Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-05Bitstream added on 2014-06-13T18:58:51Z : No. of bitstreams: 1 000735355.pdf: 1354100 bytes, checksum: e69296eb81e8a6cd0752363e21364dad (MD5) / O excessivo acúmulo lipídico que acontece ao longo da produção in vitro de embriões (PIVE) tem sido apontado como prejudicial à criopreservação. Como o soro fetal bovino (SFB) é um dos fatores que provoca maior impacto neste acúmulo, e pelo mesmo ser de composição indefinida, procura-se substituí-lo nos meios de cultivo. Entre os possíveis substitutos, está o composto semi-definido, livre de ácidos graxos, a albumina sérica bovina (BSA). O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da BSA e/ou SFB na MIV sobre o acúmulo lipídico nos oócitos e embriões bovinos, e para isso, cinco experimentos foram realizados. No primeiro experimento, demostrou-se que o meio contendo SFB possui dezoito vezes mais lipídeos que o meio contendo apenas BSA como fonte proteica. No segundo experimento, confirmou-se que, ao contrário da maturação in vivo, a maturação in vitro (MIV) provoca acúmulo lipídico, sendo este acúmulo mais acentuado no grupo suplementado exclusivamente com SFB, comparado ao grupo suplementado com BSA, sem observar-se diferença nos tamanhos das gotas oocitárias entre os grupos. Oócitos maturados na presença do SFB apresentaram melhores taxas de maturação nuclear e citoplasmática, porém, mostraram diferenças com relação à quantidade e migração de lipídeos e mitocôndrias em comparação àqueles obtidos após maturação in vivo. Nos experimentos III e IV, observou-se que, além de não levar a uma esperada diminuição da quantidade de lipídeos nos blastocistos produzidos, a BSA na MIV levou a menores taxas de desenvolvimento embrionário. Sobre o tamanho das gotas embrionárias, constatou-se que a MIV suplementada com SFB provoca maior porcentagem de gotas entre 2 a 6 μm de diâmetro comparada a MIV suplementada por ambas as substancias. Além do mais, percebeu-se um aumento do tamanho das gotas ao longo da PIVE independente da suplementação... / The excessive lipid accumulation that occurs during in vitro production of embryos (IVPE) has been described as harmful to cryopreservation. Because fetal bovine serum (FBS) is one of the factors that cause the greatest impact in this accumulation, and because it is an undefined medium supplement, current research is aimed at replacing this supplement in culture media. Among the possible substitutes, there is a semi defined compound, fatty acid free bovine serum albumin (BSA). The present study aimed to evaluate the influence of BSA and/or FBS during IVM on lipid accumulation in oocytes and embryos, and for that, five experiments were performed. The first experiment demonstrated that the medium containing FBS has eighteen times more lipids than the medium containing only BSA as a protein source. In the second experiment, it was confirmed that, unlike in vivo maturation, in vitro maturation (IVM) causes a lipid accumulation, which is more pronounced in the group supplemented only with FBS, compared with BSA group, without showing difference in oocytes droplets sizes between groups. Oocytes matured in the presence of FBS showed better rates of nuclear and cytoplasmic maturation, however, they also showed differences relative to the amount and migration of lipids and mitochondrias in comparison to those obtained after in vivo maturation. In the experiments III and IV, it was observed that the expected decrease in the amount of lipids produced in blastocysts, supplemented solely with BSA, did not take place, and the use of BSA alone in IVM led to lower rates of embryo development. Furthermore, for embryos lipid droplets sizes, a higher percentage of droplets between 2-6μm was observed in IVM supplemented with FBS compared to supplemented with both substances.The last experiment determined the expression of genes involved in lipid synthesis, DGAT2 and PLIN2. Increased expression of PLIN2 and ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T18:58:54Z : No. of bitstreams: 1 gottardi_fp_me_jabo.pdf: 551122 bytes, checksum: 296df34d2ff79346b4bafb7a4da03dc9 (MD5) / Facta / Butirolactona I (Bl-I) pode ser utilizada em sistemas PIV de embriões para bloquear a meiose durante o transporte de oócitos obtidos de OPU. O objetivo deste estudo foi verificar a concentração de BL-I eficaz durante o transporte de oócito bovinos. Oócitos (n=4581) foram pré-maturados em criotubos contendo meio com 10 ou 100μM de Bl-I, acrescido ou não de HEPES (20mM), no período de 5 horas em estufa portátil Minitub e transferidos para incubadora com atmosfera e temperatura controlada, permanecendo por mais 19 horas. Em seguida foram maturados a 38,5ºC em atmosfera de 5% de CO2 durante 20 horas, fecundados e os zigotos cultivados. Foram avaliadas a maturação nuclear e a maturação citoplasmática após pré-MIV e MIV (24h.-controles e 20h.-tratados). A fertilização foi avaliada após 18 h. da inseminação. Os embriões foram analisados quanto ao seu desenvolvimento e qualidade. Os dados foram avaliados por ANOVA (p<o,o5). A maioria dos oócitos tratados permaneceu em GV e após MIV houve a reversão do bloqueio, mas a eficiência foi menor com 10 μM de Bl-I. A maturação citoplasmática foi beneficiada de acordo a distribuição das mitocôndrias, no entanto, quanto à distribuição dos grânulos corticais apenas o bloqueio realizado com 100 μM Bl-I permitiu uma maturação. A taxa de fecundação foi prejudicada pelo tempo de transporte, mesmo nos oócitos tratados. A ocorrência de polispermia foi correlacionada à porcentagem de oócitos com grânulos corticais imaturos. O desenvolvimento embrionário sofreu um atraso pela utilização de 100μM de Bl-I, porém boa porcentagem de blastocistos de qualidade foi atingida. Assim, o bloqueio com 100μM de Bl-I possui efeitos benéficos na PIV de embriões de oócitos transportados por longo tempo. / Butirolactone-I (Bl-I), can be used in systems for in vitro production (IVP) of embryos to block meiosis during the transport of oocytes from OPU. The objective of this study is to assess the concentration of BL-I more efficient during the transport of bovine oocytes. Oocytes (n = 4581) were prematured in criotubes containing medium with 10 or 100 μM of Bl-I with or without HEPES (20mM) in a portable incubator at 38,5°C without CO2 equilibration in the first 5 h, being later transferred to a incubator at 38.5°C and 5% CO2 in humidified air during the 19 hours remaining. Following were matured, fertilized and the zygotes cultured at 38.5°C and 5% CO2. Were evaluated the nuclear maturation and the cytoplasmic maturation after pre-IVM and after IVM (24h. controls and 20 h. treatments). Fertilization was assessed 18 hours after insemination. The embryos development and quality were analyzed. The data were evaluated by ANOVA (P< 0, 05). Most remained in GV oocytes treated and after IVM was the reversal of the blockage, but the efficiency was lower with 10 μM of Bl-I. The cytoplasmic maturation during the time of meiosis blockage was benefited from the distribution agreement and potential of mitochondria, however, about the distribution of cortical granules only blocking conducted with 100μM Bl-I had a complete maturation. The rate of fertilization was damage by the time of transport, and the meiosis blockage with Bl-I did not improve the percentage of fertilized oocytes. The occurrence of polispermia was correlated with the percentage of oocytes with immature cortical granules. The embryo developmentb was delayed by the use of 100μM of Bl-I, but a good percentage of blastocysts of good quality reached. So, the use of 100μM of Bl-I has beneficial effects on the IPV of embryos from oocytes transported at a long time.

Resumo: toxina Épsilon (ETX) produzida pelo Clostridium perfringens tipos B e D é uma das mais potentes toxinas clostridiais superada apenas pelas neurotoxinas botulínica e tetânica. É responsável por quadros fatais de enterotoxemia em ovinos, caprinos e ocasionalmente em outros animais, caracterizados por edema em vários órgãos e aumento da permeabilidade vascular. Nos estudos "in vitro", a linhagem de células "Madin-Darby canine kidney" (MDCK) é susceptível à ação da ETX, que se heptameriza nas membranas celulares formando um poro complexo que evolui para a lise celular. No presente estudo, foram avaliadas a morfologia e a viabilidade celular, a despolarização da membrana mitocondrial e a expressão de mediadores de morte celular programada (Bax e Bcl-2), após a exposição das células MDCK, com a ETX, a cada 24 horas, durante intervalo de 1 a 5 horas. Verificou-se o aparecimento de vacúolos no interior do citoplasma celular associados à perda de viabilidade celular, que evoluíram de forma progressiva, nos períodos de 1 a 5 horas pós-exposição. Foram realizadas análises por citometria de fluxo acústica para obtenção de uma visão mais aprofundada da patogenia causada pela ETX. Utilizando a citometria de fluxo acústica, considerada altamente sensível, as células MDCK expostas à ação da ETX, nos períodos de 1 a 5 horas, revelaram uma diminuição do potencial de membrana mitocondrial, seguido da expressão das proteínas Bax (25,48 %) e Bcl-2 (45,45 %) na fase de formação do pré-poro (1 hora pós exposição). Estes resultados, juntamente com alta citotoxicidade e visualização de vacúolos celulares, demonstra que a análise por citometria de fluxo acústico representa potencialmente uma ferramenta eficaz para estudar a patogênese da ETX / Abstract:Epsilon toxin (ETX) produced by Clostridium perfringens types B and D is one of the most powerful clostridial toxins surpassed only by neurotoxins botulinum and tetanus. Studies blame the ETX by developing a fatal enterotoxemia in sheep, goats and occasionally in other animals, characterized by edema in multiple organs and increased vascular permeability. In "in vitro" toxicoinfection studies the "Madin-Darby canine kidney" (MDCK) cell line is susceptible to the action of ETX, which forms a heptamer in the cell membranes forming a pore complex that progresses to cell lysis. In the present study, we assessed cell viability and morphology, mitochondrial membrane depolarization and expression of programmed cell death mediators (Bax and Bcl-2) after exposure of MDCK cells with the ETX every 24 hours for range of 1 to 5 hours. Our results shows the appearance of vacuoles within the cytoplasm associated with loss of cell viability, which evolved gradually, in periods 1-5 hours after exposure. Analyzes were performed by acoustic flow cytometry to obtain further insight into the pathogenesis caused by ETX. Using acoustic flow cytometry, considered highly sensitive, MDCK cells exposed to the action of ETX, during 1 to 5 hours showed a decrease in mitochondrial membrane potential followed by the expression of Bax (25.48%) and Bcl-2 (45.45%) proteins at the pre-pore stage (1 hour post exposure). These results along with high cytotoxicity and visualization of cellular vacuoles, demonstrates that the flow cytometry analysis acoustic represents a potentially powerful tool for studying the pathogenesis of ETX / Orientador:Tereza Cristina Cardoso da Silva / Banca:Rafael Silva Cipriano / Banca:Roberto Gameiro de Carvalho / Banca:Marcia Marinho / Banca:Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Curci / Mestre

Orientador: Vitor Fernandes Oliveira de Miranda / Coorientador: Alessandro de Mello Varani / Banca: Marcos Tulio de Oliveira / Banca: Yoannis Domínguez Rodríguez / Resumo: A família Lentibulariaceae Rich. é considerada o maior grupo de plantas carnívoras dentre as angiospermas. Utricularia é o gênero de maior riqueza, com aproximadamente 250 espécies. Diversos estudos de identificação baseados em morfologia foram realizados para a família Lentibulariaceae, porém eles se mostram limitados para determinados grupos de espécies. Com base nisso a aplicação do DNA "Barcoding" pode ser uma importante alternativa. No presente estudo foram utilizadas sequências de DNA dos espaçadores intergênicos cloroplastidiais trnS-trnG e trnL-trnF e também do gene mitocondrial coxI com o objetivo de testá-las com a abordagem DNA "Barcoding" na diferenciação intraespecífica, interespecífica e entre as seções do gênero Utricularia. Com base nas matrizes de distâncias, a distância intraespecífica média foi de 0,004 para ambos os marcadores cloroplastidiais e de 0,006 para o gene coxI, a distância interespecífica média foi de 0,260 para trnS-trnG, 0,190 para trnL-trnF, 0,043 para coxI e a distância média entre as seções foi de 0,036, 0,029 e 0,025 para trnS-trnG, trnL-trnF e coxI, respectivamente. A análise baseada na árvore de "Neighbor-Joining" indicou que a maioria das espécies se agruparam em seções de acordo com o proposto para a filogenia do gênero, formando grupos monofiléticos. A eficácia de discriminação interespecífica foi 82% para trnS-trnG e 61% trnL-trnF, a discriminação intraespecífica foi de 36% para trnS-trnG e 23% para trnL-trnF. O gene mitocondrial coxI apresentou 24% de discriminação inter e intraespecífica, com resolução baixa de espécies na árvores de "Neighbor-Joining". Esses resultados demonstram que as regiões cloroplastidiais apresentam informações satisfatórias para separação das espécies em clados que corroboram com a filogenia do grupo e que portanto trnS-trnG e trnL-trnF podem ser considerados bons "barcodes" para o... / Abstract: The family Lentibulariaceae Rich. is considered the largest group of carnivorous plants among the angiosperms. Utricularia is the richest genus with approximately 250 species. Several studies based on morphological identification have been published for the family Lentibulariaceae, but they are limited regarding some groups of species. Hence, DNA Barcoding may be an important alternative. The present study used DNA sequences of chloroplast intergenic spacers trnS-trnG and trnL-trnF and also the mitochondrial gene coxI in order to test them with the DNA Barcoding approach to intraspecific, interspecific and between sections differentiation in the Utricularia genus. Based on the distance analyses, the average intraspecific distance was 0.004 for both chloroplast markers and 0.006 for the coxI gene, the average interspecific distance was 0.260 to trnS-trnG, 0.190 to trnL-trnF, 0.043 to coxI and the average distance between sections was 0.036, 0.029 and 0.025 to trnS-trnG, trnL-trnF and coxI, respectively. The analysis based on Neighbor-Joining tree indicated that most species were grouped into sections according to the proposed for the phylogeny of the genus, forming monophyletic groups. The efficacy of interspecies discrimination was 82% to trnS-trnG and 61% to trnL-trnF, intraspecific discrimination was 36% to trnS-trnG and 23% to trnL-trnF. The mitochondrial gene coxI showed 24% of inter and intraspecific discrimination, with low resolution of species on trees Neighbor-Joining. These results demonstrate that the chloroplast regions have satisfactory information to separate species in clades that corroborate the phylogeny of the group and therefore trnS-trnG and trnL-trnF can be considered good barcodes for the Utricularia genus / Mestre

Orientador: Mauricio Bacci Junior / Coorientador: Luíz Carlos Forti / Banca: Marco Antonio del Lama / Banca: Fabio de Melo Sene / Banca: Sergio Russo Matioli / Banca: Patricia Pasquali Parise Maltempi / Resumo: As formigas da tribo Attini apresentam um mutualismo com fungos basidiomicetos. Entre as attíneas, uma das mais derivadas é a formiga cortadeira Atta laevigata, que se apresenta com ampla distribuição na América do Sul e dividida em duas linhagens mitocondriais. Esta cortadeira já foi classificada em até três subespécies ou mesmo em duas espécies distintas, mas atualmente é considerada uma única espécie com grande variação morfológica. No presente trabalho, foram analisados indivíduos de 84 ninhos de A. laevigata em duas áreas na região Sudeste do Brasil. Nessas áreas foram encontrados indivíduos em ambas as linhagens mitocondriais, denominadas de linhagem I e II. Os machos da linhagem I se apresentaram distintos dos machos da linhagem II, com relação ao peso, dimensões do abdômen e estruturas da genitália. A congruência entre os marcadores morfológicos e mitocondriais sugere que as duas linhagens simpátricas de A. laevigata estão reprodutivamente isoladas, caracterizando um processo de especiação em andamento. Ninhos de ambas as linhagens de A. laevigata contiveram o mesmo fungo mutualista, Leucoagaricus gongylophorus, em três grupos gênicos distintos. Portanto, o processo de especiação em A. laevigata não foi causado por uma especialização no cultivo de um determinado grupo de fungo. Indivíduos simpátricos de linhagens distintas puderam realizar o voo nupcial simultaneamente. No entanto, análises de quatro lócus mitocondriais e seis lócus microssatélites mostraram que cada fêmea em uma das linhagens é fecundada exclusivamente (ou ao menos predominantemente) por machos da mesma linhagem. Portanto, há uma barreira pré-zigótica levando ao isolamento reprodutivo entre indivíduos simpátricos de linhagens distintas. Esta barreira foi provavelmente causada pelas diferenças corpóreas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Ants of Attini tribe have a mutualism with basidiomycete fungi. Among Attini ants, one of the most derived species is the leafcutter ant Atta laevigata, which has a wide distribution in South America and split into two mitochondrial lineages. This leafcutter has been classified into three subspecies or even up into two distinct species, but nowadays is considered a single species with great morphological variation. In this study, we analyzed 84 individuals from nests of A. laevigata located in two areas of southeastern region of Brazil. Individuals from both mitochondrial lineages, called lineage I and II, were found in those areas. Males of lineage I were different from males of lineage II, concerning weight, dimensions of the abdomen, and genitalia structures. The congruence between morphological and mitochondrial markers suggests that the two sympatric lineages of A. laevigata are reproductively isolated, characterizing a speciation process in progress. Nests of both A. laevigata lineages contained the same mutualistic fungus, Leucoagaricus gongylophorus, in three distinct genetic groups. Therefore, A. laevigata speciation process was not caused by a specialization in the cultivation of a particular group of fungi. Sympatric individuals of distinct lineages could perform the nuptial flight simultaneously. However, analysis of four mitochondrial and six microsatellite locus showed that each female from a lineage is fertilized exclusively (or at least predominantly) by one to six males from the same lineage. Thus, there is a pre zygotic barrier leading to reproductive isolation between sympatric individuals of distinct lineages. This barrier was probably caused by physical differences of males (including the genitalia) that makes it... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Roberto Gameiro de Carvalho / Banca: Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Cursi / Resumo: A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia da reprodução aplicada rotineiramente no melhoramento genético da espécie bovina. No entanto, ainda não está determinado até que ponto sua utilização pode implicar na disseminação de patógenos, como por exemplo, do Herpesvirus bovino tipo 5 (BoHV-5), considerado um α-herpesvirus neuro- virulento, potencialmente patogênico em bovinos. Para avaliar o impacto da exposição de oócitos bovinos ao BoHV-5 este estudo avaliou as taxas de desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos in vitro, a atividade mitocondrial, a ação antioxidante e a resposta ao estresse em dois grupos distintos; grupo controle e grupo expostos ao BoHV-5. A qualidade dos embriões bovinos produzidos in vitro, não foi afetada pela exposição ao BoHV- 5, a taxa de produção foi de 54,6 % no controle e 49,7% no exposto. O DNA viral correspondente ao gene US9 foi identificado em embriões bovinos no D7 após a fecundação in vitro e confirmado por reação imunofluorescência indireta. Os resultados revelaram diferenças (p<0,05) entre embrião do grupo de expostos e controle pelo MitoTracker Green FM, e pelo Jc-1. Não existiu diferença significativa nos índices de Hoechst 33342. Os embriões expostos produziram proteína antioxidante tipo 1 (AOP-1). Nenhum dos grupos produziram a proteína do choque térmico heat shock protein (Hsp 70.1). Ambos os grupos produziram a superóxido desmutase (SOD1), revelando atividade mitocondrial intensa, sem interferir na quantidade e qualidade dos embriões produzidos. Esses achados podem ajudar a entender a habilidade do α- herpesvirus em prevenir a apoptose / Abstract: The in vitro production of embryos is a biotechnology of reproduction routinely applied in the improvement of the bovine specie. However, it is not yet determined the extent to which its use may result in the spread of pathogens, such as the bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5), considered an α-herpesvirus neuro-virulent, potentially pathogenic in cattle. To assess the impact of exposure of bovine oocytes to BoHV-5 we studied the developmental rates of bovine in vitro produced, mitochondrial activity, antioxidant effects, stress response into two distinct groups, control group and group exposed to BoHV-5. The quality of bovine embryos produced in vitro was not affected by exposure to BoHV-5, the production rate was 54.6% in the control and 49.7% in the exposure. The viral DNA corresponding to the US9 gene was identified in the D7 bovine embryos after in vitro fertilization and confirmed by indirect immunofluorescence reaction. The results revealed differences (p <0.05) between embryo exposed group and control by MitoTracker Green FM, and the Jc-1. There was no significant difference in rates of Hoechst 33342. The exposed embryos produced antioxidant protein type 1 (AOP-1). None of them produced heat shock protein (Hsp 70.1). Both groups produced the superoxide dismutase (SOD1), revealing intense mitochondrial activity, without interfering in the quantity and quality of embryos produced. These findings may help understand the ability of α-herpesvirus in preventing apoptosis / Mestre

Orientador: Ione Salgado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wulff_Alfredo_M.pdf: 2480773 bytes, checksum: f1cbea2506b80bbad1e739df2bd5c1c4 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismo s de síntese e de degradação do radical óxido nítrico (NO) pela mitocôndria vegetal, com ênfase à influência das NAD(P)H desidrogenases e da oxidase alternativa (AOX) nestes processos. Os experimentos foram realizados com mitocôndrias isoladas de células em cultura da planta modelo Arabidopsis thaliana. Inicialmente estabeleceu-se um protocolo para o isolamento e purificação de mitocôndrias, cuja integridade funcional foi determinada pelo controle respiratório, potencial elétrico de membrana e transporte eletroforético de cálcio. Os processos de síntese e de degradação de NO foram analisados monitorando-se o consumo de oxigênio e as concentrações de NO no meio de reação, com eletrodos específicos. Os resultados mostraram que o nitrito inibiu a respiração das mitocôndrias de A. thaliana em competição com o oxigênio do meio. Esta inibição foi revertida por cPTIO, um seqüestrador de NO. Quando a AOX foi inibida por n-propilgalato, o efeito inibitório do nitrito na respiração mitocondrial foi aumentado, enquanto que, na presença de myxothiazol, que previne a redução da citocromo c oxidase (COX), o nitrito não teve efeito na respiração. Os efeitos observados do nitrito no consumo de oxigênio sugeriram que NO foi sintetizado pelas mitocôndrias de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito. Entretanto, a síntese de NO a partir de nitrito foi principalmente detectada em anaerobiose. Em altas concentrações de nitrito (1-5 mM), a produção de NO se mostrou praticamente insensível aos inibidores da cadeia respiratória, enquanto que, em concentrações menores de nitrito (100 -200 ?M) a COX, mas não a AOX, contribuiu para a síntese de NO. A exposição das mitocôndrias ao NO ou ao nitrito causou uma inibição transiente e menor no consumo de oxigênio quando NAD(P)H f oi utilizado como substrato respiratório, em relação ao succinato. Estas inibições foram potencializadas por superóxido dismutase, sugerindo um mecanismo de degradação de NO dependente de NAD(P)He de oxigênio pelas mitocôndrias de A. thaliana. O conjunto dos resultados mostra que o NO pode ser produzido pela mitocôndria de A. thaliana através de uma atividade redutora de nitrito e que as NAD(P)H desidrogenases e a AOX, além da COX, podem interferir nesta produção. Em aerobiose, a quantidade de NO produzido pode ser controlada pelas atividades de degradação das NAD(P)H desidrogenases e pela COX. A AOX contribui de maneira oposta, ajudando a manter a concentração de NO. Em anaerobiose a atividade redutora de nitrito é favorecida sendo o NO produzido nestas condições pela COX e também devido ao estado mais reduzido da cadeia respiratória. Ainda, em anaerobiose, os mecanismos de degradação de NO, dependentes de oxigênio, estão inibidos. Em conclusão, os resultados deste trabalho mostram a importância das proteínas alternativas da cadeia respiratória da mitocôndria para a homeostase do NO na planta / Abstract: The objective of this work was to study the mechanisms of synthesis and degradation of NO by plant mitochondria, with emphasis on the influence of the NAD(P)H dehydrogenases and the alternative oxidase (AOX) in these processes. The experiments were carried out with mitochondria isolated from cells in culture of the model plant Arabidopsis thaliana. Initially, a protocol for the isolation and purification of mitochondria was established, and their functional integrity was determined by respiratory control, electric membrane potential and electrophoretic calcium transport. The processes of synthesis and degradation of NO were analyzed by monitoring oxygen consumption and NO concentration in the reaction medium with specific electrodes. The results showed that nitrite inhibited respiration of A. thaliana mitochondria, in competition with oxygen in the medium. This inhibition was reversed by cPTIO, an NO scavenger. When AOX was inhibited by n-propylgalate, the inhibitory effect of nitrite in mitochondrial respiration was increased, whereas in the presence of myxothiazol, which prevents the reduction of cytochrome c oxidase (COX), nitrite had no effect on respirati on. The observed effects of nitrite in the oxygen consumption suggested that NO was synthes ized by A. Thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity. Meanwhile, the synthesis of NO from nitrite was mainly detected under anaerobiosis. At high concentrations of nitrite (1-5 mM), the production of NO was virtually insensitive to inhibitors of the respiratory chain, while at lower concentrations of nitrite (100-200 ?M) COX, but not AOX, contributed for the synthesis of NO. The exposure of mitochondria to NO or nitrite caused a transient and lower inhibition in oxygen consumption when NAD(P)H was used as respiratory substrate, compared to succinate. These inhibitions were enhanced by superoxide dismutase, suggesting an NAD(P)H- and oxygendependent mechanism for NO degradation by mitochondria of A. thaliana. The overall results show that NO can be produced by A. thaliana mitochondria through a nitrite reductase activity and that NAD(P)H dehydrogenases and AOX, in addition to COX, can interfere in this production. In aerobiosis the amount of NO produced can be controlled by the degradation activities of NAD(P)H dehydrogenases and COX. The AOX has an opposite effect, keeping the concentration of NO. In anaerobiosis the nitrite reductase activity is favore d and NO is produced in these circumstances by COX, and also due the more reduced state of the respiratory chain. Additionally, in anaerobiosis, the oxygen -dependent mechanisms of NO degradation are inhibited. In conclusion, the results of this study show the importance of the alternative proteins of the mitochondrial respiratory chain for NO homeostasis in the plant / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:29:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barreto_PedroPaulo_D.pdf: 2593736 bytes, checksum: 667c2ed03e1e7e51ac393087c3acc7ae (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) é uma proteína mitocondrial codificada pelo núcleo capaz de desacoplar o gradiente eletroquímico usado para a síntese de ATP, dissipando a energia na forma de calor. A descoberta de homólogos e ortólogos da UCP1, sugere outros papéis fisiológicos para estas proteínas. As UCPs podem servir como uma válvula de escape, diminuindo a força protonmotiva (PMF) e reduzindo a produção de ROS em condições desfavoráveis. Plantas superexpressando UCPs se desenvolvem melhor quando submetidas a estresses bióticos e abióticos. Estas plantas demonstraram diminuição na produção de ROS, alteração no estado redox celular, além de um aumento no metabolismo energético e na fotossíntese. Neste trabalho nós investigamos os mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo energético celular e resposta a estresses em plantas de tabaco superexpressando a UCP1 de A. thaliana. Demonstramos, através de análises moleculares e genômicas, que a superexpressão da UCP1 é capaz de provocar o aumento na respiração desacoplada em mitocôndrias isoladas, diminuir o conteúdo de ATP intracelular, e desencadear um processo de sinalização retrógrada que resulta na indução de genes mitocondriais e genes responsivos a estresses. Esta sinalização retrógrada resultou na indução do processo de biogênese mitocondrial verificado pelo aumento no número e área mitocondrial por célula, além de alterações morfológicas nestas organelas. O processo de biogênese mitocondrial nestas plantas é acompanhado pelo aumento na expressão de um grande número de genes responsivos a estresses, o que resulta no melhor desempenho e reduzida produção de ROS mitocondrial quando submetidas a estresses abióticos. A análise detalhada do transcriptoma de plantas superexpressando UCP1 em comparação com plantas selvagens demonstrou uma forte conexão entre os metabolismos mitocondrial, citoplasmático e cloroplástico para compensar as alterações provocadas pelo aumento na atividade da UCP1. Um grande número de fatores de transcrição ainda não caracterizados foram identificados e podem representar bons alvos para investigações futuras a respeito da regulação da biogênese mitocondrial e do metabolismo energético em plantas. Os resultados contidos nesta tese nos permitem melhor compreender a flexibilidade do metabolismo energético em plantas e identificar possíveis reguladores do processo de biogênese mitocondrial e resposta a estresses em plantas / Abstract: The mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1) is a nuclear-encoded mitochondrial protein capable of uncouple the electrochemical gradient used for ATP synthesis, dissipating energy as heat. The discovery of UCP1 homologues, and its corresponding orthologues suggest diverse physiological functions for these proteins. UCPs may serve as an escape valve, decreasing the proton motive force (PMF) and preventing ROS production under unfavorable conditions. Plants overexpressing UCPs perform better under biotic and abiotic stresses. These plants show diminished ROS production, alteration of cell redox homeostasis, increased energy metabolism and photosynthesis. In this work we investigated the molecular mechanisms underlying cell energy metabolism and stress response in tobacco plants overexpressing an Arabidopsis thaliana UCP1. We demonstrated through molecular, cellular and genomic tools that UCP1 overexpressing plants is capable of increasing uncoupled respiration of isolated mitochondria, decrease intracellular ATP levels, and trigger a retrograde signaling that resulted in a broad induction of mitochondrial and stress response genes. The retrograde signaling resulted in the induction of mitochondrial biogenesis verified by increased mitochondrial number, area and alterations on mitochondrial morphology. The increased mitochondrial biogenesis in these plants accompanied by the broad increase in the expression of stress responsive genes, may be responsible for the diminished ROS production and the better performance of these plants when submitted to several abiotic stresses. We also performed a detailed analysis of the transcriptome expression of the UCP1 overexpressing plants as compared with the wild type plants. We verified that the UCP1 overexpressing plants exhibited a tight connection between mitochondrial, cytoplasm and chloroplast energy metabolism to accommodate the alterations caused by the increased UCP1 activity. A number of uncharacterized transcription factors seem to be good targets for future investigations on the regulation of plant mitochondrial biogenesis and energy metabolism. The results presented in this work allowed a better understanding of the flexibility of energy metabolism in plants, and the use of this mechanism to identify possible regulators of plant mitochondrial biogenesis and stress response / Doutorado / Bioinformatica / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specific organelle damage caused by valinomycin, to maintain cell homeostasis. Interestingly, the loss of Atg32 function only partially affected the respiratory complex specific degradation, while the Atg11 protein was absolutely required in this process. Fission and fusion machinery proteins (Fzo1 and Fis1) and some mitochondrial proteases (Yme1, Pim1 and Afg3) also have a role in the valinomycin-mediated mitophagy. This process might start by Atg11 accumulation in foci close to the mitochondria shortly after valinomycin treatment. In this work, we describe for the first time a specific mechanism of mitophagy mediated by damage in yeast, which opposes to the concept of a generalized degradation of the organelle. / [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condiciones ambientales, se quiso estudiar qué ocurría en los complejos de la cadena de transporte de electrones en estas condiciones. Se observó que los complejos I y III se degradaban ante elevadas tasas respiratorias, al parecer como un mecanismo de reciclaje. Además, ante un daño mitocondrial específico utilizando valinomicina, también existía una degradación específica de los complejos respiratorios I y III, para mantener la homeostasis celular. Este proceso es dependiente de Atg11, e independiente de Atg32. También parecen implicadas proteínas de la maquinaria de dinámica mitocondrial (Fzo1 y Fis1) y algunas proteasas mitocondriales (Yme1, Pim1 y Afg3). El inicio de este proceso parece producirse ante la aparición de foci de Atg11 cercanos a la mitocondria. Se describe por primera vez en levadura un mecanismo específico de mitofagia inducida por daño, que contrasta con el concepto de degradación generalizada del orgánulo. / [CAT] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electrònic a aquestes condicions. Es va observar que els complexes I i III es degradaven davant d'elevades taxes respiratòries, com a mecanisme de reciclatge. A més, davant d'un dany mitocondrial específic utilitzant valinomicina, també existia una degradació específica dels complexes respiratoris I i III, per a mantenir l'homeòstasi cel·lular. Aquest procés és depenent d'Atg11, però independent d'Atg32. També semblen implicades proteïnes de la maquinària de dinàmica mitocondrial (Fzo1 i Fis1) i algunes proteases mitocondrials (Yme1, Afg3 i Pim1). L'inici d'aquest procés sembla produir-se per l'aparició de foci d'Atg11 propers a la mitocòndria. Per primera volta, es descriu en llevat un mecanisme específic de mitofagia induïda per dany, que contrasta amb el concepte de degradació generalitzada de l'orgànul. / Timón Gómez, A. (2016). MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/64873 / TESIS

El exceso de sales en el medio causa grandes inconvenientes tanto a nivel agrícola debido a las pérdidas que se producen en la calidad y la cantidad de las cosechas, como a nivel médico, siendo responsable de un gran número de enfermedades. El estrés osmótico desencadena mecanismos adaptativos complejos que estudiamos en la presente tesis utilizando como organismo modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae por tratarse de células eucariotas unicelulares metodológicamente accesibles y por la conservación evolutiva de los mecanismos moleculares de la adaptación al estrés entre organismos eucariotas. El principal objetivo de la presente tesis consistió en identificar nuevos procesos moleculares que tienen lugar en las células de levadura cuando éstas sufren un estrés hiperosmótico. Hasta el momento se sabía que la respuesta a estrés osmótico involucraba un gran número de procesos biológicos que tienen lugar a varios niveles como son la regulación de los transportadores de iones, la síntesis de osmolitos para mantener estable la estructura celular, la regulación del ciclo celular y de la traducción y la activación masiva de la expresión génica. Durante la presente tesis hemos identificado a la mitocondria como orgánulo cuya funcionalidad es crucial para la adaptación de las células de levadura al estrés hiperosmótico. Mediante análisis northern mostramos que las células responden al estrés osmótico activando la mitocondria al nivel de expresión génica. Mediante ensayos de actividad enzimática, mostramos que la mitocondria de las células sometidas a estrés es más activa que en condiciones óptimas de crecimiento y mediante ensayos proteómicos, observamos diferencias notables entre los proteomas mitocondriales de aquéllas células que crecen en condiciones hiperosmóticas. Además, hemos demostrado que una de las mayores funciones de la mitocondria en condiciones de estrés osmótico es el control de la generación de estrés oxidativo. / Martínez Pastor, MM. (2011). Análisis de la función y la regulación de la mitocondria de la levadura Saccharomyces cerevisiae en respuesta a estrés osmótico [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10600 / Palancia