Comparativement au génome contenu dans le noyau de la cellule de plante, nos connaissances des génomes des deux organelles de cette cellule, soit le plastide et la mitochondrie, sont encore très limitées. En effet, un nombre très restreint de facteurs impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN de ces compartiments ont été identifiés à ce jour. Au cours de notre étude, nous avons démontré l’implication de la famille de protéines Whirly dans le maintien de la stabilité des génomes des organelles. Des plantes mutantes pour des gènes Whirly chez Arabidopsis thaliana et Zea mays montrent en effet une augmentation du nombre de molécules d’ADN réarrangées dans les plastides. Ces nouvelles molécules sont le résultat d’une forme de recombinaison illégitime nommée microhomology-mediated break-induced replication qui, en temps normal, se produit rarement dans le plastide. Chez un mutant d’Arabidopsis ne possédant plus de protéines Whirly dans les plastides, ces molécules d’ADN peuvent même être amplifiées jusqu’à cinquante fois par rapport au niveau de l’ADN sauvage et causer un phénotype de variégation. L’étude des mutants des gènes Whirly a mené à la mise au point d’un test de sensibilité à un antibiotique, la ciprofloxacine, qui cause des bris double brin spécifiquement au niveau de l’ADN des organelles. Le mutant d’Arabidopsis ne contenant plus de protéines Whirly dans les plastides est plus sensible à ce stress que la plante sauvage. L’agent chimique induit en effet une augmentation du nombre de réarrangements dans le génome du plastide. Bien qu’un autre mutant ne possédant plus de protéines Whirly dans les mitochondries ne soit pas plus sensible à la ciprofloxacine, on retrouve néanmoins plus de réarrangements dans son ADN mitochondrial que dans celui de la plante sauvage. Ces résultats suggèrent donc une implication pour les protéines Whirly dans la réparation des bris double brin de l’ADN des organelles de plantes. Notre étude de la stabilité des génomes des organelles a ensuite conduit à la famille des protéines homologues des polymérases de l’ADN de type I bactérienne. Plusieurs groupes ont en effet suggéré que ces enzymes étaient responsables de la synthèse de l’ADN dans les plastides et les mitochondries. Nous avons apporté la preuve génétique de ce lien grâce à des mutants des deux gènes PolI d’Arabidopsis, qui encodent des protéines hautement similaires. La mutation simultanée des deux gènes est létale et les simples mutants possèdent moins d’ADN dans les organelles des plantes en bas âge, confirmant leur implication dans la réplication de l’ADN. De plus, les mutants du gène PolIB, mais non ceux de PolIA, sont hypersensibles à la ciprofloxacine, suggérant une fonction dans la réparation des bris de l’ADN. En accord avec ce résultat, la mutation combinée du gène PolIB et des gènes des protéines Whirly du plastide produit des plantes avec un phénotype très sévère. En définitive, l’identification de deux nouveaux facteurs impliqués dans le métabolisme de l’ADN des organelles nous permet de proposer un modèle simple pour le maintien de ces deux génomes. / Compared to the nuclear genome, very little is known about the genomes of the two plant cytoplasmic organelles, the plastid and the mitochondria. Indeed, very few factors involved in either the replication or the repair of these genomes have been identified. Here we show the implication of the Whirly protein family in the maintenance of organellar DNA. Indeed, mutations in Whirly genes lead to DNA rearrangements in both Arabidopsis thaliana and Zea mays plastids. These rearrangements are the product of microhomology-mediated break-induced replication that rarely occurs in wild-type plants but increases in absence of Whirly proteins. In a mutant plant devoid of plastidial Whirly proteins, these new DNA molecules can be amplified up to fifty times the normal DNA level and cause a variegated phenotype. In the course of the study of the Whirly mutant plants, we developed a strategy, based on the use of the antibiotic ciprofloxacin, to induce DNA double-strand breaks specifically in plant organelles. The Arabidopsis mutant plants without Whirly proteins in the plastids are more sensitive to the antibiotic ciprofloxacin than wild-type plants. Accordingly, there is a much larger increase in the number of rearranged DNA molecules in the plastids of the mutant plants than in the control plants. Surprisingly, while the mutant plants devoid of Whirly proteins in the mitochondria do not show increased sensitivity to the drug, they do accumulate more rearrangements in their mitochondrial DNA compared to wild-type plants. These results suggest that the Whirly proteins are involved in the repair of DNA double-strand breaks in the plant organelle genomes. Our study of the plant organelle genome stability has lead us to a family of proteins homologous to the DNA polymerase I in bacteria. This family has been proposed to be responsible for most of the DNA-synthesis activity in the plant organelles. We bring genetic proof to support this hypothesis using mutants of the two PolI genes of Arabidopsis. The combined mutation of both genes is lethal and the single mutations cause a decrease in the relative DNA levels in the organelles, thus confirming the involvement of both genes in DNA replication. Interestingly, mutants of the PolIB but not PolIA gene shows increase sensitivity to ciprofloxacin suggesting a function in DNA repair. In line with these results, a cross between a PolIB mutant and the mutant of plastid Whirly genes resulted in plants with severe growth defects and numerous rearrangements in the plastid DNA. In conclusion, we have identified two factors involved in the metabolism of organelle DNA and proposed a simple model of how these genomes are maintained in the plant cell.

Diplonema papillatum est un organisme unicellulaire qui vit dans l’océan. Son génome mitochondrial possède une caractéristique spéciale: tous les gènes sont brisés en de multiples fragments qui s’appellent modules. Chaque module est codé par un chromosome différent. L’expression d’un gène exige des épissages-en-trans qui assemblent un ARN messager complet à partir de tous les modules du gène. Nous avons précédemment montré que le gène cox1 est encodé dans neuf modules avec six Us non encodés entre le module 4 et le module 5 de l’ARN messager mature [1]. Nous n’avons identifié aucune séquence consensus connue de site d’épissage près des modules. Nous spéculons qu’un ARN guide (gRNA) a dirigé l’épissage-en-trans du gène cox1 par un mécanisme qui est semblable à l’édition d’ARN par l’insertion/la suppression des Us chez les kinétoplastides, le groupe sœur des diplonémides. Nous avons trouvé que les six Us sont ajoutés au bout 3’ de l’ARN d’une façon semblable à ceux ajoutés par le TUTase lors de l’édition de l’insertion des Us chez les kinétoplastides. Nous avons construit des profils de gRNA de l’épissage-en-trans avec les expressions régulières basé sur notre connaissance des gRNAs dans l’édition d’ARN chez les kinétoplastides. Selon la complémentarité partielle entre le gRNA et les deux modules adjacents, nous avons généré des amorces pour RT-PCR visant à détecter des séquences qui sont assorties à un des profils de gRNA. Une expérience pilote in vitro n’a pas permis de reconstituer l’épissage-en-trans des modules 3, 4, et 5, suggérant que nous devons améliorer nos techniques. / Diplonema papillatum is a single cellular organism that lives in the ocean. Its mitochondrial genome possesses a special feature: all genes are fragmented in multiple pieces that are called modules and each module is encoded by a different chromosome. Expression of a gene requires trans-splicing that successfully assemble a full-length mRNA from all modules of the gene. It was previously shown that the cox1 gene is encoded in nine modules that are all located on different chromosomes; moreover, a stretch of six non-encoded Us exist between Module 4 and 5 in the mature mRNA [1]. No consensus sequence of known splicing sites was identified near the modules. We speculate that trans-splicing of the cox1 gene is directed by guide RNAs (gRNAs) via a mechanism that is similar to U-insertion/deletion editing in kinetoplastids, the sister group of diplonemids. We have detected populations of small RNA molecules that could come from mitochondrial. We found that the six Us were added to the 3’ end of Module 4 in a similar way to the Us added by the TUTase in kinetoplastid U-insertional editing. Sequence profiles of possible trans-splicing gRNAs were constructed in regular expressions based on our knowledge of known gRNAs in kinetoplastid RNA editing. According to the complementarity between the gRNA and the two adjacent modules, primers were designed for RT-PCR that aims to detect gRNA sequences. Among the results, we identified sequences that match or partially match the gRNA profiles. A pilot in vitro assay did not reconstitute trans-splicing of module 3, 4 and 5, suggesting that further technical improvements are needed.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Notre laboratoire a récemment découvert un mode d’expression des gènes mitochondriaux inédit chez le protozoaire biflagellé Diplonema papillatum. Outre son ADNmt formé de centaines de chromosomes circulaires, ses gènes sont fragmentés. Le gène cox1 qui code pour la sous unité I de la cytochrome oxydase est formé de neuf modules portés par autant de chromosomes. L’ARNm de cox1 est obtenu par épissage en trans et il est également édité par insertion de six uridines entre deux modules. Notre projet de recherche a porté sur une étude globale des processus post-transcriptionnels du génome mitochondrial de diplonémides. Nous avons caractérisé la fragmentation de cox1 chez trois autres espèces appartenant aux deux genres du groupe de diplonémides à savoir : Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 et Rhynchopus euleeides. Le gène cox1 est fragmenté en neuf modules chez tous ces diplonémides mais les modules sont portés par des chromosomes de taille et de séquences différentes d’une espèce à l’autre. L’étude des différentes espèces a aussi montrée que l’édition par insertion de six uridines entre deux modules de l’ARNm de cox1 est commune aux diplonémides. Ainsi, la fragmentation des gènes et l’édition des ARN sont des caractères communs aux diplonémides. Une analyse des transcrits mitochondriaux de D. papillatum a permis de découvrir quatre autres gènes mitochondriaux édités, dont un code pour un ARN ribosomique. Donc, l'édition ne se limite pas aux ARNm. De plus, nous avons montré qu’il n’y a pas de motifs d’introns de groupe I, de groupe II, de type ARNt ou d’introns impliqués dans le splicéosome et pouvant être à l’origine de l’épissage des modules de cox1. Aucune complémentarité significative de séquence n’existe entre les régions flanquantes de deux modules voisins, ni de résidus conservés au sein d’une espèce ou à travers les espèces. Nous avons donc conclu que l’épissage en trans de cox1 chez les diplonémides fait intervenir un nouveau mécanisme impliquant des facteurs trans plutôt que cis. L’épissage et l’édition de cox1 sont dirigés probablement par des ARN guides, mais il est également possible que les facteurs trans soient des molécules protéiques ou d’ADN. Nous avons élucidé les processus de maturation des transcrits mitochondriaux de D. papillatum. Tous les transcrits subissent trois étapes coordonnées et précises, notamment la maturation des deux extrémités, l’épissage, la polyadénylation du module 3’ et dans certains cas l’édition. La maturation des extrémités 5’ et 3’ se fait parallèlement à l’épissage et donne lieu à trois types d’intermédiaires. Ainsi, un transcrit primaire avec une extrémité libre peut se lier à son voisin. Cet épissage se fait apparemment sans prioriser un certain ordre temporel alors que dans le cas des transcrits édités, l’édition précède l`épissage. Ces études donnant une vue globale de la maturation des transcrits mitochondriaux ouvrent la voie à des analyses fonctionnelles sur l’épissage et l’édition chez D. papillatum. Elles sont le fondement pour finalement élucider les mécanismes moléculaires de ces deux processus post-transcriptionnels de régulation dans ce système intriguant. / Our laboratory has recently discovered an unprecedented mode of expression of mitochondrial genes in D. papillatum, a biflagellate protozoan. In addition to its mtDNA formed of hundreds of circular chromosomes, genes are fragmented. For example, the cox1 gene which encodes the subunit one of the cytochrome oxidase complex, comprises nine modules carried by nine chromosomes. The cox1 mRNA is obtained by trans-splicing and is also edited by the insertion of six uridines between two modules. My thesis project focused on the study of post-transcriptional processes in diplonemid mitochondria. We characterized the fragmentation of cox1 in three other species belonging to two diplonemids genera: Diplonema ambulator, Diplonema sp. 2 and Rhynchopus euleeides. The cox1 gene is fragmented into nine modules in all species but the modules are carried by chromosomes of different size and sequences from one species to another. We have shown that there are no motifs for classical introns, including spliceosomal and archaeal introns, as well as introns of group I and II, that might be implicated in the trans-splicing of cox1 modules. No significant complementarity exists between the flanking regions of two neighboring modules, nor are any conserved residues within a species or across species. We therefore concluded that the trans-splicing of cox1 in diplonemids involves a novel mechanism implicating trans rather than cis-factors. Trans-splicing and editing of cox1 probably involve guide RNAs, but it is also possible that the trans-factors are proteins or DNA molecules. The study of different species has also shown that the insertion of six uridines between two cox1 modules in mRNA is a shared trait in these diplonemids. We discovered that four other mitochondrial genes are also edited in D. papillatum and that RNA editing is not limited to mRNA. So, fragmented genes and RNA editing are common characteristics of diplonemids. We elucidated D. papillatum’s mitochondrial transcript maturation steps. All transcripts undergo three coordinated and precise processes including end processing, trans-splicing and / or editing and polyadenylation. The processing of the 5 'and 3' ends gives rise to three kinds of maturation intermediates. A primary transcript with one free end can bind to its neighbor and trans-splicing occurs without directionality. In the case of edited transcripts, editing precedes trans-splicing. These studies have prepared the ground for functional studies of trans-splicing and RNA editing with the long term goal to elucidate the molecular mechanisms involved in post-transcriptional regulation in this intriguing system.

Mitochondria are cell organelles which play an essential role in the cell energy supply providing the universal high energetic molecule ATP which is used in numerous energy consuming processes. The core of the ATP production, oxidative phosphorylation (OXPHOS) consists of four enzyme complexes (respiratory chain) which establish, driven by redox reactions, a proton gradient over the inner mitochondrial membrane. The ATP-synthase uses this electrochemical gradient to phosphorylate ADP to ATP. Dysfunctioning of an OXPHOS complex can have severe consequences for the energy metabolism and cause rare but incurable dysfunctions in particular tissues with a high energy demand such as brain, heart, kidney and skeleton muscle. Moreover mitochondria are linked to widespread diseases like diabetes, cancer, Alzheimer and Parkinson. Further, reactive oxygen species which are a by-product of the respiratory chain, are supposed to play a crucial role in aging. The aim of this work is to provide a realistic model of OXPHOS which shall help understanding and predicting the interactions within the OXPHOS and how a local defect (enzyme deficiency or modification) is expressed globally in mitochondrial oxygen consumption and ATP synthesis. Therefore we chose a bottom-up approach. In a first step different types of rate equations were analyzed regarding their ability to describe the steady state kinetics of the isolated respiratory chain complexes in the absence of the proton gradient. Here Michaelis-Menten like rate equations were revealed to be appropriate for describing their behavior over a wide range of substrate and product concentrations. For the validation of the equations and the parameter estimation we have performed kinetic measurements on bovine heart submitochondrial particles. The next step consisted in the incorporation of the proton gradient into the rate equations, distributing its influence among the kinetic parameters such that reasonable rates were obtained in the range of physiological electrochemical potential differences. In the third step, these new individual kinetic rate expressions for the OXPHOS complexes were integrated in a global model of oxidative phosphorylation. The new model could fit interrelated data of oxygen consumption, the transmembrane potential and the redox state of electron carriers. Furthermore, flux inhibitor titration curves can be well reproduced, which validates its global responses to local effects. This model may be of great help to understand the increasingly recognized role of mitochondria in many cell processes and diseases as illustrated by some simulations proposed in this work. / Les mitochondries sont l’usine à énergie de la cellule. Elles synthétisent l’ATP à partir d’une succession de réactions d’oxydo-réduction catalysées par quatre complexes respiratoires qui forment la chaîne respiratoire. Avec la machinerie de synthèse d’ATP l’ensemble constitue les oxydations phosphorylantes (OXPHOS). Le but de ce travail est de bâtir un modèle des OXPHOS basé sur des équations de vitesse simples mais thermodynamiquement correctes, représentant l’activité des complexes de la chaîne respiratoire (équations de type Michaelis- Menten). Les paramètres cinétiques de ces équations sont identifiés en utilisant les cinétiques expérimentales de ces complexes respiratoires réalisées en absence de gradient de proton. La phase la plus délicate de ce travail a résidé dans l’introduction du gradient de protons dans ces équations. Nous avons trouvé que la meilleure manière était de distribuer l’effet du gradient de proton sous forme d’une loi exponentielle sur l’ensemble des paramètres, Vmax et Km pour les substrats et les produits. De cette manière, j’ai montré qu’il était possible de représenter les variations d’oxygène, de ΔΨ et de ΔpH trouvés dans la littérature. De plus, contrairement aux autres modèles, il fut possible de simuler les courbes de seuil observées expérimentalement lors de la titration du flux de respiration par l’inhibiteur d’un complexe respiratoire donné.Ce modèle pourra présenter un très grand intérêt pour comprendre le rôle de mieux en mieux reconnu des mitochondries dans de nombreux processus cellulaires, tels que la production d’espèces réactives de l’oxygène, le vieillissement, le diabète, le cancer, les pathologies mitochondriales etc. comme l’illustrent un certain nombre de prédictions présentées dans ce travail.

Adaptation to chronic hypoxia provides cardioprotective effects. Molecular mechanism of this phenomenon is not yet completely understood, but it is known that cardiac mitochondria play an essential role in induction of protective effects. The purpose of this diploma thesis is to study effects of continuous normobaric hypoxia (CNH; 10 % O2, 21 days) on spontaneously hypertensive rats (SHR) and conplastic strain that is derived from SHR. These animals have nuclear genome of SHR strain and mitochondrial genome of Brown Norway (BN) strain. Cardiac homogenate was used to measure enzymatic activity of malate dehydrogenase (MDH), citrate synthase (CS), NADH-cytochrome c oxidoreductase, succinate-cytochrome c oxidoreductase and cytochrome oxidase (COX). Using Western blot procedure the protein amount of antioxidant enzymes was measured - manganese superoxide dismutase and copper-zinc superoxide dismutase (MnSOD, Cu/ZnSOD), catalase and chosen subunits of oxidative phosphorylation complexes (Ndufa9, Sdha, Uqcrc2, COX-4, MTCO1, Atp5a1). Under normoxic conditions the conplastic strain has lower amount of complex IV subunit MTCO1 in comparison with SHR. This subunit is encoded by mitochondrial DNA and it is one of the seven protein-coding genes in conplastic strain that differ from SHR. Adaptation to hypoxia causes an...

L’impératif d’une aquaculture durable conduit à orienter l’alimentation des poissons vers la substitution de la farine de poisson par des produits végétaux renouvelables. Toutefois, ce remplacement est souvent limité par des niveaux trop faibles en méthionine dans les matières premières végétales. Ainsi la supplémentation en méthionine de ces nouveaux régimes à base de végétaux est essentielle, mais requière une bonne connaissance de son rôle pour adapter les apports aux conditions physiologiques des poissons tout en prenant en compte les contraintes économiques et environnementales de production. Dans ce contexte, cette thèse avait pour principal objectif de caractériser les effets induits par une carence en méthionine sur le métabolisme mitochondrial de la truite arc en ciel. Les résultats obtenus dans notre première étude montrent que l'alimentation de truites avec un régime déficient en méthionine entraîne une baisse des performances de croissance associée à une baisse de l’intégrité mitochondriale et une diminution du statut oxydatif dans le foie. Nous démontrons également que ces perturbations s’accompagnent de l’induction d’un processus de dégradation des mitochondries par autophagie (appelé mitophagie) ainsi que d’une augmentation du stress du Réticulum Endoplasmique (RE) et de l’apoptose. Ces données originales publiées dans le journal Scientific Reports mettent ainsi en évidence les liens étroits qui existent entre différentes fonctions cellulaires pour faire face à un déséquilibre nutritionnel en méthionine. Outre cet effet à court terme, nous démontrons également, dans un seconde étude, qu’une carence en méthionine alimentaire pendant une courte période (2 semaines) lors des premiers repas des alevins entraîne une induction à long terme de facteurs liés à la mitophagie. Ces résultats, soumis à publication dans Journal of Experimental Biology, démontrent ainsi pour la première fois la mise en place d’un processus de programmation de cette fonction cellulaire par une carence précoce en méthionine. L’enrichissement en H3K4me3 et H3K36me3 des foies des poissons issus d’alevins carencés en méthionine par rapport aux poissons témoins suggère une implication de mécanismes épigénétiques dans ces effets. Enfin, dans une troisième étude qui se détache de la thématique principale de la thèse et qui a fait l’objet d’une publication dans le journal Frontiers in Physiology, nous nous sommes attachés à préciser les interactions existante entre l’autophagie, l’homéostasie du RE et le métabolisme intermédiaire. Dans l’ensemble, ces données approfondissent notre compréhension du rôle de la méthionine alimentaire au niveau cellulaire et soulignent le potentiel de cet acide aminé en tant que levier pour appliquer de nouvelles stratégies alimentaires, comme la programmation nutritionnelle, afin d’optimiser la nutrition et la santé des poissons d'élevage. / The expansion of the aquaculture industry in combination with limited availability and high prices of fishmeal has prompted feed producers to include more plant proteins in the aquaculture feeds. However, replacement of fish meal with plant proteins is often limited by the level of methionine in the alternative plant protein sources. Understanding of the different roles of methionine in fish is therefore essential to develop new diets and/or feeding strategies that are in tune with optimal fish growth, environmental and economic constraints. In this context, the main objective of this thesis was to characterize the effects induced by methionine deficiency on the hepatic mitochondrial metabolism in rainbow trout. The results obtained in our first study show that feeding trout with a methionine deficient diet leads to a decrease in growth performance associated with a decrease in both mitochondrial integrity and oxidative stress in the liver. We also demonstrate that these defects are accompanied by the induction of an autophagy-dependent mitochondrial degradation process (called mitophagy) as well as an increase in Endoplasmic Reticulum (ER)-stress and apoptosis. These original data published in Scientific Reports thus highlight the existence of close interactions between different cellular functions to cope to a dietary methionine deficiency. In addition to this short-term effect, we also demonstrate in a second study (submitted for publication in the Journal of Experimental Biology), that early nutritional stimulus during two weeks with a methionine deficient diet resulted in a long term programming of mitophagy. The enrichment of H3K4me3 and H3K36me3 in the liver of fish from methionine-deficient fry compared to their control counterparts suggests that epigenetic mechanisms are involved in these effects. Finally, in a third and last study, recently accepted for publication in Frontiers in Physiology, we sought to clarify, in primary culture of trout hepatocytes, the existing interactions between autophagy, ER homeostasis and intermediate metabolism under amino acid deprived conditions. Together, the results obtained in the present thesis extended our understanding of the role of dietary methionine at cellular level and emphasize the potential of this amino acid to apply new feeding strategies, such as nutritional programming, to optimize the nutrition and health of farmed fish.

Les maladies rares sont définies en Europe par une prévalence inférieure à 1/2 000 cas et représentent plus de 7000 entités différentes dont 80% sont d’origine génétique. La majorité est de début pédiatrique. J’ai réalisé l’étude de cas familiaux rares avec récurrence dans la fratrie de cardiopathies congénitales avec hétérotaxie (défaut de latéralité gauche/droite) d’une part, et de mort subite cardiaque inexpliquée chez le nourrisson ou en période néonatale d’autre part. La stratégie d’identification de gène par séquençage de l’exome au sein de ces familles dans l’hypothèse d’une transmission autosomique récessive a permis d’identifier trois gènes et d’en étudier deux sur le plan fonctionnel dans différents modèles : 1) Perte de fonction de MMP21 et malformations cardiaques congénitales par anomalie de latéralité embryonnaire. MMP21 code pour une métallopeptidase matricielle dont nous démontrons le rôle très spécifique au niveau du nœud embryonnaire sur un modèle poisson zèbre et souris. Ceci ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la mise en place de l’asymétrie gauche/droite chez la plupart des vertébrés. De manière intéressante, alors que tous les mammifères ont le cœur latéralisé à gauche, tous n’ont pas un gène MMP21 codant. Il existe donc plusieurs voies de signalisation de l’asymétrie gauche/droite chez les vertébrés. 2) Mutations hypomorphes de PPA2 et mort subite cardiaque chez le nourrisson. PPA2 code pour une pyrophosphatase mitochondriale et les données chez la levure ont montré que la fonction de cette enzyme était essentielle au fonctionnement mitochondrial. Nous décrivons une nouvelle présentation clinique de maladie mitochondriale responsable de décès par arrêt cardiaque inattendu chez le nourrisson. 3) Perte de fonction de PLCD3 et cardiomyopathie foudroyante par apoptose et nécrose diffuse des cardiomyocytes en période néonatale. Ce résultat nécessite encore d’être confirmé par l’identification d’autres cas mais la fonction de la protéine et des données chez la souris sont des arguments majeurs en faveur de la causalité du gène. Au total, ces travaux sont déterminants à la fois sur le plan clinique dans le cadre du conseil génétique pour les familles concernées et sur le plan fondamental en éclairant les mécanismes biologiques de mise en place de l’axe gauche-droit au cours du développement embryonnaire avec MMP21, sur le rôle essentiel de PPA2 dans la mitochondrie et sur celui de PLCD3 dans la survie des cardiomyocytes en postnatal. / Rare diseases are defined in Europe by a prevalence of less than 1/2,000 individuals and represent more than 7,000 different diseases of which 80% are genetic. Most have a paediatric onset. My project involved the study of rare cardiac disorders in familial cases with recurrence in siblings, focusing on congenital heart disease in the context of heterotaxia (laterality defects) and sudden unexpected death due to cardiac arrest in infancy and the neonatal period. Whole exome sequencing was used as a tool for disease gene discovery in these families with the hypothesis of autosomal recessive inheritance. This strategy led to the identification of 3 novel disease genes. I performed functional validation for two of these genes in different models, confirming their involvement in each disease. 1) Loss of function of MMP21 and cardiac malformations due to left-right patterning defects during embryonic development. MMP21 encodes a metallopeptidase for which I demonstrated a highly specialized role in the generation of left-right asymmetry at the node using zebrafish. This gives new insight into the molecular mechanisms at the origin of left-right asymmetry in vertebrates. Interestingly, all mammals have a left-sided heart, but some species have lost the Mmp21 gene, indicating that there are different pathways leading to left-right determination in vertebrates. 2) Hypomorphic mutations in PPA2 cause sudden cardiac arrest in infants. PPA2 is a nuclear gene encoding the mitochondrial pyrophosphatase and using a yeast model we showed that this enzyme is essential for the mitochondrial energy transducing system and biogenesis. I described a novel clinical spectrum for a mitochondrial disease responsible for unexpected cardiac arrest in infancy. 3) PLCD3 loss of function and fatal cardiomyopathy by cardiomyocyte apoptosis and necrosis in neonates. Exome sequencing in one familial case with 2 siblings presenting fatal cardiomyopathy led to the identification of compound heterozygous mutations in PLCD3, a gene previously implicated in a similar pathology in a mouse model. Identification of further cases with mutations in this gene will be needed in order to confirm the role of PLCD3 in the disease. In total, these studies are crucial from a clinical point of view for the genetic counseling of the affected families and they contribute to the elucidation of biological mechanisms of embryonic development and left-right determination (MMP21), mitochondrial function (PPA2) and post-natal cardiomyocyte survival (PLCD3).

Le postconditionnement cardiaque est paradoxal chez le rat. Certains auteurs ont montré que cet animal pouvait être protégé par le postconditionnement alors que d’autres ont montré qu’il était inefficace. L’objectif de notre travail était d’éclaircir cette situation et d’établir un lien entre la régulation des fonctions mitochondriales et la réussite ou l’échec du postconditionnement. Nous avons montré sur un modèle in vivo que le rat est sensible au postconditionnement cardiaque sous certaines conditions. Il semble que la réussite de cette thérapie nécessite à la fois une préservation de la phosphorylation oxydative, une inhibition de l’ouverture du mPTP et une diminution de la production de ROS. Nous avons également montré que le complexe I de la chaîne respiratoire régule l’ouverture du mPTP en liaison avec l’état de la Cyp D. L’ensemble de nos résultats montrent que le rat n’est pas réfractaire au postconditionnement, mais pour que celui-ci soit efficace, il est nécessaire de préserver l’intégrité des différentes fonctions mitochondriales. La cardioprotection et la régulation des fonctions mitochondriales sont donc spécifiquement liées au modèle utilisé / Cardiac postconditioning is paradoxical in rat. Certain authors showed that this animal could be protected by postconditioning whereas others showed that it was ineffective. The objective of our work was to clarify this situation and to establish a link between the regulation of the mitochondrial functions and the success or the failure of postconditioning. We showed on an in vivo model that the rat is sensitive to cardiac postconditioning under certain conditions. It seems that the success of this therapy requires at the same time a safeguarding of oxidative phosphorylation, an inhibition of the mitochondrial permeability transition pore opening and a reduction in the ROS production. We also showed that complex I of the respiratory chain controls the opening of the mPTP in relation with the state of Cyp D. Our results show that the rat is not insensitive to postconditioning, but it is necessary to preserve the integrity of the mitochondrial functions to be effective. The cardioprotection and the regulation of the mitochondrial functions are specifically related to the model used

L’I/R et la cardioprotection par PreC et PostC impactent la fonction mitochondriale et plus précisément le mPTP. Le mPTP est non seulement modulé par des protéines qui participent à sa formation comme la CypD mais aussi par l’environnement cellulaire. Le but de ma thèse a été d’étudier la régulation du mPTP par la CypD, le complexe I et le Ca2+ durant l’I/R et la cardioprotection. Nos conclusions sont : 1. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale régule l’ouverture du mPTP et cela de façon CypD-dépendante. 2. Le PostC est un inhibiteur du complexe I, l’Iso, est le seul PostC efficace chez le rat in vivo. 3. L’inhibition pharmacologique ou génétique de la CypD cardioprotège en modulant l’ouverture du mPTP et l’homéostasie calcique. 4. La CypD a un nouveau rôle dans la cardioprotection, indépendamment de son action sur le mPTP. En effet, elle module le transfert calcique au niveau des MAM et plus précisément le transfert de Ca2+ entre les RS et la mitochondrie. Son inhibition prévient la surcharge calcique mitochondriale intervenant lors de l’I/R. L’ensemble de ces résultats nous permet de conclure que le mPTP est régulé par de nombreux facteurs interconnectés. Le Ca2+ est l’effecteur principal de l’ouverture du mPTP. La CypD a une action Ca2+ dépendante et module l’homéostasie calcique au niveau des MAM. Le complexe I régule l’ouverture du mPTP de façon CypD dépendante. Enfin les fonctions mitochondriales cardioprotecteurs mPTP-dépendants englobe la CypD, le Ca2+, le complexe I et les fonctions mitochondriales. Cette vision plus large et intégrée de la régulation du mPTP pourra donner des pistes plus efficaces dans le développement de traitements pharmacologiques cardioprotecteurs / Reperfusion of the heart after an ischemic event leads to the opening of a nonspecific pore in the inner mitochondrial membrane, the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Inhibition of mPTP opening is an effective strategy to prevent cardiomyocyte death. For example, inhibition of mPTP opening via ischaemic preconditioning (PreC) and post-conditioning (PostC) decreased the myocardial infarct size after ischemia–reperfusion. Although the molecular composition of the mPTP remains unclear, the matrix protein cyclophilin-D (CypD) is the best defined regulatory component of mPTP. In this thesis, we demonstrated that Complex I of the respiratory mitochondrial chain also regulates mPTP in a CypD-dependent manner. We also proved that inhibition of Complex I by isoflurane prevents lethal reperfusion injury in an in vivo rat model of ischemia-reperfusion. Finally, we proved that cardioprotective inhibition of CypD modulates calcium homeostasis and fluxes between mitochondria and sarcoplasmic reticulum. In summary, our results suggest that mPTP is regulated by several interconnected factors like calcium, CypD, complex I and mitochondrial functions