérocomplexes ISCA1/2 agiraient immédiatement en amont des protéines NFU qui permettraient a minima la maturation des centres [4Fe-4S] de la lipoate synthase. Ce seul partenaire pourrait expliquer en grande partie la létalité d’un mutant nfu4 x nfu5 car l’activité de plusieurs protéines centrales pour le métabolisme mitochondrial dépend de l’acide lipoïque / In plants, iron-sulfur (Fe-S) proteins are involved in crucial processes such as photosynthesis and respiration. The maturation of these proteins requires the de novo synthesis of their Fe-S clusters through dedicated assembly machineries. Plants have three Fe-S cluster assembly machineries, namely SUF, ISC and CIA, devoted to the maturation of plastidial, mitochondrial and nuclear or cytosolic proteins, respectively. During the mitochondrial Fe-S protein maturation, a [2Fe-2S] cluster is first assembled on the ISU scaffold protein then transferred to target proteins with the help of chaperones and various transfer proteins. If these steps are sufficient for the maturation of [2Fe-2S] proteins, a reductive coupling process of two [2Fe-2S] clusters is required for the maturation of [4Fe-4S] proteins. This conversion needs transfer proteins and an electrons donor, potentially the same ferredoxin which acts during the first step of the Fe-S cluster biogenesis for sulfur reduction. By combining molecular, biochemical and genetic approaches, the involvement of NFU and ISCA transfer protein and mitochondrial ferredoxin (mFDX) in the late transfer and conversion steps has been explored during this PhD project by using the Arabidopsis thaliana plant model. Yeast complementation experiments have demonstrated that plant NFU and ISCA proteins have functions similar to their respective orthologs, suggesting that these late steps are conserved. However, unlike yeast, the characterization of nfu mutant lines indicates that both proteins are essential for early embryonic development. At the molecular level, in vivo and in vitro approaches have shown an interaction between ISCA1a or ISCA1b and ISCA2, NFU4 and NFU5 but no interaction with the two mFDX whose participation in the late steps remains uncertain. The formation of ISCA1-ISCA2 holo-heterocomplexes has been confirmed by co-expression in E. coli and purification of recombinant proteins. Overall, the literature and results obtained here highlight a model where ISCA1/2 heterocomplexes would act immediately downstream of NFU proteins which would a minima allow [4Fe-4S] cluster maturation of the lipoate synthase. This sole partner could primarily explain the lethality of a nfu4 x nfu5 double mutant because the activity of several proteins central for the mitochondrial metabolism depends on lipoic acid

Le syndrome métabolique (SM) est défini comme l'association de troubles favorisant les risques cardiovasculaires et le développement d'un diabète de type 2. Une personne atteinte de SM doit présenter au moins 3 critères sur les 5 suivants : une obésité abdominale; un taux élevé en triglycérides ; un faible taux en cholestérol HDL ; une hypertension et une hyperglycémie. Le SM est caractérisé par une dysfonction endothéliale, qui est définie par une diminution de la production de monoxyde d'azote (NO), et l'augmentation d’espèces réactives de l’oxygène, comme l'anion superoxyde (O2-), participant au stress oxydant. Dans notre étude, nous avons émis l’hypothèse que les exosomes pouvaient participer à la dysfonction endothéliale chez ces patients. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de petite taille (entre 30 à 100 nm), formées à partir du compartiment endo-lysosomal et libérées par la plupart des cellules. Suite à leur libération, elles peuvent interagir avec des cellules cibles et servir ainsi de vecteurs d'information biologique. Il a été montré que les exosomes pouvaient être impliqués dans de nombreuses pathologies. Ainsi, nous avons montré que les patients atteints de SM présentent un taux d’exosomes circulants augmenté, dont la taille est diminuée. De plus, les exosomes provenant de patients SM diminuent la production de NO dans les cellules endothéliale, qui s’accompagne d’une augmentation de l’O2-mitochondriale. Chez la souris, les exosomes de patients SM induisent une diminution du relâchement vasculaire. Les exosomes pourraient ainsi participer au développement de la dysfonction endothéliale chez les patients atteints de SM et pourraient être de biomarqueurs intéressants pour cette pathologie. / Metabolic syndrome (MetS) is defined as the combination of metabolic disorders leading to cardiovascular diseases and the development of type 2 diabetes. To be diagnosed with MetS, a person must present at least 3 of the following 5 metabolic risk factors: (i) abdominal obesity, (ii) high triglyceride levels,(iii) low HDL cholesterol levels, (iv) hypertension and (v) hyperglycaemia. MetS is characterized by endothelial dysfunction, which is defined by a decreased nitric oxide (NO) production, and an increased in reactive oxygen species such as superoxide (O2-), involved in oxidative stress. In our study, we hypothesized that exosomes could participate in the endothelial dysfunction observed in MetS patients. Exosomes are nanoscaled (30-100nm) extracellular vesicles produced from the endolysosomal compartment and released by most of the cells of the organism. Following their release, they can interact with their target cells and be considered as biological information carriers. Exosomes have been shown to be involved in many pathologies. Thus, we have shown that MetS patients displayed an increased circulating rate of exosomes whose sizes were decreased. In addition, we have observed that exosomes from MetS patients induced (i) a decrease of NO production in endothelial cells, and (ii) an increase in mitochondrial O2-. Furthermore, the exosomes originating from MetS patients induced a decrease invascular relaxation in mice. Thus, the exosomes could participate in the development of endothelial dysfunction in MetS patients and could be considered as biomarkers of interest for this pathology.

Le but de ce travail a été d'étudier l'adaptation β-cellulaire au stress oxydant (SO) dans un modèle animal de diabète de type 2, le rat GK/Par. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons évalué le stress oxydant insulaire et l'impact des espèces réactives de l'oxygène (ERO) sur la sécrétion de l'insuline. Les îlots de rats diabétiques GK/Par apparaissent protégés contre le SO, car (i) les marqueurs de SO ciblent essentiellement la périphérie insulaire (aires vasculaires et inflammatoires) ; (ii) l'accumulation d"ERO est plus faible comparativement aux îlots témoins (Wistar) ; (iii) leur sécrétion de l'insuline n'est pas altérée après exposition aux ERO ; et (iv) ces adaptations sont associées à une augmentation des défenses antioxydantes insulaires. Dans un deuxième volet, nous avons vérifié si ces mécanismes adaptatifs pouvaient expliquer la protection des cellules β contre l'apoptose chez le rat GK/Par diabétique. Nous avons montré que le phénotype particulier de l'îlot GK/Par diabétique consiste, ex vivo, en une augmentation des gènes anti-apoptotiques, associée in vitro à une résistance contre l'apoptose induite par les ERO. Nous avons démontré que l'AMPc joue un rôle dans cette résistance à l'apoptose. Compte tenu de l'existence de sources d'ERO proches des cellules endocrines insulaires chez le rat GK/Par, nous avons, dans un dernier volet, étudié le rôle d'une dysfonction endothéliale et du processus inflammatoire associé (phénomène au potentiel pro-oxydant) dans l'adaptation antioxydante des îlots. Le blocage de la voie IL-1 via un traitement in vivo par IL-1Ra a permis, au niveau insulaire, de diminuer l'activation endothéliale, le stress inflammatoire et de normaliser l'expression des gènes antioxydants. Enfin, puisqu'il existe une production d'ERO insulaire précoce chez le rat GK/Par (avant l'installation du diabète), nous suggérons qu'elle soit à l'origine de l'augmentation des défenses antioxydantes/anti-apoptotiques. Cette adaptation est en place après installation du diabète et permet à l'îlot GK/Par de contrer l'environnement diabétogène pro-oxydant (glucolipotoxicité, inflammation). Enfin, nous proposons que la dysfonction β-cellulaire engendrée par un excès d'antioxydants endogènes soit le prix à payer pour protéger la cellule β du rat GK/Par de la mort cellulaire.

L'objectif de mon travail de doctorat était une caractérisation fonctionnelle des gènes TCTP et TSAP6. Ces gènes sont impliqués dans la réversion tumorale et forment un complexe protéique. <br />Tpt1, codant pour la protéine TCTP, est le gène le plus sous-exprimé lors de la réversion tumorale. L'analyse du cristal de TCTP humain montre une forte homologie entre ses hélices H2-H3 et les hélices H5-H6 de Bax. Grâce à ses hélices, TCTP inhibe l'apoptose induite par Bax au niveau des mitochondries. En effet, nous démontrons que TCTP, entre autres par le biais de ces hélices, empêche la dimérisation de Bax. <br />Nous avons aussi développé une lignée de souris TCTP knockout qui présentent une létalité embryonnaire précoce.<br />En parallèle, nous avons étudié TSAP6, qui encode pour une protéine à 6 domaines transmembranaires et qui est une cible transcriptionnelle directe de la p53. Nous avons établi une lignée murine TSAP6 knockout présentant une anémie microcytaire avec une splénomégalie. Les réticulocytes issus des souris knockout présentent un retard de maturation et une anomalie de sécrétion du Récepteur à la Transferrine par les exosomes. De manière plus générale, les résultats obtenus montrent, in vivo, que TSAP6 contrôle la sécrétion des exosomes induite par activation de la P53. Nous montrons aussi que la Sertraline et la Thioridazine empêchent la formation du complexe TSAP6-TCTP.

Toutes les actions biologiques de l'hormone de croissance (GH) sont initiées par l'interaction de l'hormone avec un homodimère de son récepteur spécifique (GHR2) présent au niveau de la surface de ses cellules-cibles. Cette association conduit à l'activation de différentes voies de transduction du signal intracellulaire ainsi qu'à l'internalisation du complexe GH-GHR2, notamment au niveau de la mitochondrie. L'objectif de cette étude est de montrer le mécanisme et l'implication de l'internalisation par les cavéoles dans la régulation de l'action de la GH au niveau de la fonction mitochondriale. Nous avons montré l'importance de la boîte 1 du GHR dans la stimulation de l'activité respiratoire globale ; le transport de la GH par la voie des cavéoles dans la mitochondrie ; l'importance de la localisation intramitochondriale de la GH dans la régulation des complexes II et IV de la chaîne respiratoire. Ces résultats suggèrent une nouvelle voie d'action directe de la GH sur la mitochondrie

Ce travail de thèse s'intéresse principalement à la régulation de la respiration mitochondriale in situ dans les cellules de muscle cardiaque et squelettiques. L'oxygraphie, la spectrophotométrie et la microscopie confocale sur cellules isolées ou fibres musculaires perméabilisées à la saponine ont été utilisées ainsi que la modélisation mathématique. Dans les cellules musculaires, les mitochondries sont organisées de manière très précise tel un ‘cristal'. Cet arrangement intracellulaire serait la base d'une organisation à la fois structurale et fonctionnelle au sein desquelles les mitochondries sont couplées fonctionnellement par le cytosquelette aux autres organelles : réticulum sarcoplasmique et myofibrilles: les ICEUs (ou unités énergétiques intracellulaires). Au sein des cellules cardiaques, il existe 2 niveaux de régulation de la respiration mitochondriale par l'ADP exogène : la perméabilité de la membrane mitochondriale externe (VDAC) et des restrictions localisées de diffusion de l'ADP au voisinage des mitochondries. La Β-tubuline participe indirectement à ces mécanismes de régulation de même que la protéine STOP, une protéine associée aux microtubules. Ces données expérimentales sont utiles pour expliquer les aspects métaboliques de la loi de Frank-Starling dans le cœur. Cette notion d'ICEU peut servir de diagnostique lors de l'étude clinique du métabolisme énergétique chez des transplantés pulmonaires avant et après un programme d'entraînement à domicile.

L'atrophie optique autosomique dominante (ADOA) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A) sont deux neuropathies héréditaires respectivement liées aux mutations des gènes OPA1 et MFN2. Les protéines OPA1 et MFN2 sont impliquées dans la dynamique de fusion des mitochondries. Ces organites intracellulaires sont essentiels dans les processus de synthèse d'ATP. L'hypothèse d'un déficit énergétique impliqué dans la physiopathologie de ces neuropathies devait alors être testée. Nous avons mis en évidence une baisse d'efficacité des phosphorylations oxydatives dans les fibroblastes de peau de patients atteints d'ADOA et de CMT2A. Ce découplage est associé à une baisse d'activité du complexe IV et à une augmentation de l'activité du complexe V dans le cas de l'ADOA. Dans le cas de la CMT2A, le découplage est associé à une augmentation de l'activité et de la quantité de la translocase des nucléotides adényliques (ANT). Une étude sur mitochondries isolées de cerveaux d'un modèle murin MFN2(R94Q) de CMT2A montre une baisse d'activité des complexes II et V associée à l'ouverture du canal mitochondrial potassique sensible à l'ATP (mKATP). Nos résultats montrent qu'OPA1 et MFN2, deux protéines de la dynamique mitochondriale ont un rôle majeur dans la régulation énergétique mitochondriale.

L'insuffisance cardiaque (IC) reste la cause majeure de morbimortalité dans les pays industrialisés justifiant ainsi la recherche de traitements plus ciblés. Caractérisée par des désordres métaboliques importants qui impliquent notamment une dysfonction mitochondriale, le métabolisme énergétique apparait comme une composante majeure du développement de l'IC. Ces dernières années, le co-activateur transcriptionnel PGC-1α a été proposé comme un acteur central du contrôle de la fonction mitochondriale et constitue ainsi une cible thérapeutique d'intérêt. Ainsi, l'objectif principal de ce travail est de développer un test cellulaire robotisé permettant la recherche d'activateurs de PGC-1α dans un contexte cardiaque.La mise en place de ce test cellulaire de criblage dans des cellules H9c2 différenciées en cellules pseudo-cardiaques a permis l'identification de trois familles majeures : les hormones stéroïdiennes, les vitamines B et les acides gras, capables d'activer l'expression de PGC-1α et par ce biais d'induire une biogenèse mitochondriale ainsi qu'une augmentation de la respiration mitochondriale. La validation de ces effets dans des cardiomyocytes de rat adulte a permis d'une part de valider la pertinence du test et du choix du modèle cellulaire et d'autre part de vérifier qu'une induction de l'expression de PGC-1α se répercute bien sur la cascade transcriptionnelle de la biogenèse mitochondriale. Ce test constitue donc un atout majeur dans le recherche de nouveaux activateurs de PGC-1α pour mieux comprendre ses mécanismes de régulation dans le cœur, mais offre aussi des perspectives intéressantes pour la recherche de composés pharmacologiques à visée thérapeutique.Par ailleurs, peu de connaissances sont disponibles dans la littérature concernant le contrôle de la biogenèse mitochondriale dans le muscle lisse vasculaire et plus particulièrement dans l'hypertension artérielle. Ainsi, la deuxième partie de ce travail a été de caractériser la biogenèse mitochondriale dans un contexte d'hypertension. A travers l'utilisation d'un modèle expérimental d'hypertension et après confirmation dans des cellules musculaires lisses en culture, nous avons montré une induction importante de la biogenèse mitochondriale dans l'hypertension par un mécanisme stress oxydant-dépendant. De plus, cette induction est corrélée à une forte activation de la CaMKII, totalement bloquée par la présence d'un anti-oxydant : le resvératrol. Ces résultats suggèrent donc un contrôle de la biogenèse mitochondriale dépendante de la balance pro/anti-oxydante via l'activation de la CaMKII dans le muscle lisse vasculaire.

La mitochondrie, organite présent chez toutes les cellules eucaryotes aérobies, est délimitée par deux membranes qui compartimentent des fonctions physiologiques essentielles. La membrane interne est une barrière que les métabolites ne peuvent franchir que grâce à des protéines spécifiques, dont le transporteur mitochondrial d'ADP/ATP. Un premier volet de cette thèse s'attache à la purification du transporteur bovin en complexe avec l'acide bongkrékique. Il s'inscrit dans le cadre des approches précédemment engagées au laboratoire, qui visent à résoudre la structure tridimensionnelle du transporteur bloqué dans différentes conformations impliquées lors de l'échange des nucléotides. Les résultats obtenus indiquent que ce complexe se dissocie lors de sa purification : il nous faut donc envisager d'autres stratégies pour le stabiliser avant d'en tenter la cristallisation. Les deux autres volets concernent deux protéines mitochondriales susceptibles d'interactions fonctionnelles avec le transporteur de la levure Saccharomyces cerevisiae. Ainsi, une protéine membranaire nommée yOm14, située dans la membrane externe des mitochondries, a été caractérisée et son interaction physique avec le transporteur clairement démontrée. La seconde protéine est la porine de levure yVDAC1, qu'une abondante littérature décrit comme étant un partenaire du transporteur. Elle a été purifiée en mettant en œuvre des méthodologies complémentaires, détaillées dans ce mémoire. Des essais de cristallisation vont désormais pouvoir être entrepris dans le but de résoudre sa structure tridimensionnelle et de pouvoir rechercher ainsi les bases moléculaires de son interaction avec le transporteur d'ADP/ATP.

La consommation chronique et modérée d'éthanol (CCME) est associée à une réduction de la<br />mortalité cardiaque et à une élévation des acides gras oméga 3 (ω3) dans le sang et les<br />cellules. Les ω3 d'origine alimentaire sont connus pour réduire la mortalité cardiaque chez<br />l'homme, induire une cardioprotection chez l'animal et s'incorporer dans les membranes<br />notamment de la mitochondrie, siège important de la cardioprotection. Comme l'éthanol et les<br />ω3 semblent induire des effets cardioprotecteurs similaires, nous avons déterminé si une<br />CCME pouvait mimer le remodelage lipidique mitochondrial induit par une supplémentation<br />en ω3. Ces modifications structurales pourraient modifier la fonction mitochondriale et<br />expliquer la cardioprotection par l'éthanol. A partir d'un modèle de coeur isolé perfusé de rat,<br />nous avons montré que l'éthanol et les ω3 protègent de manière similaire le myocarde en<br />limitant la taille de l'infarctus après une ischémie/reperfusion. Après avoir vérifié qu'une<br />supplémentation en ω3 induit un enrichissement en ω3 des membranes mitochondriales<br />cardiaques, nous avons démontré qu'une CCME induit une augmention des ω3 dans la<br />cardiolipine et la phosphatidylcholine mitochondriales mais sans conséquence sur la fonction<br />mitochondriale. Dans le plasma et les membranes cellulaires, une CCME augmente les<br />teneurs en ω3 et réduit la concentration en palmitate, un acide gras pro-apoptotique. En<br />conclusion, une CCME protège le myocarde contre la nécrose cellulaire, augmente la teneur<br />en acides gras cardioprotecteurs (ω3) et diminue la concentration en acide gras proapoptotique<br />(palmitate). La cardioprotection induite par une CCME pourrait donc résulter<br />d'une interaction entre l'éthanol, la voie des ω3 et celle de l'apoptose.