Le complexe passager joue un rôle clé en mitose: contrôlant à la fois la ségrégation des chromosomes, la tension du fuseau, l'entrée en anaphase et la cytodirèse. Le complexe est composé de quatre protéines: INCENP, la kinase Aurora B, Survivine et Boréaline. Sachant que la protéine Survivine est phosphorylée par Aurora B et qu'elle a un role pivot au sein du complexe, nous avons étudié un mutant mimant sa phosphorylation: Survivine T117E. La phosphorylation de Survivine est nécessaire à la transition Métaphase/ Anaphase. Le mutant Survivine T117E est faiblement lié aux centromères en métaphase et agit comme un dominant négatif de la cytodirèse, empêchant la séparation des deux cellules filles. Lors de la recherche d'inhibiteurs des Aurora kinases, nous avons identifié une nouvelle classe de molécules qui inhibent la phosphorylation de l'histone H3 et le point de contrôle du fuseau. Ces molécules préviennent la prolifération des cellules tumorales. Ces composés sont des outils intéressants pour étudier la fonction du complexe passager et représentent un nouveau motif moléculaire pour le développement de drogues anticancéreuses. Survivine et Aurora B kinase dont l'expression est restreinte à la mitose sont deux cibles pour de nouvelles thérapies anti-mitotiques.

De nombreuses kinases participent au bon déroulement de chaque étape du cycle cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, les kinases Aurora-A et Aurora-B, structuralement très proches, exercent des rôles fondamentaux durant la mitose. Aurora-A est une protéine localisée au niveau des centrosomes, impliquée dans le cycle de division du centrosome et la formation du fuseau mitotique. Aurora-B est une protéine passagère localisée sur les centromères et qui migre, en anaphase, sur le sillon de division et se concentre en cytocinèse sur le corps résiduel. Aurora-B est responsable de la phosphorylation massive, en mitose, du résidu Serine 10 de l'histone H3. Par un système de pseudo-génétique, j'ai ciblé, dans l'extrémité amino-terminale de Aurora-A, le domaine responsable de sa localisation centrosomique. Ces expériences ont montré que les domaines catalytiques de Aurora-A et Aurora-B possèdent tous deux un signal de localisation centromérique. Mais, à l'inverse de Aurora-B, le domaine catalytique de Aurora-A ne se transfert pas des centromères vers le sillon de division en anaphase. Ces travaux montrent également que Aurora-A est capable d'assurer une partie des fonctions mitotiques de Aurora-B. J'ai par ailleurs identifié et cloné la séquence de la protéine passagère TD-60 de Xenopus laevis. J'ai exprimé des domaines protéiques de la protéine xTD60, afin de générer un anticorps spécifique de TD-60 de xénope. Des expériences de co-sédimentation de complexes protéiques d'extraits mitotiques d'œufs de xénope et des expériences d'immunolocalisation cellulaire nous permettent d'envisager pour xTD-60 des fonctions plus larges que celles attribuées aux protéines passagères.

Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden. / The Dictyostelium centrosome consists of a layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. A tight linkage through the nuclear envelope connects the cytosolic centrosome with the clustered centromeres within the nuclear matrix. At G2/M the corona dissociates, and the core structure duplicates yielding two spindle poles. The two proteins CP148 and CP55 were discovered in a proteomic analysis of Dictyostelium centrosomes. CP148 is a novel coiled-coil protein of the centrosomal corona. GFP-CP148 exhibited cell cycle dependent presence and absence at the centrosome, which correlates with dissociation of the corona in prophase and its reformation in late telophase. During telophase, GFP-CP148 formed cytosolic foci, which coalesced and joined the centrosome. This explains the hypertrophic appearance of the corona upon strong overexpression of GFP-CP148. Depletion of CP148 by RNAi caused virtual loss of the corona and disorganization of interphase microtubules. Surprisingly, formation of the mitotic spindle and astral microtubules was unaffected. Thus, microtubule nucleation complexes associate with centrosomal core components through different means during interphase and mitosis. Furthermore, CP148 RNAi caused dispersal of centromeres and altered Sun1 distribution at the nuclear envelope, suggesting a role of CP148 in the linkage between centrosomes and centromeres. Taken together, CP148 is an essential factor for the formation of the centrosomal corona, which in turn is required for centrosome/centromere linkage. As CP148, CP55 was also identified in a centrosomal proteome analysis. It is a component of the centrosomal core structure, and persists at the centrosome throughout the entire cell cycle. FRAP experiments revealed the majority of centrosomal GFP-CP55 is immobile indicating a structural task of CP55 at the centrosome. GFP-CP55 overexpression elicits supernumerary centrosomes containing the usual set of corona and core marker proteins. The CP55 null mutant is characterized by increased ploidy, a less structured, slightly enlarged corona, and by supernumerary, cytosolic MTOCs, containing only corona proteins and lacking a core structure. Live cell imaging showed that supernumerary MTOCs arise in telophase. Lack of CP55 also caused premature recruitment of the corona organizer CP148 to mitotic spindle poles, already in metaphase instead of telophase. Forces transmitted through astral microtubules may expel prematurely acquired or loosely attached corona fragments into the cytosol, where they act as independent MTOCs. CP55null cells were also impaired in growth, most probably due to difficulties in centrosome splitting during prophase. Furthermore, although they were still capable of phagocytosis, they appeared unable to utilize phagocytosed nutrients. This inability may be attributed to their disorganized Golgi apparatus.

Optineurine ("Optic neuropathy-inducing", Optn) est une protéine exprimée de façon ubiquitaire chez les vertébrés et impliquée dans de nombreux processus cellulaires tels que la régulation du trafic vésiculaire associée à l'appareil de Golgi, la réponse immunitaire innée ou l'autophagie des bactéries. Mon travail de thèse a permis de caractériser une nouvelle fonction d'Optn dans la régulation du cycle cellulaire. Plus précisément, j'ai pu montrer qu'Optn était un régulateur négatif de Polo-like kinase 1 (Plk1), une kinase qui joue un rôle clef dans chacune des étapes de la mitose : de la prophase à la cytokinèse. Les résultats présentés dans cette thèse montrent qu'Optn est phosphorylée par Plk1 sur la sérine 177 en début de mitose provoquant le détachement d'Optn de l'appareil de Golgi et son accumulation dans le noyau. Nous avons montré que la phosphorylation et la translocation nucléaire d'Optn étaient requises pour permettre la régulation négative de Plk1 par le complexe phosphatase MYPT1-PP1 au cours de la mitose. Les conséquences fonctionnelles de la déplétion d'Optn et donc de l'hyperactivité de Plk1 sont des défauts de cytokinèse et de ségrégation des chromosomes, aboutissant à l'apparition de cellules plurinucléées. En conclusion, nos résultats mettent en évidence un mécanisme de rétrocontrôle négatif par lequel Plk1 module la localisation d'Optn pendant la mitose pour réguler sa propre activité

Par cette étude, nous montrons que la phosphorylation d'Eg5 par Eg2 n'est pas importante pour sa fonction dans la formation du fuseau mitotique dans l'extrait d'oeuf de Xénope. Au contraire, la phosphorylation d'Eg5 par Cdk1 est nécessaire pour son attachement aux microtubules. Cet attachement permettra par la suite l'assemblage du fuseau mitotique. En plus de confirmer de précédentes études, ces résultats indiquent que le site de phosphorylation de Cdk1 n'est pas seulement conservé parmi les membres des Kinésines 5, mais également que son mécanisme de régulation est conservé. Bien que des expériences plus approfondies soient nécessaires afin de caractériser les propriétés motrices d'Eg5 par l'intermédiaire de notre expérience de "microtubule-gliding" dans l'extrait de Xénope, nos expériences réalisées avec des chimères d'Eg5 ont souligné l'importance des propriétés motrices intrinsèques à Eg5 qui sont cruciales pour la formation du fuseau mitotique. En effet, aucune de ces chimères n'a pu rétablir la formation du fuseau mitotique. De plus, ces expériences ont fourni la première preuve expérimentale que la classification des Kinésines en différentes sous-familles selon la conservation de séquence de leur domaine moteur a également abouti à les classer selon leurs différentes fonctions.

Les ARNs non codants sont des régulateurs de l'expression génétique à plusieurs niveaux. Chez la bactérie et chez la souris, des ARNs non codants (6S et B2) ont la propriété de se lier à l'ARN polymérase et d'inhiber son activité. Afin de déterminer si l'ARN polymérase II (RNAPII) humaine était associée à des ARNs non codants, une immunoprécipitation anti-RNAPII a été réalisée sur des cellules HeLa mitotiques. Les ARNs co-immunoprécipités ont été purifiés et marqués et l'ARN U1 s'est trouvé particulièrement enrichi par rapport au contrôle. Cette co-immunoprécipitation reflète l'association de la snRNP U1 avec la RNAPII. Pour vérifier cette association sur un site de transcription actif, des lignées ont été établies avec l'insertion en multiples copies d'un gène à un site unique, créant ainsi un unique super site de transcription visualisable par FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Deux lignées distinctes ont été créées, l'une avec un gène comportant un intron, l'autre avec le même gène où l'intron comporte trois mutations ponctuelles abolissant l'épissage. Alors que les snARNs U2, U4, U5 et U6 sont absents du site non épissé, l'ARN U1 est enrichi de la même façon indépendamment de l'épissage. La présence des protéines spécifiques de la snRNP U1 indique que la snRNP U1 est recrutée au complet au site de transcription. Ces résultats laissent supposer un rôle pour l'association RNAPII - U1snRNP dans l'épissage cotranscriptionnel.

L'ARN interférence (ARNi) est un phénomène découvert en 1998 par lequel la présence d'ARN double brin au sein d'une cellule entraîne la dégradation d'ARN de séquence homologue. L'ARNi est effectué par un complexe ribonucléoprotéique contenant des petits ARN double brin et au moins une protéine de la famille Argonaute. Cette thèse a été consacrée à l'étude de l'ARNi chez le protozoaire Trypanosoma brucei. Nous avons d'abord défini les conditions d'utilisation de l'ARNi au niveau de la spécificité et de l'efficacité, paramètres qui ont servi à l'élaboration d'un logiciel permettant la sélection de l'ARN double brin pour les études fonctionnelles. Ensuite, nous avons recherché plusieurs gènes candidats codant pour des protéines participant à l'ARNi. Le meilleur d'entre eux, TbAGO1, appartient à la famille Argonaute et se caractérise par la présence d'un domaine supplémentaire, capable de lier les ARN. Il est essentiel pour l'ARNi chez le trypanosome. Sa délétion produit des défauts significatifs lors de la mitose et nous avons établi que l'ARNi contribue à la formation du fuseau mitotique et à la ségrégation des chromosomes. Un second phénotype observé en l'absence d'ARNi est la surexpression des ARN de deux types de rétroposons (rétrotransposons sans LTR), sans toutefois augmentation de leur activité de rétroposition. Les deux phénotypes sont indépendants l'un de l'autre. Nous avons ensuite démontré que la présence d'ARN double brin entraîne la destruction d'ARN cible de séquence homologue dans le cytoplasme mais peut aussi conduire à une extinction de la transcription du gène correspondant. Ce type de mécanisme pourrait non seulement contrôler l'expression des ARN des rétroposons, mais aussi celle des gènes dans lesquels ils sont insérés.

Thèse de doctorat : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie : Strasbourg 1 : 2007. / Thèse soutenue sur un ensemble de travaux. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 193-222.

Microtubules are tubular polymers that are involved in a variety of cellular processes such as cell movement, mitosis and intracellular transport. The dynamic behavior of microtubules makes this possible because all of these processes require quick responses. Embryonic stem (ES) cells were first isolated from mouse embryos and they have two unique characteristics; they can be kept undifferentiated for many passages with a stable karyotype and they can be differentiated into any type of cells under appropriate conditions. The pluripotency of ES cells, their ease of manipulation in culture, and their ability to contribute to the mouse germ-line provides us a model of differentiation both in vitro and in vivo. In my thesis I focused on the cell division and neuronal differentiation of ES cells and developed two methods to understand the effects of microtubule dynamics in spindle assembly and chromosome segregation and to reveal the roles of different Microtubule Associated Proteins (MAPs) in the neuronal morphology formation. In the first part, we developed a live-cell imaging method for ES cells to visualize, track and analyze the single cell behavior in a cell population over a time period. So far many techniques have been adapted and combined for imaging of cell lines, mainly for the cancer or immortalized ones. However, because ES cells are very prone to apoptosis, tend to form spheres and hard to stably label, it is quite tricky to image them in culture conditions. In our system, we combined the BAC-based gene expression with wide-field deconvolution microscopy for ES cells that are plated onto the laminin-511 coated surface and kept in CO2 independent culture conditions. This combined technique does not interfere with the growth of cells and keeps them healthy up to 24 hours on the microscope stage. In the second part, we analyzed the effects of MAPs chTOG, EB1, Kif18A and MCAK in the overall spindle morphology and mitotic progression in mES cells. For this purpose, we utilized our stable TUBB-GFP and H2A-GFP cell lines along with our live-cell imaging set-up to reveal the effects of the above-mentioned proteins and the interplay among each other. By using RNAi method we either single or co-depleted the genes by siRNAs and measured the spindle length and width in RNAi conditions. We further analyzed the mitotic progression in H2A-GFP cell line in terms of the metaphase timing and the percentage of chromosome segregation errors. Our results showed that, EB1 depletion did not cause any significant changes in the overall spindle morphology or in the metaphase timing. However, the co-depletion of EB1 with chTOG partially rescued the sichTOG specific mini-spindle phenotype. siKif18A produced longer spindles without any change in the spindle width. Surprisingly, the co-depletion of antagonistic chTOG and Kif18A proteins had additive effects on the spindle dynamics and on mitotic progression in a way that spindle assembly was severely disrupted by the absence of these two proteins and as a result of this, both metaphase timing and chromosome missegregation levels increased significantly. These results overall indicate that MAPs have important roles in the regulation of dynamic instability and these proteins have an interplay among each other to be able to control the morphology of the spindle as well as the correct segregation of chromosomes into daughter cells. In the last part, I will introduce you a new ES cell based differentiation and morphology model, which brings the advantages of high resolution imaging capacity, control over development and easy genetic manipulation and culturing. We have generated Tet-induced shRNA cell lines against chTOG, Kif18A and MCAK, which are also stably expressing TUBB-GFP. These labeled cells were mixed with unlabeled wild-type mES cells before differentiation at 1:1000 ratio and then they were differentiated into mouse cortical cells and spinal motor neurons. Our results showed that, all of the three genes could be successfully knocked-down by shRNA after 48 hours of Tet induction. After mixing the labeled and unlabeled cells, single neurons could be imaged at high resolution and their skeletons could be generated afterwards. The RNAi studies in shchTOG cell line showed that, the knock-down of this gene in early differentiation interferes with the neuronal differentiation.

Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation.