Předkládaná diplomová práce se zabývá stavbou živých živočišných buněk a jejich odezvou na mechanické zatěžování. Zobecněným zaměřením práce je popis mechanického chování buňky nejenom ve fyziologickém, ale i v patologickém stavu. Výchozím předpokladem pro úspěšné řešení zadané úlohy je vysoce interdisciplinární přístup kombinující výpočtové přístupy mechaniky těles (v~tomto případě metodu konečných prvků) s lékařským výzkumem. Nejdůležitějším bodem při tvorbě výpočtového modelu, pomocí něhož je možné aproximovat chování živé buňky při zatížení, je zejména identifikace mechanicky významných komponent a~jejich materiálových parametrů. V tomto případě jsou jako mechanicky význačné identifikovány spojité součásti jádro, membrána a cytoplazma, které jsou nově propojeny s prvky diskrétními (mitochondriální sítí) v hybridním modelu, jehož platnost je ověřena pomocí experimentálních dat. Tento model slouží jako podklad k vyhodnocení míry vlivu mitochondrií na celkovou tuhost buňky.

L'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est associée à la survenue de lymphomes B chez des patients infectés et l’incidence de certains lymphomes reste élevée même chez les individus infectés dont la fonction immunitaire est reconstituée sous traitement antirétroviral combiné. La contribution du VIH-1 à l'oncogenèse des cellules B reste donc énigmatique. Le VIH-1 induit un stress oxydant et des dommages à l'ADN (DA) dans les cellules infectées via de multiples mécanismes. Cependant il n'infecte pas les lymphocytes B. En revanche, la protéine virale Tat qui circule dans le sang des individus infectés est capable de pénétrer spontanément dans des cellules non infectables par VIH. Nous avons détecté des niveaux élevés d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), principalement mitochondriales, et des DA dans les cellules B d'individus infectés par le VIH. Nous avons ainsi émis l'hypothèse que Tat pourrait induire des DA oxydants dans les cellules B et favoriser ainsi l'instabilité génétique et la transformation maligne de ces cellules.Dans des cellules B isolées à partir du sang périphérique de donneurs sains et incubées en présence de protéine Tat recombinante, un stress oxydant a été induit, la capacité antioxydante a diminué avec la diminution de taux du glutathion, le facteur de transcription NF-κB a été activé, et sont apparus des DA accompagnés d'aberrations chromosomiques. En outre, tous les effets induits par Tat dépendaient de son activité transcriptionnelle. Dans le but de mieux comprendre le(s) mécanisme(s) d’action de Tat chez les patients séropositifs, des extraits bruts de plantes endémiques du Liban ont été utilisés pour leur potentiel antioxydant. L’effet pro-oxydant de Tat a été contrecarré, le stress oxydant inhibé ainsi que les DA induits par la protéine virale. En conclusion, nous proposons que les dommages oxydants causés à l’ADN et les aberrations chromosomiques induites par Tat correspondent à de nouveaux facteurs oncogéniques favorisant le développement de lymphomes B chez les individus infectés par le VIH-1. / An infection with the Human immunodeficiency virus (HIV) is associated with Bcell lymphomas in infected patients. The incidence of some lymphomas remains elevated in HIVinfected individuals whose immune function has been reconstituted under combined antiretroviral therapy. Its contribution to B-cell oncogenesis cells remains enigmatic. HIV-1 is known to induce an oxidative stress and DNA damage (DD) in infected cells via multiple mechanisms. However, it does not infect B lymphocytes. This contrasts with the viral transactivator protein Tat which circulates in the blood of infected individuals and spontaneously penetrates even non infectable cells. We have detected high levels of reactive oxygen species (ROS), mainly from mitochondria, and DDs in Bcells of HIV-infected individuals. We have thus hypothesized that Tat could induce oxidative DD in B-cells thereby promoting genetic instability and malignant transformation in these cells.In B-cells isolated from peripheral blood of healthy donors and incubated in the presence of purified recombinant protein Tat, an oxidative stress has been induced, the antioxidant capacity was decreased due to diminished glutathione levels, the transcription factor NF-κB was activated, and DD and chromosomal aberrations induced. All the effects induced by Tat were shown to depend on its transcriptional activity. To better understand the mechanism(s) of action of this viral protein, crude extracts from endemic plants of Lebanon were tested for their antioxidant potential. The prooxidative effect of Tat was inhibited, as well as the DD and chromosoml aberrations induced by the viral protein. In conclusion, we propose that the oxidative DNA damage and chromosomal aberrations induced by the Tat protein correspond to novel oncogenic factors that favor the development of B-cell lymphomas in HIV-1 infected individuals.

Le complexe bc₁ de la chaîne respiratoire mitochondriale est une bonne cible thérapeutique pour traiter le paludisme car cette enzyme est essentielle au parasite. Ses deux sites actifs, Qo et Qi, formés par le cytochrome b, ne sont pas totalement conservés entre les espèces, facilitant la découverte d’inhibiteurs à affinité différentielle, ce qui est important dans le développement de médicaments. L’atovaquone est le seul antipaludique ciblant le complexe bc₁ utilisé en médecine. L’émergence de résistance rend urgente l’étude de nouveaux inhibiteurs. Les ELQs (Endochin-like Quinolones) sont une classe d’antipaludiques particulièrement prometteuse.Pour étudier la liaison des inhibiteurs dans les sites actifs et l’effet de mutations de résistance, nous utilisons la levure et des méthodes biochimiques et bio-informatiques. Dans ce travail, nous avons étudié la relation entre mutations de résistance à l’atovaquone dans le site Qo et perte de fonction. Nous avons aussi modifié le site Qo de la levure pour qu’il mime mieux le site de l’enzyme du parasite. Les résidus «Plasmodium» altèrent le fonctionnement du site, résultant en une surproduction d’ions superoxides et une perte de croissance respiratoire, qui est restaurée par la modification d’une autre sous-unité du complexe, ISP, partenaire du site Qo, suggérant que les deux sous-unités doivent s’ajuster pour un fonctionnement correct. Nous avons analysé des polymorphismes de la région Qo observés chez l’Homme et trouvé qu’ils peuvent modifier la sensibilité du complexe à l’atovaquone, ce qui pourrait avoir un impact sur les effets secondaires du traitement. Nous avons ensuite étudié le mode d’action d’ELQ-400 et montré que ce nouvel antipaludique cible les deux sites Qo et Qi, ce qui rend l’apparition de résistance peu probable. Enfin, nous avons commencé la reconstruction du site Qi de la levure pour mimer le site du parasite.Les mutants de levure avec un complexe bc₁ «Plasmodium» semblent être de bons outils pour l’étude des inhibiteurs. Leur étude a aussi permis de comprendre mieux la structure et le fonctionnement du complexe bc₁. / The bc₁ complex of the mitochondrial respiratory chain is a good therapeutic target for the treatment of malaria as the enzyme is essential for pathogen proliferation. The two catalytic sites, Qo and Qi, formed by cytochrome b, are not fully conserved between species, facilitating the development of inhibitors with differential saffinity, which is important for the development of new drugs. At present, Atovaquone is the only antimalarial drug targeting the bc₁ complex used in medicine. The emergence of resistance makes it important to find new inhibitors, and the ELQs (Endochin-like Quinolones) are promising antimalarial candidates.In order to study the inhibitor binding to the active sites and the effect of resistance mutations, we have used yeast and a combination of biochemical and bioinformatic methods. We have studied the relationship between atovaquone resistance mutations in the Qo site and loss of function. We have also modified the yeast Qo site to make it more like the parasite site. The “Plasmodium” residues in the yeast Qo site altered its activity, which resulted in the overproduction of superoxide and the loss of respiratory growth. This could be restored by the modification of another bc₁ complex subunit interacting with the Qo site, ISP, suggesting that both these subunits need to be readjusted for correct activity. We then analyzed polymorphisms of the Qo region reported in Humans and found that they could alter the enzyme sensitivity to atovaquone, which could impact the side-effects linked to atovaquone treatment. We have also studied the mode of action of ELQ-400 and showed that this new antimalarial drug targets both the Qo and Qi sites, which would make the emergence of resistance less likely. Finally, we have started the reconstruction of yeast Qi site to make it resemble the parasite site.The yeast mutants with a “Plasmodium-like” bc₁ complex could be useful tools for the study of antimalarial drugs. These analyses have also resulted in a better understanding of the structure and function of the bc₁ complex.

Les pathologies cardiovasculaires sont responsables d’un grand nombre de décès dans le monde aujourd’hui, dont plus de la moitié trouve son origine dans des anomalies rythmiques. Les phénomènes de dépolarisation et de repolarisation rythmiques des cardiomyocytes, à l’origine de l’activité contractile rythmique du myocarde, mettent en jeu des processus cellulaires consommateurs d’énergie et les mitochondries,. Dans cette thèse, la régulation de la fonction mitochondriale a été étudiée lors de l’induction d’arythmies ventriculaires sur coeurs isolés perfusés de rats. Les résultats montrent que l'évolution de la consommation d’oxygène du myocarde est un paramètre important dans la réponse aux arythmies. L’inhibition des myosines ATPases par la blebbistatine induit sur la durée une diminution de la susceptibilité vis-à-vis des arythmies. Les acteurs impliqués dans les différents types de réponses mitochondriales ont été caractérisés sur fibres perméabilisées. Nous montrons que la régulation de la fonction mitochondriale varie en fonction de la chambre cardiaque considérée. Les mesures de Km de la respiration mitochondriale, ainsi que l’étude des principaux mécanismes de transfert énergétiques, mettent en évidence des différences marquées entre les différentes chambres cardiaques. .Les résultats de nos travaux suggèrent que le remodelage myocardique observé en réponse aux modifications de charge, et/ou lors du développement des pathologies du myocarde sont susceptibles de favoriser la constitution d’un substrat arythmogène, propre à chaque chambre, et impliquant des perturbations des mécanismes de transfert énergétique. / Cardiovascular disease is the first cause of mortality in the whole world. Half of this mortality is due to heart failure, a progressive deterioration of cardiac contraction, which can be caused by electrical dyssynchrony. Implication of heart energetics on susceptibility to arrhythmia is therefore of particular interest to better understood the overall effect as well as the relative importance of the potential partners on developed pathologies. In this thesis, energetic regulation of mitochondria was studied in perfused hearts paced to induce arrhythmia. Myocardial oxygen consumption was shown as a crucial parameter in the response to rhythm troubles. Inhibitions of ATPase myofibrils by blebbistatin or AK-phosphotransfer by Ap5a did not produce same responses of mitochondrial compartment. When inhibited by Blebb, most of hearts presented less ectopic beats highlighting an anti-arrhythmic profile in this case of myofibrils inhibition. Energetic parameters involved in mitochondrial responses were characterized in skinned fibres. Mitochondria regulation was different between ventricle and atria, with a less sensitivity of mitochondria in atria compared to ventricle. Mechanisms of energy transfer between supply and demand were different between ventricle and atria. The role of AK-phosphotransfer was described as a determining parameter for atria energy maintenance, whereas ventricle presented a functional efficacy of CK pathway to regulate adenine nucleotide turnover. As suggested by these results, the role of adenylic nucleotides channeling could be considered as a mechanism used to counteract altered cardiac energetics that potentially sustained electrical pathologies.

Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant hereditary neurodegenerative disease characterized by motor, cognitive and behavioral disorders. HD is caused by expansion of CAG triplet (cytosine-adenosine-guanine) located in a gene on the short arm of the fourth chromosome. This expansion encodes an aberrant polyglutamine chain in the protein huntingtin. Physiological and mutated huntingtin (in case of HD) are expressed in almost all tissues and influences many cellular functions. The prevalence of HD in population is about 1 per 10.000. The disease is currently incurable and its mechanisms are not sufficiently understood. Besides affecting the central nervous system HD also affects peripheral tissues, including skeletal muscles. HD disrupts mitochondrial function and damages oxidative phosphorylation system, which has the task of producing energy in the form of ATP in cells. Research of transgenic minipig model for HD could help elucidate the mechanisms of disease's pathogenesis and potential therapeutic strategy. In this diploma thesis, immunodetection with help of specific antibodies to detect changes in amount of 14 selected mitochondrial proteins in skeletal muscle tissue of three age groups of transgenic HD minipigs - 24, 36 and 48 months old was used. Gradual progression in reduced...

Unicellular organisms such as yeast have been traditionally studied in shaken cultures, i.e., under condition in which they do not grow attached to solid surfaces as under natural conditions. In nature, cells only rarely live alone, but, on the other hand often create multicellular colonies or biofilms. During last years, yeasts started to be investigated also when grown on solid media. Our laboratory has previously developed special techniques for investigation of yeast colonies. These techniques allowed us to describe individual cell subpopulations within the colonies. The aim of this work was to prepare a series of mutant strains, describe morphology and ultrastructure of their colonies with the aim to contribute to understanding ofthe role of mitochondrial retrograde signalling pathway in the development of yeast colonies. This work describes expression of few selected genes (CIT2, RTG1, RTG2, and RTG3) in colonies of the parental strain BY4742 and of other mutant strains with deletion of one or more genes of RTG regulatory pathways. The results of the diploma thesis together with results of other authors became part of the publication (Podholová et al., 2016). Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Inborn errors of metabolism represent a heterogenous group of rare conditions, most having an incidence of less than 1 in 100,000 births. Because of their low prevalence, they are on the margin of attention of general research and even more so of large pharmaceutical companies. Study of rare diseases is the only way to design therapeutic options in order to improve quality of life of affected patients. Present Thesis particularly focuses on disturbances in mitochondrial energy metabolism. The main goals were the characterization of mitochondrial biogenesis within foetal development, as well as in childhood and adulthood. Another aim was to define clinical, biochemical and molecular aspects of mitochondrial optic neuropathies in childhood and adulthood. This work supported the earlier observations that gestational week 22 is the edge of viability, which has to be taken into account in upcoming discussions about guidelines on resuscitation of preterm neonates. Secondly, over last four years, we managed to examine and describe large cohort of patients with optic neuropathies based on a mitochondrial dysfunction. We have managed to characterize the biochemical and molecular-genetic background in more than 200 patients, and both selected cases (LHON/MELAS overlap syndrome) and cohort studies (MELAS,...

Acute cold exposure increases the risk of sudden cardiac events, similarly exposure to constant light negatively affects the cardiovascular system. However, the individual effects of these factors and the effect of their combination on cardiomyocytes are not yet known. The thesis deals with the influence of a 3 day cold exposure and constant light on the expression of β-adrenergic receptors and associated G-proteins in association with apoptotic signals in the left ventricle of the Wistar rat heart. In this work apoptotic proteins BAX, BCL2, caspase 8 and important components of β-adrenergic signalization - β1, β2, G-proteins, Gas, Gi1/2 and Gi3 were determined. The relative expression of the proteins was analyzed by Western blotting. The results confirm the detrimental effect of cold and light exposure. However, the synergistic effect of these two stressors shows surprising results.

Breast cancer is a common malignant disease affecting millions of women worldwide. Amplification of HER2 oncogene, a tyrosine kinase receptor, in breast cancer allows application of targeted therapy, but approximately one third of patients develop resistance to treatment. Relocalization of HER2 from the plasma membrane into the mitochondria was found and suggested as one of the potential causes of such resistance. Here we document that the function of mitochondrial HER2 is distinct from that of HER2 in the plasma membrane. Mitochondrial HER2 enhances cancer cell energetic metabolism, proliferation and migration in vitro, and tumour formation in vivo in mice correlating with elevated level of ROS signalling. The kinase activity of mitochondrial HER2 is unaffected, therefore I investigated its role in mitochondrial HER2 function. Moderate, endogenous levels of the kinase activity of mitochondrial HER2 drive pro-tumorigenic properties of breast cancer cells, while constitutive kinase activity sensitizes these cells to cell death and attenuates tumour formation in animal models. On the other hand, impairment of kinase activity due to mutation in the ATP binding site of mitochondrial HER2 supports adherence-independent growth in vitro and tumor growth in vivo. We propose that HER2 function in...

Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à de nombreuses maladies neurodégénératives. En effet, plusieurs protéines impliquées dans ces maladies, telles que les protéines PINK1 et Parkin dans la maladie de Parkinson, interviennent dans le recrutement de protéines nécessaires à l’homéostasie mitochondriale. En absence de ces protéines, un nouveau mécanisme se met en place : la formation de vésicules dérivées des mitochondries (MDVs). Notre équipe a démontré que ce mécanisme est responsable de la présentation antigénique mitochondriale (MitAP) et que les protéines PINK1 et Parkin ont un rôle répresseur sur cette voie et que cette nouvelle voie de présentation était capable d’activer des lymphocytes T CD8+ in vivo. Ces découvertes font entrer le système immunitaire comme nouvel acteur des maladies neurodégénératives. Cependant, les protéines impliquées dans MitAP restent à être identifiées. Deux projets ont été initiés afin de pouvoir mieux caractériser MitAP. La première a consisté à mettre au point un protocole d’isolation mitochondrial afin d’identifier de nouveaux partenaires moléculaires à la formation des MDVs au niveau des mitochondries. Le deuxième projet initie l’étude de l’immunopeptidome de cellules présentatrices d’antigène afin d’identifier les peptides mitochondriaux présentés à la surface des cellules. L’identification de protéines par l’isolation des mitochondries et celles générant les peptides mitochondriaux présentés à la surface des cellules sont essentielles pour comprendre le mécanisme des MDVs et le fonctionnement de la MitAP impliquée dans la maladie de Parkinson. Les protéines partenaires de cette voie moléculaire pourraient avoir un rôle dans les maladies neurodégénératives et être des cibles thérapeutiques ou des biomarqueurs. / Mitochondrial dysfunction is associated with many neurodegenerative diseases. Indeed, several proteins involved in these diseases, such as PINK1 and Parkin proteins in Parkinson's disease, are involved in the protein recruitment required for mitochondrial homoeostasis. In the absence of these proteins, a new mechanism is set up: the formation of vesicles derived from mitochondria (MDVs). Our team has demonstrated that this mechanism is responsible for the mitochondrial antigen presentation (MitAP) and that the PINK1 and Parkin proteins play a repressor role on this pathway and that this new presentation pathway is capable of activating CD8 + T cells in vivo. These discoveries bring the immune system as a new player in neurodegenerative diseases. However, the proteins involved in MitAP remain to be identified. Two projects have been initiated to better characterize MitAP. The first was to develop a mitochondrial isolation protocol to identify new molecular partners for MDV formation at the mitochondrial level. The second project initiates the study of the immunopeptidoma of antigen presenting cells to identify the mitochondrial peptides presented on the cell surface. The identification of these proteins is essential to understand the mechanism of MDVs and the functioning of MitAP involved in Parkinson's disease. The protein partners of this molecular pathway may have a role in neurodegenerative diseases and may be therapeutic targets or biomarkers.