The thesis deals with the study genetic diversity of poppies (Papaver somniferum L.) by SSR analysis. Altogether, 85 samples of poppies were evaluated. DNA was isolated from dried, mixed samples grown from seed using a modified CTAB method by Doyle and Doyle (1990). The seeds were provided by VÚO Opava. Six SSR primers were selected for the analysis and visualization was performed using chip electrophoresis. The PCR reaction was optimized with fluorescently labeled primer for fragmentation analysis. Chip electrophoresis was evaluated in MVSP using PCO analysis. The similarity matrix was further calculated and the samples showed hight genetic variability. The results of similarity matrix were provided to breeders as a basis for further breeding.

Genomic selection (GS) works by simultaneously selecting hundreds or thousands of markers covering the genome so that the majority of quantitative trait loci are in linkage disequilibrium (LD) with such markers. Thus, markers associated with QTLs, regardless of the significance of their effects, are used to explain the genetic variation of a trait. Simulation and empirical results have shown that genomic prediction presents sufficient accuracy to help success in breeding programs, in contrast to traditional phenotypic analysis. For this end, an important step addresses the use of statistical genetic models able to predict the phenotypic performance for important traits. Although some crops have benefited from this approach, studies in the genus Coffea are still in their infancy. Until now, there have been no studies of how predictive models work across populations and environments or, even, their performance for different complex traits. Therefore, the main objective of this research is investigating important aspects related to statistical modeling in order to enable a more comprehensive understanding of what makes a robust prediction model and, as consequence, apply it in practical breeding programs. Real data from two experimental populations of Coffea canephora, evaluated in two brazilian locations and SNPs identified by Genotyping-by-Sequencing (GBS) were considered to investigate the genotype-phenotype relationship. In terms of statistical modelling, two classes of models were considered: i) Mixed models, based on genomic relationship matrix to define the (co)variance between relatives (called GBLUP model); and ii) Multilocus association models, which thousands of markers are modeled simultaneously and the marker effects are summed, in order to compute the genetic merit of individuals. Both approaches were considered in separated chapters. Chapter entitled \"A mixed model to multiplicative harvest-location trial applied to genomic prediction in Coffea canephora\" addressed an expansion of the traditional GBLUP to accommodate interaction effects (Genotype × Local and Genotype × Harvest). For this end, we have tested appropriate (co)variance structures for modeling heterogeneity and correlation of genetic effects and residual effects. The proposed model, called MET.GBLUP, showed the best goodness of fit and higher predictive ability, when compared to other methods. Chapter in the sequence was entitled \"Comparison of statistical methods and reliability of genomic prediction in Coffea canephora population\" and addressed the use of different modelling assumptions considering multilocos association models. The usual assumption of marker effects drawn from a normal distribution was relaxed, in order to seek for a possible dependency between predictive performance and trait, conditional on the genetic architecture. Although the competitor models are conceptually different, a minimal difference in predictive accuracy was observed in the comparative analysis. In terms of computational demand, Bayesian models showed higher time of analysis. Results discussed in both chapters have supported the potential of genomic selection to reshape traditional breeding programs. In practice, compared to traditional phenotypic evaluation, it is expected to accelerate the breeding cycle in recurrent selection programs, maintain genetic diversity and increase the genetic gain per unit of time. / Seleção Genômica pode ser definida como a seleção simultânea de centenas ou milhares de marcadores moleculares, os quais cobrem o genoma de forma densa, de modo que locos de caracteres quantitativos (QTL) estejam em desequilíbrio de ligação com uma parte desses marcadores. Assim, marcadores associados a QTLs, independentemente da significância dos seus efeitos, são utilizados na predição do mérito genético de um indivíduo para um determinado caráter. Simulações e estudos empíricos mostram que essa abordagem apresenta acurácia suficiente para garantir o sucesso em programas de melhoramento genético, quando comparado com os métodos tradicionais de seleção fenotípica. Para tanto, uma das etapas requeridas é o uso de modelos genético-estatísticos que contemplem a predição fidedigna da performance fenotípica da população sob estudo. Apesar da relevância, o número de estudos no gênero Coffea ainda são reduzidos, não havendo relatos sobre o desempenho desses modelos em diferentes populações e ambientes, ou mesmo, a sua performance para diferentes caracteres agronômicos do cafeeiro. Dessa forma, este estudo tem como finalidade investigar aspectos relacionados a modelagem estatística, a fim de compreender quais são os fatores que tornam os modelos preditivos mais acurados e utiliza-los em programas aplicados de melhoramento genético. Dados reais de duas populações de seleção recorrente de Coffea canephora, avaliados em dois ambientes e genotipados pela tecnologia de genotipagem por sequenciamento (GBS, do inglês Genotyping-by-Sequencing) foram considerados para o estudo da relação entre genótipo-fenótipo. Em termos de modelagem estatística, duas classes de modelos foram considerados: i) Modelos mistos, baseados no cálculo da matriz de parentesco realizado como medida de (co)variância genética entre indivíduos (modelo GBLUP); e ii) Modelos de associação multilocos, no qual milhares de marcadores moleculares são modelados simultaneamente e os efeitos estimados dos marcadores são somados, a fim de computar o mérito genético dos indivíduos. Ambas estratégias foram descritas em capítulos separados no formato de artigo científico. O capítulo intitulado \"A mixed model to multiplicative harvest-location trial applied to genomic prediction in Coffea canephora\" abordou uma expansão do modelo GBLUP de modo a contemplar efeitos de interações entre Genótipo × Colheita e Genótipo × Local. Para tanto, apropriadas estruturas de variância e covariância para modelagem da heterogeneidade e correlação dos efeitos genéticos e residuais foram testadas. O modelo proposto, denominado de MET.GBLUP, apresentou melhor qualidade de ajuste e capacidade preditiva, quando comparado com outros métodos. O capítulo em sequência, intitulado de \"Comparison of statistical methods and reliability of genomic prediction in Coffea canephora population\" investigou a capacidade preditiva de diferentes modelos de associação multilocos. A suposição usual de efeitos dos marcadores amostrados de uma distribuição normal foi relaxada, a fim de testar métodos alternativos que pudessem melhor descrever o fenômeno biológico e, consequentemente, resultar em maior capacidade preditiva. Embora os modelos testados sejam conceitualmente distintos, diferenças mínimas nos valores de acurácia de predição foram observadas nos cenários testados. Em termos de demanda computacional, modelos Bayesianos apresentaram maior tempo de análise. Os resultados descritos em ambos os capítulos apoiam o potencial do uso da seleção genômica em programas de melhoramento assistido de café. Em termos práticos, comparado com métodos tradicionais de avaliação fenotípica, é esperado que a implementação desses conceitos em programas de seleção recorrente possam acelerar o ciclo de melhoramento, manter a diversidade genética e, sobretudo, aumentar o ganho genético por unidade de tempo.

Resumo: Os maracujazeiros pertencem à família Passifloraceae e ao gênero Passiflora, reunindo mais de 500 espécies distribuídas pelos trópicos, principalmente no Brasil, centro de origem de pelo menos um terço das espécies, o que determina uma grande variabilidade genética. Como maior produtor mundial da fruta, o Brasil tem cerca de 35 mil hectares de área colhida e produção superior a 317 mil toneladas por ano, no qual Bahia, São Paulo e Sergipe respondem por mais de 50% da produção no País. A avaliação da variabilidade presente é indispensável aos trabalhos de melhoramento genético, cuja caracterização molecular pode fornecer a base para estudos de diversidade, pautando-se na composição genética sem influência do ambiente. Marcadores moleculares fAFLP foram utilizados para estimar a diversidade genética entre 36 acessos de maracujá amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) coletados em 18 estados do Brasil. Os resultados obtidos permitiram concluir que os marcadores fAFLP se mostraram consistentes na verificação da variabilidade genética, detectando e quantificando a ampla divergência genética entre os 36 acessos de Passiflora edulis f. flavicarpa Deg. analisados, bem como a não formação de estruturação geográfica. Tais resultados podem auxiliar na definição de estratégias mais eficientes a serem utilizadas em programas de melhoramento genético de maracujazeiro amarelo. / Abstract: Passion fruit trees belong to the Passionfloraceae family and to the Passiflora genus, gathering more than 500 species distributed over the tropics, mainly in Brazil, source of at least one third of the species, what determines a great genetic variability. As the world's biggest producing country, Brazil has around 35 thousand hectares of harvest area, and a production superior to 317 thousand tons per year from which Bahia, São Paulo and Sergipe are responsible for more than 50%. The assessment of the variability is essential to genetic breeding works, whose molecular characterization can provide us with the basis for studies on diversity, taking into account the genetic composition without environmental influence. fAFLP molecular markers were utilized to estimate genetic diversity among 36 yellow passion fruit accessions (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) colleted in 18 Brazilian states. The obtained results led to the conclusion that the fAFLP markers were consistent regarding to the evaluation of genetic variability, detecting and quantifying the ample genetic divergence among the 36 analyzed accessions, as well as to the no geographic structural formation. Such results can be useful to the definition of more efficient strategies to be applied in genetic breeding programs of yellow passion fruit tree. / Orientador: Carlos Ruggiero / Coorientadora: Eliana Gertrudes Macedo Lemos / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Cristina Petrarrolha Silva / Mestre

Orientador: Rogério Abdallah Curi / Resumo: Na raça Quarto de Milha de equinos (Equus caballus), diferentes objetivos de seleção levaram à formação de linhagens com distintas habilidades, entre as quais a de trabalho e a de corrida. A linhagem de trabalho destina-se às provas de caráter funcional, explorando habilidades como agilidade e obediência, características consideradas de grande importância no manejo do gado a campo. Os animais de corrida apresentam melhor desempenho em pistas de curtas distâncias do que qualquer outra raça de equinos. O objetivo deste estudo foi caracterizar, por meio da genotipagem de SNP em larga escala, o desequilíbrio de ligação (LD), calculado por r², nas linhagens de trabalho e de corrida de cavalos Quarto de Milha criados no Brasil. Também foi investigado o tamanho efetivo (Ne) das duas populações, bem como as suas estruturas e relações. Para tanto, foram utilizados 428 equinos Quarto de Milha, de ambos os sexos, registrados na associação Brasileira de criadores da raça (ABQM), sendo 68 da linhagem de trabalho e 360 da de corrida. Estes animais tiveram o sangue colhido no Jockey Club de Sorocaba (Sorocaba/SP) e em propriedades rurais localizadas em dezenas de cidades do interior do Estado de São Paulo. Cento e oitenta e oito animais, 68 da linhagem de trabalho e 120 da de corrida foram genotipados, no ano de 2011, utilizando arranjo de 54.602 SNP (54K). As demais amostras da linhagem de corrida (n = 240) foram genotipadas, no ano de 2015, com arranjo de 65.157 SNP (65K). Após a realizaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the Quarter Horse breed (Equus caballus), different selection objectives led to the formation of lineages with different abilities, including cutting and racing. The cutting line intended for functional tests, exploring skills such as agility and obedience, characteristics considered of great importance in the management of cattle. Racing animals perform better on runways short distances than any other horse breed. The objective of this study was to characterize, by means of large-scale SNP genotyping, the linkage disequilibrium (LD), calculated by r², in the cutting and racing lines of Quarter Horses created in Brazil. The effective size (Ne) of the two populations was investigated, as well as their structures and relationships. For that, 428 Quarter Horses of both sexes, registered in the Brazilian Association of Breeders (ABQM) were used, of which 68 were from the cutting line and 360 from the racing. These animals had blood collected at the Jockey Club of Sorocaba (Sorocaba/SP) and on rural properties located in dozens of cities in the interior of the São Paulo State. One hundred and eighty-eight animals, 68 of the cutting line and 120 of the racing were genotyped in the year 2011, using a 54,602 SNP array (54K). The other racing line samples (n = 240) were genotyped in 2015, with an array of 65,157 SNP (65K). After the imputation process, the number of informative SNP in the racing line was 55,114. Thus, for the subsequent genetic analyzes performed on the cutting and... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Leguminosas do gênero Stylosanthes são amplamente utilizadas na pecuária Brasileira e por sua alta qualidade nutricional são importantes para pastagens em consorcio com gramíneas. Um dos materiais mais cultivados é o denominado Campo Grande, lançado pela EMBRAPA Gado de Corte e formado pela mistura das espécies Stylosanthes capitata Vog. (80%) e Stylosanthes macrocephala M.B Ferreira et Sousa Costa (20%). De ambas as espécies que formam essa mistura, a espécie S. capitata vem sendo utilizada na pesquisa do Projeto Temático FAPESP Nº 08/58075-8 Experimentos FACE para analisar os efeitos do elevado CO e do aquecimento sobre a fotossíntese, expressão gênica, bioquímica, crescimento, dinâmica de nutrientes e produtividade de duas espécies forrageiras tropicais contrastantes que tem por objetivo determinar os efeitos do elevado nível de CO2 e do aquecimento nas espécies forrageiras S. capitata e Panicum maximum crescendo em consorcio. Antes do plantio, foi observado que o lote de sementes de S. capitata, enviadas gentilmente pela EMBRAPA Gado de Corte, apresentava sementes de diversa coloração desde amarelas, vermelhas até pretas. Em vista que a análise da expressão gênica das plantas submetidas aos tratamentos de CO2 e temperatura é um dos objetivos do projeto, surgiu a necessidade de fazer uma avaliação mais rigorosa das sementes a fim de determinar a pureza genética do lote de sementes de S. capitata, assim como determinar a presença de possíveis contaminações com S. macrocephala. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar a pureza genética de plantas da espécie S. capitata em comparação a S. macrocephala, selecionando e utilizando marcadores moleculares ideais para essa análise. Para a etapa de seleção dos marcadores, foram plantadas separadamente as sementes de diferentes cores de cada uma das espécies S. capitata e S. macrocephala. Depois de germinadas, o DNA das folhas foi extraído e analisado com os três tipos de marcadores moleculares disponíveis, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) e ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat polymorphic DNA). Os marcadores moleculares RAPD (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) e ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) foram testados, dos quais os ISSR mostraram-se ideias, pois apresentaram claros perfis eletroforéticos diferenciando cada uma das espécies. Posteriormente à análise das sementes, foi realizada a análise de pureza genética de material vegetal de S. capitata plantado no campo para o referido projeto temático. Uma vez que S. macrocephala não foi objeto de pesquisa do projeto, sementes desta espécie foram plantadas separadamente em oito vasos, com vinte sementes cada. Após o crescimento das plantas, o DNA de folhas de ambas as espécies foi extraído e amplificado com os marcadores moleculares ISSR previamente selecionados. Através de análises estatísticas dos perfis de eletroforese, foi possível verificar que as sementes de diferentes cores pertencem à mesma espécie e que a diferente coloração estaria mais relacionada com o grau de amadurecimento das sementes do que com possíveis contaminações. No entanto, independentemente da cor, os lotes individuais de sementes de S. capitata e S. macrocephala apresentaram algum grau de contaminação. Assim, conclui-se que para a melhor caracterização da espécie em estudo e aumentar a confiabilidade das análises de expressão gênica diferencial é necessário avaliar a pureza genética de S. capitata usando marcadores moleculares. A análise da expressão gênica diferencial permitirá determinar os efeitos de elevada concentração de CO2 e da elevada temperatura a nível molecular nas plantas forrageiras em estudo. / Legumes of the genus Stylosanthes are widely used in Brazilian cattle and for their high nutritional quality are important in consortium with grasses. One of the most cultivated materials is called \"Campo Grande\" released by EMBRAPA Gado de Corte and formed by the mixture of species Stylosanthes capitata Vog. (80%) and Stylosantes macrocephala MB Ferreira et Sousa Costa (20%). Of both species forming this mixture, the species S. capitata has been used in research of the Thematic Project FAPESP No. 08/58075-8 \"FACE experiments to analyze the effects of elevated CO and warming on photosynthesis, gene expression, biochemistry, growth, nutrient dynamics and productivity of two contrasting tropical forage species\" that aims to determine the effects of high levels of CO2 and warming on forage species S. capitata and Panicum maximum growing in consortium. Before planting, it was observed that the lot of seeds of S. capitata, kindly sent by EMBRAPA, presented seeds of different coloration from yellow, red to black. Given that the analysis of gene expression in plants exposed to elevated CO2 and warming is one of the major objectives, we decided to make a more accurate assessment of the seeds in order to determine the genetic purity of the seeds of S. capitata, as well as determine the presence of possible contamination with S. macrocephala. Therefore, this study aimed to evaluate the genetic purity of the species S. capitata plants compared to S. macrocephala, selecting and using ideal molecular marker for this analysis. For the selection of markers, were separately planted in pots the seeds of different colors of each of the species S. capitata and S. macrocephala. Once germinated, DNA was extracted from leaves and analyzed with the three available types of molecular markers, RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat) and ISSR (Inter-simple sequence Repeat Polymorphic DNA). The RAPD molecular markers (OPB10), SSR (SC18-01B3, SC18-01E11, SC18-01TF11A) and ISSR (UBC1, UBC2, UBC834, UBC851, UBC862, UBC864, UBC885, UBC886) were tested, of which the ISSR were the selected, because they showed clear electrophoretic profiles differentiating each species. After the seed analysis, the analysis of genetic purity of plant material of S. capitata planted in the field for the thematic project was held. Once S. macrocephala was not the object of the research project, seeds of this species were planted separately in eight pots, with twenty seeds each. After the growth of plants, DNA from leaves of both species was extracted and amplified with the preselected molecular ISSR. Through statistical analysis of electrophoretic profiles, we found that seeds of different colors belong to the same species and the different coloring would be more related to the degree of ripening of seeds than with possible contamination. However, regardless of color, individual seed lots of S. capitata and S. macrocephala showed contamination. Thus, it is concluded that for better characterization of this species and increase the reliability of the analysis of differential gene expression is necessary to assess the genetic purity of S. capitata using molecular markers. The analysis of differential gene expression will determine the effects of elevated CO2 concentration and high temperature at the molecular level in forage plants under study.

O I. multifiliis é um protozoário ciliado que acomete diferentes espécies de peixes, causador da ictiofitiriase, responsável por altas taxas de mortalidade em pisciculturas e resultando em perdas econômicas. O presente estudo avaliou isolados do parasito oriundos de peixes capturados em seis estados brasileiros, utilizando como marcadores moleculares ribossomais os genes 18S, 5.8S e 28S e os espaçadores intergênicos ITS1 e ITS2 de I. multifiliis, obtidos através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e posteriormente, sequenciados. Primers específicos foram desenhados para este estudo. As sequências dos isolados de I. multifiliis encontrados infectando diferentes hospedeiros em diferentes estados brasileiros apresentaram grande similaridade e homologia, sendo muito conservadas e, por este fato, não permitem diferenciação entre isolados deste parasito. Sequências do DNA de isolados de I. multifiliis de diferentes regiões brasileiras foram depositadas no GenBank e representam as primeiras informações para esta espécie no Brasil. / The I. multifiliis is a ciliate protozoan that affects fishes of different species, which causes Ichthyophthiriasis. This disease is responsible for high mortality in fish farms resulting in economic losses. The present study evaluated parasite isolates from four Brazilian states, using nuclear ribosomal molecular makers for 18S,5.8S and 28S genes and the first and second internal transcribed ITS1 and ITS2 intergenic spacers from I. multifiliis. All the markers were evaluated through Polymerase Chain Reaction (PCR) and rDNA sequenced, using novel specific primers; the sequences of different isolated of I. multifiliis, which were collected from different fish species (host) from different Brazilian regions showed high similarity and homology, which were extremely conserved therefore it was not possible to differentiate among the strains from this parasite. All recovered sequences from this study were deposited in GenBank database. These sequences represent a novel contribution for Brazilian isolate of I. multifiliis.

The use of stem cells is a promising therapeutic approach for tissue engineering by their ability to boost tissue regeneration, and to model in vitro human genetics disorders since it provides continuous supplies of cells with differentiation potential. Our study has been focused in the identification of molecules or mechanisms that could contribute to a better osteogenesis in mesenchymal stem cells (MSC). To achieve our goals we have explored the osteopontential differences of stem cells from different sources. In this regard, we have observed that MSCs from human exfoliated deciduous teeth (SHED) presented higher in vitro osteogenic differentiation potential (OD) as compared to MSCs derived from human adipose tissue (hASCs). Through microarray analysis and cell sorting, we have shown that IGF2 and CD105 expression levels contribute to these osteopontential cell differences, that is, higher IGF2 expression levels and lower CD105 expression levels were associated with the increased osteogenic potential of SHED as compared to hASCs. The molecular mechanisms associated with the diferent expression levels of IGF2 and CD105 in these cells were also investigated. Despite the advantages of adult MSCs they can exhibit drawbacks such as restricted self-renewal and limited cell amounts. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) technology has emerged as an alternative cell source, as they provide more homogeneous cellular populations with prolonged self-renewal and higher plasticity. We verified that the OD of MSC-like iPSC differs from MSCs and it depends on the iPSCs originating cellular source. Comparative in vitro osteogenesis analysis showed higher osteogenic potential in MSC-like cells derived from iPS-SHED when compared with MSC-like cells from iPS-FIB and SHED. iPSCs can be also used as a tool to model genetic disorders. We have thus proposed to verify if it could be possible to in vitro model Treacher-Collins syndrome, a condition with deficient craniofacial bone development. We have compared the effects of pathogenic mutations in TCOF1 gene in cell proliferation, differentiation potential between MSCs, dermal fibroblasts, neural-crest like and MSC-like cells differentiated from iPSCs.TCS cells showed changes in cell properties anddysregulated expression of chondrogenesis markers during osteogenic and chondrogenic differentiation. In summary, the comparative analysis of stem cells of different sources allow us to identify markers that may facilitate osteogenesis and that it is possible to establish an in vitro model to Treacher-Collins syndrome / O uso de células-tronco trata-se de uma abordagem terapêutica promissora para a engenharia de tecidos, devido à sua capacidade na regeneração de tecidos, e para modelamento in vitro de distúrbios genéticos humanos, uma vez que fornece um abastecimento contínuo de células com potencial de diferenciação. Nosso estudo se propos a identificar moléculas e mecanismos que contribuem na otimização da osteogênese de células-tronco mesenquimais (MSCs). Para atingir nossos objetivos exploramos as diferenças no potencial osteogênico (PO) de MSCs de diferentes fontes. Observamos que MSCs de polpa de dente decíduo humano (SHED) apresentaram maior PO em comparação com as MSC derivadas de tecido adiposo humano (hASCs). Através de análise de microarray de expressão e cell sorting, demonstramos que os níveis de expressão de IGF2 e CD105 contribuem para as diferenças do PO, onde a maior expressão de IGF2 e menor expressão de CD105 estão associadas a maior PO em SHED quando comparado as hASCs. Também investigamos os mecanismos moleculares associados aos diferentes níveis de expressão de IGF2 E CD105 em ambas as fontes celulares. Apesar das vantagens, as MSCs podem apresentar pontos negativos como restrita auto-renovação e menor quantidade de células. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) surgem como uma fonte celular alternativa, proporcionando populações celulares homogêneas com auto-renovação prolongada e maior plasticidade. O PO de MSC-like iPSC difere de MSCs, e este potencial é dependente da fonte celular em que as iPSCs são obtidas. Análise comparativa de PO in vitro demonstrou maior osteogênse em células MSC-like derivadas de iPS-SHED quando comparada as células MSC-like de iPSCs-fibroblastos e SHED. iPSCs também podem ser utilizadas como ferramenta para investigar doenças genéticas humanas. Propomos a modelagem in vitro da síndrome de Treacher-Collins (TSC), doença que acomete as estruturas craniofaciais durante o desenvolvimento ósseo. Comparamos os efeitos de mutações patogênicas no gene TCOF1 na proliferação celular, potencial de diferenciação entre MSCs, fibroblastos dérmicos, neural-crest like e células MSC-like diferenciadas de iPSCs. Células de pacientes TCS exibiram alterações em propriedades celulares e na expressão de marcadores osteogênicos e condrogênicos. Em resumo, a análise comparativa de células-tronco de diferentes fontes permitiu a identificação de marcadores e mecanismos que podem facilitar a osteogênese e tambem demonstramos que é possível modelar in vitro a síndrome de Treacher-Collins

O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de utilização de marcadores moleculares em genes candidatos da calpaína (CAPN) e calpastatina (CAST) como ferramenta auxiliar para programas de melhoramento de características relacionadas ao crescimento e maciez da carne. Foram avaliados 605 bovinos da raça Nelore, pertencentes à Agropecuária CFM Ltda, com idade média ao abate de 24 meses. Após a extração do DNA de amostras de sangue, por desproteinização em presença de NaCl, a identificação e determinação do polimorfismo para os marcadores moleculares CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 e UOGACAST1, foi realizada pelo sistema de detecção TaqManTM utilizando-se PCR em Tempo Real. A análise de maciez da carne, aos 7, 14 e 21 dias de maturação, foi realizada com amostras de carne do Longissimus dorsi, retiradas entre a 12ª e 13ª costela e cisalhadas utilizando-se um Warner Bratzler Shear Force. Nenhum efeito significativo dos marcadores avaliados foi observado para as características de crescimento. Foi verificado efeito significativo, em relação à maciez da carne, para os seguintes polimorfismos: aos 7, 14 e 21 dias de maturação para o marcador CAPN4751; aos 21 dias para o marcador CAPN4753 e aos 14 e 21 dias para o marcador UOGCAST1. Em relação aos efeitos das combinações genotípicas para os marcadores dois a dois, os resultados foram significativos para a combinação CAPN4751/UOGCAST1 nos três tempos de maturação. Para a combinação de marcadores CAPN4753/UOGCAST1 também foram verificados resultados significativos para carnes maturadas aos 14 e 21 dias. Os resultados observados neste trabalho sugerem a possibilidade da utilização de seleção assistida por marcadores (MAS), visando o aumento da qualidade da carne em bovinos da raça Nelore. / The objective of this study was to evaluate the potential utilization of molecular markers on candidate calpain and calpastati n genes as an auxiliary tool for breeding programs on traits related to growth and meat tenderness. A total of 605 Nellore animals, raised by CFM Agro-pecuária Ltda, were used in this study and slaughtered with 24 months in average. After DNA blood samples extraction, by desproteinization in presence of NaCl, the polymorphism (CAPN316, CAPN530, CAPN4751, CAPN4753 and UOGACAST1) identification and determination was realized by TaqManTM detection system using real time PCR. The meat tenderness analysis, at the 7, 14 and 21 days of maturation was realized with Longissimus dorsi meat samples, taken at the 12th and 13th rib interval and Warner Bratzler Peak Shear Force measurements were used. There were no significant effects of molecular markers in growth traits. There were significant effects, regarding to meat tenderness, for following polymorphisms: at 7, 14 and 21 days of maturation, for CAPN4751 marker; at 21 days of maturation, for CAPN4753, and finally, at 14 and 21 days of maturation, for UOGCAST1 marker. In respect to genotypic combination effects analysis for pairwise marker, the results were significant for CAPN4751/UOGCAST1 in three days of maturation. In combination effects for CAPN4753/UOGCAST1 markers, significant effects were also observed for meat tenderness at 14 and 21 days. Theses results suggest that marked selection assisted (MAS) can be used to improve meat quality in Nellore beef cattle.

Apesar do grande desenvolvimento das biotecnologias da reprodução animal, como a produção in vitro de embriões (PIV), o diagnóstico genético pré-implantacional (PGD) ainda é aplicado com restrição na rotina da transferência de embriões em animais. Os recentes avanços da genômica têm permitido associar características fenotípicas com informações moleculares, possibilitando a realização da seleção assistida por marcadores moleculares. O objetivo do presente estudo foi de realizar o PGD de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP (BeadChip/6.909 SNP). A pequena quantidade de DNA genômico (gDNA) obtida na biópsia embrionária é a principal limitação para a análise de grande número de SNP. Dessa forma, a metodologia de amplificação total do genoma (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizada para aumentar a quantidade de gDNA da biópsia e permitir a análise de milhares de SNP simultaneamente. Foram utilizados 88 embriões bovinos PIV, submetidos à micromanipulação pela técnica de microaspiração, possibilitando a formação de 3 grupos com diferentes números de células biopsiadas: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) >100 - blastocisto eclodido (n=23). Todas as amostras foram submetidas ao mesmo protocolo de WGA e 4&micro;L de cada amostra foram utilizados para a genotipagem em plataforma iScan/Illumina. A qualidade dos genótipos foi avaliada pela análise do Call Rate (CR), 10o percentil do GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) e Alelle Drop Out (ADO). O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para investigar diferenças na distribuição das variáveis entre os grupos. O coeficiente de correlação de postos de Spearman revelou correlação significativa entre todas as variáveis. Os resultados apresentaram correlação positiva entre o CR e GC10 (0,99/P<0,001), enquanto as taxas de ADI e ADO apresentaram correlação negativa com o CR e CG10 (ADI/CR: - 0,87; ADI/GC10:-0,88; ADO/CR:-0,87; ADO/GC10:-0,86), com P<0,001 para todas as variáveis. O teste de Kruskal-Wallis apontou para diferença significativa em todas as variáveis analisadas (CR, GC10, ADI e ADO) entre os 3 grupos de biópsias (G1, G2 e G3). O CR médio foi de 59,26%, 78,47% e 95,97%, para G1, G2 e G3, respectivamente. Foi desenvolvido programa computacional (mendelFix) baseado na Lei da Segregação, para inferência dos genótipos não determinados baseado no genótipo do progenitores, aumentando o CR dos grupos 1, 2 e 3 para 79,69%, 88,20% e 97,28%, respectivamente. Os resultados do presente estudo permitem concluir que é possível realizar a genotipagem de embriões bovinos em plataforma de alta densidade de SNP com amostras submetidas ao protocolo WGA/MDA, mas o número de células obtidas na biópsia embrionária afeta a qualidade da genotipagem. A associação das biotecnologias descritas no presente trabalho permite a aplicação da seleção assistida por marcadores moleculares em embriões bovinos, contribuindo para acelerar ainda mais o processo de melhoramento genético animal. / Despite the great development of animal reproduction biotechnology, such as embryo in vitro production (IVP), preimplantation genetic diagnosis (PGD) is still applied with restraint in animals embryo transfer. Recent advances in genomics have associated phenotypic characteristics with molecular information, allowing the development of marker assisted selection. The aim of this study was to perform PGD in bovine embryos using high-throughput SNP platform (BeadChip/6,909 SNP). The small amount of genomic DNA (gDNA) obtained from embryo biopsy is the main limitation for the high-density SNP analysis. Thus, the Whole Genome Amplification (WGA) (Repli-g Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germany) was used to increase the amount of gDNA from embryo biopsy and allow the analysis of thousands SNP simultaneously. Eighty-eight IVP bovine embryos were subjected to micromanipulation by microaspiration, allowing the formation of three groups with different numbers of biopsied cells: G1) 5-10 (n=28); G2) 10-20 (n=37); G3) > 100 - hatched blastocyst (n = 23). All samples were subjected to the same WGA protocol, and 4&micro;L of each sample were used for genotyping on iScan/Illumina platform. The genotyping quality was assessed using the Call Rate (CR), 10th percentile GCScore (GC10), Alelle Drop In (ADI) and Alelle Drop Out (ADO). Kruskal-Wallis test was applied to investigate differences in the distribution of variables among groups. Spearman`s rank correlation coefficient revealed a significant correlation between all variables. The results showed a positive correlation between CR and GC10 (0.99/P <0.001), while ADI and ADO rates were negatively correlated with CR and CG10 (ADI/CR: -0.87; ADI/GC10: - 0.88; ADO/CR: -0.87; ADO/GC10: -0.86), P<0.001 for all variables. Kruskal Wallis pointed to significant differences in all variables (CR, GC10, ADO and ADI) among the 3 groups of biopsies (G1, G2 and G3). The CR average was 59.26%, 78.47% and 95.97% for G1, G2 and G3, respectively. Was developed a script (mendellFix) based on the \"Law of Segregation\", for inference of not determined genotypes based on the parents genotypes, thus increasing the CR of group 1, 2 and 3 to 79.69%, 88.20% and 97 28%, respectively. The results of this study show that it is possible to perform the genotyping of bovine embryos in highthroughput SNP platform with samples subjected to WGA/MDA protocol, but the number of cells obtained by embryo biopsy affects the quality of genotyping. The association of biotechnologies described in this work allows the application of marker-assisted selection in bovine embryo, contributing to further accelerate the process of animal breeding.

As serpentes que compõem o complexo Boa constrictor apresentam ampla distribuição por toda região Neotropical. A variação morfológica ligada à coloração e às localidades de origem fizeram com que, historicamente, fossem reconhecidas várias subespécies, embora sem consenso na literatura. Estudos prévios desenvolvidos com marcadores moleculares abordando aspectos filogenéticos e filogeográficos indicaram a existência de diversidade críptica em Boa. A fim de investigar as relações filogenéticas (empregando Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana), análises de tempo de divergência e delimitação de espécies (utilizando os métodos Poisson Tree Processes, PTP, e Generalized Mixed Yule Coalescent, GMYC), foram utilizadas sequências dos genes Cytb, ND4 e NTF3, e do íntron de ODC de 217 exemplares, com representantes de 10 subespécies. Os resultados filogenéticos recuperaram Boa como um gênero monofilético e apontaram nove linhagens. Somente as subespécies B. c. occidentalis, B. c. orophias e B. c. nebulosa foram recuperadas como monofiléticas. As análises de delimitação de espécies não recuperam o monofiletismo de Boa, sendo que em PTP foram recuperadas um mínimo de 15 (para o Sul) e máximo de 75 espécies putativas (EPs) e em GMYC foram recuperadas quatro EPs. A estimativa dos tempos de divergência revelou que essas linhagens passaram por um processo de diversificação no Plioceno e Pleistoceno. Esses resultados somados aos dados da literatura permitiram hipotetizar a existência de ao menos cinco linhagens distintas em Boa: B. constrictor (sensu stricto), B. occidentalis, B. imperator, B. orophias e B. nebulosa, cuja diversificação está ligada aos eventos climáticos ocorridos Quaternário e Neógeno eventos geológicos derivados do soerguimento dos Andes / Snakes of the complex Boa constrictor are widely distributed in the Neotropical region. Historically, based on morphological variation and locality of origin, several subspecies have been recognized, although there are controversies concerning the number of subspecies. Previous phylogenetic and phylogeographic studies using molecular markers suggested cryptic diversity in Boa. Sequences of Cytb, ND4, NTF3 and ODC of 217 samples, including ten subspecies were used in order to investigate phylogenetic relationships. In this sense, it was used Maximum Parsimony, Maximum Likelihood and Bayesian Inference. Additionally, molecular dating and species delimitation analyses (Poisson Tree Processes, PTP, and Generalized Mixed Yule Coalescent, GMYC) were performed. Phylogenetic studies recovered Boa as monophyletic and nine lineages. Also, B. c. occidentalis, B. c. orophias, and B. c. nebulosi were the only subspecies recovered as monophyletic. Species delimitation analyses did not show Boa as monophyletic: PTP recovered from 15 for the South to 75 putative species considering the whole distribution; GMYC recovered four putative species. Divergence time estimation revealed that lineages have diversified during Pliocene and Pleistocene. These results allowed us to hypothesize at least five distinct lineages: B. constrictor (sensu stricto), B. occidentalis, B. imperator, B. orophias and B. nebulosi, whose diversification is related to climatic events of Quaternary and geological events like uplift of Andes during Neogene