Les chimiokines (CKs) jouent un rôle important dans l'orchestration de la réponse immunitaireen contrôlant notamment la mobilisation des cellules immunitaires. Les cellules myéloïdes et, enparticulier, les monocytes sont impliquées dans le processus inflammatoire et notamment dansle développement des cancers. En effet, les cellules dérivées des monocytes ou macrophagesassociés aux tumeurs sont fortement représentés dans le micro environnement tumoral et sontsouvent associés à un mauvais pronostic. La caractérisation des mécanismes aboutissant aurecrutement des monocytes dans la tumeur représentent donc un enjeu majeur pourl'optimisation des protocoles thérapeutiques anti-cancéreux. Chez la souris, deux populationsmonocytaires sont caractérisées sur la base de l'expression différentielle des récepteurs auxchimiokines CCR2 et CX3CR1 et interviennent dans leur recrutement et leur différenciation enmacrophages dans les tissus, les monocytes inflammatoires (CCR2+, CX3CR1low) et les monocytesdits résidents (CCR2-, CX3CR1high). L'objectif principal de mon projet de recherche a été de mieuxcomprendre les mécanismes contrôlant la mobilisation des monocytes suite à un traitementchimiothérapeutique. J'ai entrepris d'étudier le rôle des récepteurs aux chimiokines, enparticulier CX3CR1, dans la reconstitution monocytaire après traitement chimiothérapeutiquepar le cyclophosphamide (CP), un agent alkylant reconnu pour son activité myélosuppressive. LeCP provoque un renouvellement des monocytes et une forte infiltration de la tumeur par les LTspécifiques de la tumeur (issus d'un transfert adoptif) associés à la réactivation de la réponseimmune anti-tumorale. Cependant, les LTs spécifiques de l'antigène de la tumeur se localisentpréférentiellement dans des zones riches en cellules dendritiques associées à la tumeur (TuDCs)et sont piégés par ces dernières. Ces interactions diminuent potentiellement le nombre decontacts entre les LT et les cellules tumorales suggérant un rôle pro tumoral des TuDCs. Letraitement au CP provoque une déplétion des cellules myéloïdes suivie d'une reconstitutionmassive des réservoirs de monocytes (moelle osseuse et rate). Au cours de la reconstitutionmonocytaire, l'expression de CX3CR1 diminue et est corrélée à une diminution de l'adhérence exvivo des cellules médullaires. Nous avons mis en évidence une mobilisation accrue desmonocytes inflammatoires au sein des souris CX3CR1- /- comparée aux souris WT et CCR2-/-.L'imagerie in vivo de la moelle osseuse au sein de souris CX3CR1-/- ou à l'aide d'un antagonistede CX3CR1 nous a permis de montrer un rôle spécifique de CX3CR1 dans le " crawling " sur lescellules endothéliales et le confinement des cellules monocytaires au niveau des sinus et duparenchyme médullaire. Nous suggérons qu'au cours de la mobilisation cellulaire induite par leCP le récepteur CX3CR1 contrôle la rétention médullaire des monocytes. Nous pensons que lamodulation du taux de mobilisation cellulaire au cours de la reconstitution induite par CP et/oule ciblage de CX3CR1 pourrait, par augmentation du pool de cellules myéloïdes leucocytairesd'un hôte, contribuer à l'amélioration des réponses cellulaires à la suite d'une lésion tissulaireou d'un dysfonctionnement des défenses immunitaires. De plus, le ciblage de CX3CR1 pourraittrouver des applications dans le domaine de la greffe de HSCs.

La prostate est entourée de tissu adipeux périprostatique (TAPP), séparée de celui-ci uniquement par une fine barrière de collagène appelée la capsule prostatique. En clinique, l'infiltration du TAPP par des cellules tumorales est l'un des principaux critères histologiques de mauvais pronostic suggérant que le TAPP (en particulier les adipocytes) pourrait être un acteur clé de l'agressivité du cancer de la prostate. Dans un premier temps, nous avons identifié une chimiokine adipocytaire (CCL7) et un de ses récepteur (CCR3) qui contribuent à la dissémination des cellules cancéreuses à l'extérieur de la prostate. En effet, à travers des approches in vitro et in vivo, nous avons montré que l'inhibition de l'axe CCR3/CCL7 diminue la dissémination locale du cancer de la prostate avec un effet plus prononcé en conditions d'obésité. De plus, l'expression de ce récepteur est associée à l'agressivité tumorale et à la rechute chez les patients. Au-delà de la dissémination locale, une des complications du cancer de la prostate les plus graves et les plus dures à traiter reste la dissémination métastatique osseuse. Fort des résultats obtenus dans la première partie de notre travail, nous avons voulu savoir si les adipocytes médullaires présents au niveau du site métastatique osseux étaient capable d'attirer les cellules tumorales par les mêmes mécanismes que le TAPP. En utilisant des échantillons d'adipocytes médullaires issus de patients lors d'approches in vitro, nous avons pu montrer que les adipocytes médullaires présentent un phénotype différent de ceux du TAPP et qu'ils sécrètent la chimiokine CCL7 en quantité bien plus élevée. Cette dernière va ainsi induire la migration des cellules tumorales prostatiques vers le site osseux suivant un axe CCR3/CCL7. En inhibant cet axe, nous avons pu montrer in vivo et in vitro le potentiel de cet axe comme cible thérapeutique, puisqu'il nous a permis d'empêcher spécifiquement la formation de métastases osseuses. Nous avons pu confirmer l'importance de l'axe CCR3/CCL7 dans le cancer de la prostate métastatique par des méta-analyses cliniques et des études sur des tumeurs de patients. Enfin, nous avons pu montrer que les modifications physiopathologiques des adipocytes comme l'obésité et le vieillissement tous deux considérés comme des facteurs de risque du cancer de la prostate, augmentent fortement la migration induite par les adipocytes médullaires. En conclusion, nos résultats montrent que les adipocytes périprostatiques et médullaires sont capables d'influencer la progression du cancer de la prostate en favorisant, via la sécrétion de chimiokines, le franchissement de la capsule prostatique puis la dissémination métastatique osseuse. L'ensemble de ces mécanismes est amplifié en conditions d'obésité ou de vieillissement ce qui permet de proposer de nouveaux mécanismes moléculaires à l'émergence de cancers plus agressifs chez ces patients. Ainsi notre travail a permis d'identifier l'axe CCR3/CCL7 comme un axe majeur dans la dissémination du cancer de la prostate induite par le tissu adipeux, intervenant aussi bien au niveau local qu'au niveau métastatique. / Prostate is surrounded by periprostatic adipose tissue (PPAT), only separated by a thin layer of collagen called prostatic barrier. Infiltration through PPAT and prostatic barrier crossing by tumor cells are known as major histological and clinical bad prognosis factors. These observations suggest a key role of PPAT (and mainly adipocytes) in prostate cancer development and invasiveness. First, we identified a chemokine secreted by adipocytes (CCL7) and its associated receptor (CCR3) that contribute to local dissemination of prostate cancer cell and lead them to leave the prostate. Thus, using in vitro and in vivo approach, we showed that the inhibition of CCR3/CCL7 axis decreases local dissemination of prostate cancer with an enhanced effect in obesity context. Moreover, CCR3 expression has been associated to tumor aggressiveness and relapse on patient samples. Beyond local dissemination, bone metastasis is one of the major and deadliest complication of prostate cancer, with only few treatments available. Regarding results obtained in our first work on local dissemination, we focused on medullary adipocytes contained in bone marrow and study whether or not they could chemoattract prostate cancer cells just as PPAT in local dissemination. Using medullary adipocytes samples from patients and in vivo approach, we showed that medullary adipocytes expressed a unique phenotype different from PPAT adipocytes and that they secrete high level of CCL7. This chemokine will lead to directed migration of prostate cancer cells towards bone metastatic site through CCR3/CCL7 axis. By inhibiting this axis, we observed a specific inhibition of bone metastases formation both in vitro and in vivo, highlighting the therapeutic potential of this axis. We confirmed the main impact of CCR3/CCL7 axis in prostate cancer metastases, using clinical meta-analysis and studies on tumors from patients. Finally, we showed that physiopathological modifications of adipocytes, such as obesity and aging, which are both considered as prostate cancer bad prognosis factors, increase the chemoattraction of prostate cancer cells induced by medullary adipocytes secretions. As a conclusion, our results highlight that periprostatic adipocytes and medullary adipocytes can influence prostate cancer progression by secreting chemokines and leading to prostatic barrier crossing and bone metastatic dissemination. These mechanisms are enhanced in obesity and aging context. This allow us to suggest a new molecular mechanisms enhancing cancer aggressiveness. Thus, our work allowed us to identify CCR3/CCL7 axis as a major axis in the dissemination of prostate cancer induced by adipocytes secretions, acting on both local and metastatic level.

La perception de la douleur résulte de l'intégration dans la moelle épinière des informations sensorielles et nociceptives transmises par les afférences primaires. Parmi celles-ci, les Mechanorécepteurs C à bas seuil (C-LTMR), exprimant la chimiokine TAFA4, ont été identifiés comme des modulateurs de la douleur. Cependant, les mécanismes sous-jacents au contrôle de l'intégration sensori-nociceptive par TAFA4 restent mal compris. Grâce aux enregistrements obtenus in vitro par patch clamp chez des souris naïves, nous montrons que l'application exogène de TAFA4 induit une diminution de la fréquence des courants post-synaptiques excitateurs spontanés (CPSE). A l’inverse nous observons une augmentation de la fréquence des événements synaptiques inhibiteurs spontanés (CPSI). Cette modulation de l'activité synaptique est préservée avec TTX, indiquant que TAFA4 modifie la transmission synaptique par des mécanismes présynaptiques. En stimulant les fibres nociceptives à haut seuil d’activation, nous démontrons que TAFA4 induit une augmentation du ratio des réponses synaptiques des interneurones évoquées par des stimulations d’impulsions pairées. Par conséquent, TAFA4 renforce l'inhibition présynaptique des fibres nociceptives. Nous démontrons également que les effets de TAFA4 sur la transmission excitatrice spontanée et évoquée sont bloqués par des antagonistes des récepteurs GABA, indiquant que les C-LTMRs interagissent principalement avec les neurones GABAergiques. De plus, des expériences de microscopie électronique ont révélé la présence de contacts synaptiques directs entre les C-LTMRs et les terminaisons GABAergiques dans la lamina IIi. Pour aller plus loin dans la caractérisation des effets de TAFA4 sur la transmission de la douleur, nous avons induit une inflammation de la patte arrière des souris (modèle CFA). Chez ces souris, l'effet de TAFA4 sur la fréquence EPSC et IPSC est conservé. Nous constatons que chez les souris CFA, TAFA4 diminue la décharge neuronale enregistrée in vivo suite à une stimulation mécanique nociceptive de la patte inflammée. Cet effet est bloqué par une injection d'antagonistes des récepteurs GABA. En effectuant le test Von Frey sur des souris inflammées, nous montrons que l’action anti-allodynique induite par l'injection intrathécale de TAFA4 est bloquée par les antagonistes des récepteurs GABA. Nous avançons l’hypothèse que les C-LTMRs contactent directement les interneurones GABAergiques de la corne dorsale et, via la libération de TAFA4, renforcent l'activité synaptique inhibitrice participant à l’effet anti-nociceptif de TAFA4. En outre, TAFA4 favorise la rétraction microgliale chez les animaux inflammés, ainsi qu'une augmentation du nombre de synapses inhibitrices sur les somas des neurones de la lamina IIi. En conclusion, ces résultats identifient les interneurones GABAergiques comme premier relais d'intégration pour les C-LTMRs et mettent en évidence une nouvelle interaction entre les neurones sensoriels, les cellules microgliales et les interneurones de la moelle épinière, permettant une modulation fine de l'activité inhibitrice et de la transmission nociceptive en situation pathologique. / Pain elaboration results from the integration within dorsal spinal cord of sensory and nociceptive information conveyed by primary afferents. Among these, C low-threshold Mechano Receptors (C-LTMR), expressing the chemokine TAFA4, were identified as modulators of pain. However, mechanisms underlying the control of sensori-nociceptive integration by TAFA4 remains poorly understood. Using in vitro patch clamp recording on spinal cord slices of naïve mice we show that, bath application of TAFA4 induces a decrease in frequency of spontaneous excitatory post synaptic currents (EPSCs). This effect is mirrored by an increase in frequency of spontaneous inhibitory synaptic events (IPSCs). This modulation of synaptic activity is preserved with TTX, indicating that TAFA4 alters synaptic transmission through presynaptic mechanisms. By recruiting high threshold nociceptive fibers, we demonstrate that TAFA4 induces an increase in the paired pulse ratio of evoked synaptic responses in interneurons, and thus, reinforces presynaptic inhibition of nociceptive fibers. We also demonstrate that the effects of TAFA4 on spontaneous and evoked excitatory transmission are blocked by antagonists of GABA receptors, indicating that -C-LTMRs mainly interact with GABAergic neurons. Moreover, Electron Microscopy provides evidence of direct synaptic contacts between C-LTMRs and GABAergic terminals in lamina IIi. To further characterize the effects of TAFA4 on pain transmission, we inflamed mice using Complete Freund Adjuvant (CFA). In CFA mice, the effect of TAFA4 on EPSC and IPSC frequency is preserved. We find that in CFA mice, TAFA4 decreases the neuronal discharge recorded in vivo following a nociceptive mechanical stimulation in inflamed hindpaw. This effect is blocked by an injection of GABA receptors antagonists. By performing Von Frey test on inflamed mice, we show that intrathecal injection of TAFA4 provides anti-allodynic effects blocked by GABA receptors antagonists. We propose that C-LTMR directly contact GABAergic interneurons in dorsal horn, and, through the liberation of TAFA4 reinforce inhibitory synaptic activity which may in turn promote their anti-nociceptive activity. Furthermore, TAFA4 promotes microglial retraction in CFA inflamed animals, together with an increase in the number of inhibitory synapses on lamina IIi somata. Altogether, these results identify GABAergic interneurons as the first integration relay for C-LTMRs and highlight a novel interplay between sensory neurons, microglial cells and spinal interneurons leading to a fine tuning of inhibitory activity and nociceptive transmission in pathological conditions.

De récentes études ont démontré la pertinence de la quantification par IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) de la fraction de graisse, des temps de relaxation T1 et T2* de l’eau et des lipides, de la diffusion et de la perfusion dans la moelle osseuse, ces paramètres pouvant être utilisés en tant que biomarqueurs dans le cadre de pathologies affectant la moelle osseuse, telles que le myélome ou l'ostéoporose. La quantification de ces paramètres requiert cependant l'application de séquences IRM présentant des artéfacts spécifiques et dont les temps d'acquisition provoquent une immobilisation prolongée des patients. Ce travail de thèse porte sur la quantification de biomarqueurs dans le cadre de l’exploration de la moelle osseuse par IRM. L'objectif de ce travail de thèse était d'optimiser la quantification de ces biomarqueurs (fraction de graisse, T1, T2*, diffusion et perfusion) via l'optimisation de protocoles d'imagerie compatibles avec la pratique clinique, spécifiquement pour l'imagerie eau-graisse et l'imagerie de diffusion. Cette optimisation a consisté à prendre en compte les artéfacts inhérents aux techniques de quantification, les imperfections de l'instrument et à améliorer le rapport signal-sur-bruit par unité de temps des séquences IRM pour une application sur la moelle osseuse. La première partie de ce travail de thèse a porté sur le développement d’un protocole d’imagerie rapide, permettant la quantification simultanée de la fraction de graisse et des temps de relaxation T1 et T2* de l'eau et des lipides à partir de séquences eau-graisse. Dans un premier temps, cette méthode de quantification a été validée cliniquement par application à une population de volontaires, dans le cadre d'une étude réalisée au CHU de Rennes. Au cours d’une seconde étude sur volontaires, cette méthode de quantification a été appliquée à différents sites de moelle osseuse (humérus, sternum, vertèbres lombaires ilium et fémur), ce qui a permis de mettre en évidence des variations régionales de ces paramètres ainsi que la présence d'une corrélation négative entre le T1 de l'eau et la fraction de graisse. L’équation du signal utilisée dans cette méthode de quantification fait intervenir l'angle de basculement appliqué dans la séquence eau-graisse. Dans le but d’estimer l’influence de la variation de l’angle de basculement sur la mesure des paramètres, une méthode de quantification de l'angle de basculement spécialement adaptée à l'imagerie du rachis a également été développée au cours de ce travail.La seconde partie de ce travail de thèse a porté sur la quantification de la diffusion et de la perfusion dans la moelle osseuse, avec notamment l’imagerie des mouvements intra-voxels incohérents (IVIM). Ce travail a tout d’abord consisté à optimiser le protocole d’imagerie de diffusion pour une application au rachis lombaire, puis à étudier l'influence de la présence de graisse sur la quantification des paramètres de diffusion et de perfusion grâce à une étude sur volontaires. La perspective de ce travail est l'application des séquences eau-graisse et des séquences de diffusion optimisées à des populations atteintes de pathologies de la moelle osseuse, ces séquences permettant de réduire la durée d'immobilisation des patients et de détecter les modifications spécifiques à ces pathologies. / Recently published studies have shown the relevance of quantifying the bone marrow fat fraction, T1 and T2* relaxation times of water and lipid components, diffusion and perfusion with MRI (Magnetic Resonance Imaging). These parameters have indeed been used as biomarkers for bone marrow related pathologies, such as the myeloma and osteoporosis. The quantification of these parameters however requires the application of MR sequences which show specific artefacts and have long acquisition times that can be tiresome for older patients. The aim of this thesis was to optimise the quantification of the fat fraction, T1 and T2* relaxation times, diffusion and perfusion in the bone marrow. The quantification of these biomarkers was optimised by improving the imaging protocols of water-fat sequences and diffusion sequences for clinical applications. These sequences were optimised by taking into account the imperfections of the MR system and the specific artefacts of these techniques and by improving the signal-to-noise ratio per unit time of the sequences for an application on bone marrow. The first part of this work consisted in developing a fast quantification method that allows for the simultaneous quantification of the fat fraction and of the T1 and T2* relaxation times of water and lipids with water-fat sequences. This method was first clinically validated by applying these sequences in a population of healthy volunteers. In a second study, this method was applied in a population of healthy volunteers to different sites of bone marrow (humerus, sternum, vertebrae, ilium and femur). The results of this study showed local variations of these parameters and a strong negative correlation between the T1 of water and the fat fraction. The signal equation of this quantification method uses the flip angle applied in the water-fat sequence. In order to assess the influence of flip angle variations on the parameters measurement, a flip angle quantification method specially dedicated to spine imaging was also developed during this work. The second part of this work consisted in quantifying diffusion and perfusion in bone marrow, especially with the intra-voxel incoherent motion imaging (IVIM). The imaging protocol of the diffusion sequence was first optimised for a spine application; then the influence of fat on the quantification of diffusion and perfusion parameters was assessed in a study on healthy volunteers. In the future, the optimised water-fat sequences and diffusion sequences will be applied to patients suffering from bone marrow pathologies. These sequences allow a decreased total acquisition time and the detection of pathology-specific modifications.

Les circuits neuronaux sous-tendant la locomotion requièrent d'intégrer à la fois des stimuli sensoriels et l'état physiologique. Cependant, la manière dont ces circuits fonctionnent pendant la locomotion active reste peu comprise. La larve de poisson zèbre est un organisme vertébré idéal pour étudier cette question de part son répertoire locomoteur simple et son accessibilité à la manipulation génétique. Dans le Chapitre 1, je décris le logiciel que nous avons développé afin de nous permettre de traquer les comportements et caractériser automatiquement les modules locomoteurs à haut débit. Les interneurones V2a sont des neurones excitateurs de la moelle épinière et du cerveau postérieur caractérisés par l'expression du facteur de transcription chx10. Afin de tester leur implication dans la locomotion, j'ai, dans le Chapitre 2, validé l'utilisation d'une toxine génétiquement encodée dans le but d'inhiber la population chx10 positive in vivo. Par analyse comportementale, enregistrements de locomotion fictive et imagerie calcique, nous avons montré que les V2as sont impliqués différemment dans la locomotion lente et rapide. Les neurones contactant le liquide céphalorachidien (NcLCRs) relaient des informations sensorielles aux circuits moteurs. Par ciblage génétique, imagerie calcique, pharmacologie et électrophysiologie, j'ai, dans le Chapitre 3, investigué le rôle de l'activité spontanée dans les NcLCRs. J'ai montré que l'ouverture de canaux PKD2L1 représentait une source intrinsèque d'activité spontanée dans les NcLCRs. Ces résultats offrent une meilleure compréhension de la manière dont les interactions dynamiques structurent les sorties locomotrices in vivo. / The neural networks that underlie locomotion are complex and require integration of sensory input and physiological state. However, how these networks function during active locomotion to incorporate sensory input from the environment and the internal state of the animal remains poorly understand. The zebrafish larva is an ideal vertebrate to study these questions thanks to its simple locomotor repertoire, transparency, and amenability to genetic manipulation. In Chapter 1, I describe a program to track behavior at high speeds and automatically characterize locomotor patterns in a high-throughput manner. V2a interneurons are excitatory interneurons in the spinal cord and hindbrain identified by the chx10 transcription factor. In Chapter 2, I validated the use of a genetically-encoded botulinum toxin to silence the chx10 population in vivo. Using fictive locomotor recordings and calcium imaging, I demonstrated that silencing V2as leads to decreased activity in primary motor neurons during fast swimming, corresponding to a lower swimming frequency in V2a-silenced larvae. Cerebrospinal fluid-contacting neurons (CSF-cNs) are intraspinal neurons that relay sensory information to motor circuits. CSF-cNs in diverse species express GABA and the transient receptor potential channel PKD2L1. In Chapter 3, I used genetic targeting, calcium imaging, pharmacology, and electrophysiology to investigate the role of spontaneous activity in CSF-cNs. I showed that single channel opening of PKD2L1 represents an intrinsic source of spontaneous activity in CSF-cNs. These tools and results will allow a more complete picture of how dynamic interactions shape locomotor output in vivo.

Comprendre les mécanismes mis en place au sein du système nerveux pour générer des répertoires locomoteurs complexes reste l'un des grands défis des neurosciences systémiques. Le travail présenté dans ce manuscrit vise à comprendre comment les neurones de la moelle épinière contribuent à la production et à la modulation de l'activité locomotrice. Pour répondre à ce problème, nous utilisons le poisson-zèbre comme organisme modèle et avons développé de nouvelles approches génétiques et optiques afin de disséquer l'architecture du circuit formé par une classe de neurones sensoriels de la moelle et qui est conservée chez tous les vertébrés. Ces neurones sont appelés les neurones au contact du liquide céphalo-rachidien (Nc-LCR) et nous proposons de sonder leur(s) fonction(s) in vivo. Ces neurones sensoriels forment une interface unique entre le liquide céphalo-rachidien et le réseau de neurones impliqué dans le contrôle du mouvement dans la moelle épinière. Cependant, leur diagramme de connectivité demeure complètement inconnu. Afin de comprendre comment ces " Nc-LCR ou CSF-cNs " modulent la locomotion chez les vertébrés, nous avons développé un projet combinant des approches génétiques, électrophysiologiques, d'imagerie, et d'analyse du comportement, afin de cartographier le circuit qu'elles forment avec les neurones de la moelle épinière. Nos résultats montrent que les CSF-cNs projettent sur de nombreux éléments du centre générateur de rythme de la moelle. Notre approche révèle également la capacité des CSF-cNs à moduler la locomotion selon l'état dans lequel se trouve l'animal, une propriété caractéristique des circuits proprioceptifs dans la moelle épinière. / Understanding how the central nervous system generates motor sequences, coordinates limbs and body orientation in an ever-changing environment, while adapting to sensory cues remains a central question in the field of systems neuroscience. The work presented here aims to understand how local sensory neurons in the spinal cord contribute to the production and/ or the modulation of locomotor activity. We focused our work on a conserved class of spinal sensory neurons termed cerebrospinal fluid contacting neurons (CSF-cNs). These neurons lie at the interface between the CSF and spinal interneurons controlling motor output and represent an interesting yet poorly understood sensorimotor loop in the vertebrate spinal cord. However, the connectivity of CSF-cNs remains completely uncharacterized. To understand how CSF-cNs modulate locomotion in vertebrates, we combined genetics, imaging, optogenetics, electrophysiology, and behavior analysis to map the functional connectivity of these sensory neurons and test their function in the zebrafish larva. Our results demonstrate that CSF-cNs target several elements thought to be part of the locomotor central pattern generator in zebrafish, including glutamatergic spinal neurons involved in slow and fast swimming. We show that CSF-cNs can modulate the duration and occurrence of spontaneous locomotor events in a state dependent manner and tune the frequency of evoked fast escape responses. Altogether our work dissecting sensorimotor integration in the spinal cord bridged single cell function in vivo to behavior in zebrafish and should contribute to a better understanding of the role of sensory feedback during locomotion in vertebrates.

Différentes études précédentes ont démontré que IL-1β et PKA peuvent réduire la transmission synaptique inhibitrice dans la LAMINA II de la moelle épinière, en contribuent de cette manière au développement de douleur chronique de tipe inflammatoire. Au niveau des sites post-synaptiques, les changements dans la transmission synaptique (par exemple suivant le relâchement de IL-1β ou après l’activation de PKA), reflètent donc des changements dans les propriétés et/ou dans le nombre des molécules présentes au niveau de la synapse. Au cours de mon doctorat, j’ai pu profiter des techniques basés sur l’imagerie des molécules uniques afin d’étudier les effets de PKA et IL-1β sur la dynamiques et le nombre absolu de GlyR dans les synapses de la moelle épinière. Mes résultats ont montré que PKA et Il-1β peuvent déplacer les GlyR des sites inhibitoires post-synaptiques ciblent différentes sous-unités α du récepteur de la glycine. Comme les sous-unités GlyRα ne se lient pas directement à la géphyrine, ces effets sont vraisemblablement le résultat d’un changement de conformation du GlyR dépendant de la sous-unité. Pendant mon projet, j’ai utilisé la technique de microscopie de super-résolution PALM pour développer une méthode pour déterminer la stœchiométrie des GlyR et le nombre absolu de récepteurs et des molécules d’échafaudage au niveau des synapse de la moelle épinière. Mes résultats décrivent que les GlyR se composent de 3 sous-unités α et de 2 sous-unités β, et proposent qu’une synapse de la moelle épinière contient en moyenne 80 GlyR et 250 molécules de géphyrine. Ces résultats sont essentiels pour mettre en relation l’ampleur des mécanismes de régulation et de plasticité agissant sur la transmission synaptique, avec les changements en nombre de molécules présentes dans les synapses de la moelle épinière. Sur la base de mes découvertes on pourra maintenant étudier les mécanismes structuraux impliqués dans la régulation de la fonction et la dynamique des GlyR dépendantes des sous-unités α que j’ai démontré. / IL-1β and PKA impair glycine receptor-mediated synaptic transmission in the lamina II of the spinal cord, contributing to the development of inflammatory types of chronic pain. At post-synaptic sites, the strength of synaptic transmission depends on the biophysical properties and on the absolute number of receptors expressed. Consequently, changes in synaptic transmission (i.e. following the release of IL-1β or the activation of PKA), reflect changes in the properties and/or number of molecules present at the synapse. During my PhD I have taken advantage of single-molecule based imaging techniques to study the effects of IL-1β and PKA on the dynamics and absolute numbers of GlyRs at spinal cord synapses.My results show for the first time that both Il-1β and PKA displace GlyRs from inhibitory post-synaptic sites, targeting different α-subunit of GlyRs. Specifically, IL-1β reduces GlyR α-containing receptors at spinal cord synapse, whereas PKA affects GlyR α3L subunit. Given that the GlyR α subunits do not bind to the gephyrin scaffold, these effects likely reflect an α-subunit dependent change in GlyR conformation that decreases the affinity of the GlyR subunits for gephryrin. Glycine receptors are composed of α- and β- subunits that assemble into heteropentameric complexes with an unclear stoichiometry. Using super resolution PALM microscopy I have developed a single-molecule counting approach to determine the stoichiometry of GlyRs and the absolute number of receptor and scaffold molecules at spinal cord synapses. According to my results GlyRs is composed by 3 α and 2 β-subunits, and an average spinal cord synapse contains around 80 GlyRs and 250 scaffold molecules. These data are fundamental to relate the magnitude of regulatory and plasticity mechanisms acting on glycinergic transmission, with quantitative changes in molecule numbers at spinal cord synapses. My research has shown how absolute quantitative approaches can help achieve a more detailed insight into the organization of complex molecular assemblies and their dynamic regulation.

Certaines observations suggèrent que les afférences méchano-sensorielles peuvent moduler l’activité des générateurs centraux du rythme locomoteur (ou Central Pattern Generators, CPGs). Cependant, il est impossible d’explorer les circuits neuronaux sous-jacents chez l’animal en mouvement à l’aide d’enregistrements électrophysiologiques lors d’expériences de locomotion dite « fictive ». Dans cette étude, nous avons enregistré de façon sélective et non-invasive les neurones moteurs et sensoriels dans la moelle épinière pendant la locomotion active en ciblant génétiquement le senseur bioluminescent GFP-Aequorin chez la larve de poisson zèbre. En utilisant l’imagerie calcique à l’échelle des neurones individuels, nous confirmons que les signaux de bioluminescence reflètent bien le recrutement différentiel des groupes de motoneurones spinaux durant la locomotion active. La diminution importante de ces signaux chez des animaux paralysés ou des mutants immobiles démontre que le retour méchano-sensoriel augmente le recrutement des motoneurones spinaux pendant la locomotion active. En accord avec cette observation, nous montrons que les neurones méchano-sensoriels spinaux sont en effet recrutés chez les animaux en mouvement, et que leur inhibition affecte les réflexes d’échappement chez des larves nageant librement. L’ensemble de ces résultats met en lumière la contribution du retour méchano-sensoriel sur la production locomotrice et les différences qui en résultent entre les locomotions active et fictive. / There is converging evidence that mechanosensory feedback modulates the activity of spinal central pattern generators underlying vertebrate locomotion. However, probing the underlying circuits in behaving animals is not possible in “fictive” locomotion electrophysiological recordings. Here, we achieve selective and non-invasive monitoring of spinal motor and sensory neurons during active locomotion by genetically targeting the bioluminescent sensor GFP-Aequorin in larval zebrafish. Using GCaMP imaging of individual neurons, we confirm that bioluminescence signals reflect the differential recruitment of motor pools during motion. Their significant reduction in paralyzed animals and immotile mutants demonstrates that mechanosensory feedback enhances the recruitment of spinal motor neurons during active locomotion. Accordingly, we show that spinal mechanosensory neurons are recruited in moving animals and that their silencing impairs escapes in freely behaving larvae. Altogether, these results shed light on the contribution of mechanosensory feedback to motor output and the resulting differences between active and fictive locomotion.

En état de douleur chronique, la sensibilisation centrale s’accompagne d’une modification de l’équilibre excitation/inhibition en faveur d’une excitation accrue de la corne dorsale de la moelle épinière. Cet équilibre implique des molécules d’adhérence telles que les neuroligines postsynaptiques (NLs). Dans une première partie de notre travail de thèse, nous avons étudié la régulation éventuelle de ces protéines dans un modèle de douleur neuropathique (Spinal Nerve Ligation, SNL) chez le rat. Nos données ont montré une surexpression inattendue de la NL2, généralement associée à l’inhibition, alors que l’expression de la NL1, généralement associée à l’excitation, ne change pas. Le blocage de l’expression de NL2 in vivo par application intrathécale de siRNA, a produit des effets anti-nociceptifs réversant de façon significative l’allodynie mécanique observée chez les rats SNL. L’étude ultérieure des partenaires pré- et postsynaptiques de NL2, a démontré une co-variation spécifique avec PSD95, une protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. De plus, une approche par co-immunoprécipitation a mis en évidence une augmentation significative des interactions protéiques NL2 /PSD95 chez les rats SNL. Enfin, cette association inhabituelle en condition neuropathique, est apparue liée à la surexpression spécifique de NL2(-), un variant d’épissage de NL2 normalement minoritaire en condition physiologique. La surexpression, l’augmentation d’association avec PSD95, et l’effet pro-nociceptif inattendu de la NL2 « inhibitrice » en condition de douleur neuropathique, indiquent une permutation fonctionnelle de la NL2 de l’inhibition vers l’excitation modifiant le rapport synaptique en faveur d’une excitation globale plus élevée dans la corne dorsale.Dans une deuxième partie du travail, nous avons exploré le rôle des molécules d’adhérence NLs dans la sensibilisation spinale associée à un autre type de douleur chronique, à savoir la douleur cancéreuse, sur un modèle de cancer de l’os chez le rat. L’étude de l’expression des NLs et de leurs partenaires, a montré une augmentation d’expression spécifique de la NL1 et de S-SCAM, une autre protéine d’échafaudage des synapses excitatrices. D’autre part, d’après la littérature, ce modèle se caractérise par une importante activation gliale dans les cornes dorsales de la moelle épinière, se traduisant notamment par une astrogliose massive. Cependant, nous avons montré que dans le modèle utilisé, il n’y avait aucune variation ni de marqueurs classiques de l’activation astrocytaire (GFAP, S100β), ni des marqueurs microgliaux (OX-42 et Iba1). Au contraire, tous ces paramètres étaient effectivement augmentés dans la corne dorsale ipsilatérale d’animaux neuropathiques. Ces résultats suggèrent que, contrairement à ce qui a été décrit précédemment, la douleur cancéreuse d’origine osseuse n’est pas nécessairement corrélée à une surexpression spinale des marqueurs de la glie réactive, tandis que la douleur neuropathique l’est.En conclusion, nos résultats obtenus dans le modèle de douleur cancéreuse montrent un phénotype concernant des molécules impliquées dans la formation, la spécification et la modulation des synapses, bien différent de celui que nous avons mis en évidence dans le modèle de douleur neuropathique. Nous montrons notamment dans les deux modèles, une implication bien distincte des molécules d’adhérence NLs et de la glie confortant les données de la littérature indiquant que ces deux grandes catégories de douleur chronique ont chacune une signature propre. De plus, nos résultats ouvrent la perspective d’identifier de nouveaux diagnostics et/ou de nouvelles possibilités thérapeutiques, en ciblant spécifiquement les NLs. / In chronic pain states, central sensitization is associated with a modification in the excitation/inhibition balance toward increased excitation in the spinal dorsal horn. This balance involves adhesion molecules such as the postsynaptic Neuroligins (NLs). In a first part of our thesis work, we investigated the putative regulation of these proteins in the Spinal Nerve Ligation (SNL) model of neuropathy in the rat. Our data showed an unexpected upregulation of NL2, usually associated to inhibition, whereas expression of NL1, usually associated to excitation, did not change. The in vivo expression blockade of NL2 by intrathecal injection of siRNAs, produced specific antinociceptive effects, significantly reversing the SNL-induced mechanical allodynia. Subsequent study of pre- and postsynaptic NL2 partners, demonstrated a specific co-variation with PSD95, a scaffolding protein of excitatory synapses. Moreover, a co-immunoprecipitation approach showed a significant increase of NL2/PSD95 protein interactions in SNL rats. Finally, this unusual association in neuropathic conditions, appeared to be linked to specific over-expression of NL2(-), a NL2 splice variant usually a minority in physiological conditions. Over-expression, increased association with PSD95, and unexpected pronociceptive effect of the “inhibitory” NL2 in neuropathic pain condition, suggest a functional shift of NL2 from inhibition to excitation changing the synaptic ratio toward higher overall excitation in the dorsal horn.In a second part of our work, we investigated the role of the NLs adhesion molecules in spinal sensitization associated with another type of chronic pain, namely cancer pain, using a rat model of bone cancer. The study of the expression of NLs and partners, showed a specific increase in the expression of NL1 and S-SCAM, another postsynaptic scaffolding protein at excitatory synapses. Moreover, according to the literature, this model is characterized by a strong glial activation in the spinal dorsal horn, identified especially by a massive astrogliosis. However, we showed that in the bone cancer model used, there was no variation, neither in the classical markers of astrocyte activation (GFAP, S100β), nor in microglial markers (OX-42 et Iba1). On the contrary, all these parameters did actually increase in the ipsilateral dorsal horn of SNL neuropathic rats. These results suggest that, at odd with what was previously described, bone cancer pain is not necessarily correlated with a spinal overexpression of markers of reactive glia, whereas neuropathic pain is.In conclusion, our results obtained with the cancer pain model, show that the molecules involved in the formation, specification and modulation of synapses, yield a phenotypes clearly different to the one evidenced in the model of neuropathic pain. More particularly, we show in the two models, a well distinct involvement of the NL adhesion molecules and of glia, reinforcing reports from the literature, which indicate that the two important categories of chronic pain, cancer and neuropathic, each have a peculiar signature. Moreover, our results raise the possibility that new diagnosis and/or new therapeutic possibilities may emerge from targeting NL expression

Les progéniteurs hématopoïétiques se différencient dans la moelle osseuse, au contact des cellules stromales, indispensables pour leur survie. Lors de la lymphopoïèse B, les progéniteurs se différencient suivant plusieurs étapes successives en cellules pro-B, pré-BI, pré-BII, puis B immatures, au cours desquelles se mettent en place les réarrangements des gènes codant pour les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines. Les cellules pré-BII, qui expriment le récepteur pré-B (pré-BCR) à leur surface, constituent un point de contrôle essentiel lors du développement B. Le laboratoire a précédemment démontré que la galectine-1 (gal1), produite par les cellules stromales, fait un lien entre le pré-BCR et certaines intégrines afin de former une « synapse immunologique » entre les cellules pré-BII et les cellules stromales, conduisant ainsi à la relocalisation puis à l’activation du pré-BCR.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au rôle du stroma médullaire à l’étape des cellules pré-BII. Nous avons tout d’abord démontré l’importance de la formation de la synapse et des interactions entre les pré-BCR, les intégrines et la gal1 pour la prolifération et la différenciation des cellules pré-B in vivo. Enfin, nous avons caractérisé les cellules stromales de la moelle osseuse qui expriment la gal1. Ce travail a montré que la majorité des cellules pré-BII, au contraire des autres progéniteurs B, se situe au contact des cellules stromales gal1+, apportant pour la première fois la preuve de l’existence d’une niche stromale spécifique aux cellules pré-BII. / In the bone marrow, hematopoietic progenitors differentiate in close contact with stromal cells, essential for their survival. During B cell development, the progenitors differentiate through several sequential stages including pro-B cells, pre-BI cells, pre-BII cells and immature B cells, which allow setting up the rearrangements of genes encoding the immunoglobulin heavy and light chains. The expression of a functional pre-B cell receptor (pre-BCR) at the surface of the pre-BII cells represents a crucial checkpoint during B cell differentiation. The laboratory has previously demonstrated that the stromal cell-derived galectin-1 (gal1) is a link between the pre-BCR and certain integrins. This binding drives the pre-BCR in the pre-BII/stromal cell synapse, leading to the initiation of pre-BCR signaling.During my PhD, I have been interested in the role of stromal cells at the pre-BII cell stage. We first demonstrated the importance of synapse formation and the importance of the interactions between the pre-BCR, integrins and gal1 for the proliferation and differentiation of pre-BII cells in vivo. Finally, we characterized the bone marrow stromal cells which express gal1. This work showed that the majority of pre-BII cells, unlike other B cell progenitors, was in contact with gal1+ stromal cells, providing the first evidence of the existence of a specific stromal cell niche for the pre-BII cells.