Desde os tempos antigos, o leite de papoula é usado como sedativo e poderoso analgésico. Hoje, na terapêutica, a morfina - a qual se encontra em grande proporção no leite da papoula - continua sendo utilizada como analgésico em casos de dor moderada e severa. Concomitantemente, drogas derivadas da morfina têm sido amplamente utilizadas; sendo a heroína uma das drogas com maior potencial viciante conhecido. <br /> O desenvolvimento de antagonistas do receptor alvo da morfina/heroína (receptor &mu;-opioide) pode auxiliar tanto no desenvolvimento de medicamentos analgésicos mais seguros e potentes, bem como no desenvolvimento de medicamentos que podem ter utilidade no tratamento da dependência por drogas opiáceas. <br /> Com o intuito de criar a relação entre a atividade biológica de um conjunto de 51 moléculas e sua respectiva ação antagonista ao receptor &mu;-opioide, foram selecionadas, da literatura, moléculas que apresentam interações biológicas contra o receptor &mu;-opioide. <br /> As moléculas selecionadas tiveram suas geometrias otimizadas e suas propriedades calculadas pelo método DFT/B3LYP, com um conjunto de funções de base 6-31g++(d,p). Os dados obtidos, como informações sobre a estrutura eletrônica, propriedades topológicas e físico-químicas, foram relacionados com os valores de pKi. Para a correta análise das variáveis que são úteis na descrição da atividade biológica, métodos de análise estatística como PCA, HCA, SIMCA e KNN foram utilizados, além do método de PLS para a construção do modelo matemático de relação entre atividade biológica e as variáveis. <br /> Os resultados mostram que variáveis como a energia do orbital LUMO, a quantidade de nitrogênios na cadeia da molécula, o volume de alguns substituintes e o valor das variáveis E1p e E3u (mensuradas respectivamente pela polarizabilidade molecular e peso atômico) têm grande relação com a atividade biológica. <br /> O modelo criado é útil na previsão da atividade biológica de outras moléculas, bem como ao fornecer ideias para uma síntese planejada de novos compostos com atividade antagonista promissora. / Since antiquity, the poppy\'s milk has been used as sedative and powerful analgesic. Nowadays, in the therapy, the morphine - that is found in large proportion in poppy\'s milk - is still being used as painkiller in cases of moderate and severe pain. Concurrently, drugs made from morphine have been widely used; being the heroin the drug with the highest known addictive potential. <br /> The development of the antagonists of the morphine/heroine target receptor (&mu;-opiate receptor) can help on more safety and powerful medicine developments, and also to develop medicines that can be useful in treating opiate drugs addiction. <br /> In order to create the relationship between biological activity of a set of 51 molecules and their respective antagonist action by &mu;-opiate receptor, was selected, from the literature, molecules that show biological interaction against &mu;-opiate receptor. <br /> The selected molecules had their geometries optimized and their properties calculated by DFT/B3LYP method, with a set of base functions 6-31g++(d,p). The data obtained, as information about the electronic structure, topological properties and physical-chemical, were related to the pKi values. To the correct analysis of the variables that are useful on the description of the biological activity, were used statistical analysis methods as PCA, HCA, SIMCA and KNN, other than the PLS method for building the mathematical model of relationship between the biological activity and the variables. <br /> The results show that variables as the energies of LUMO orbital, the quantity of nitrogen in the molecular chain, the volume of some substituents and the value of the variables E1p and E3u (measured respectively by molecular polarity and atomic weight) has big relationship with the biological activity. <br /> The created model is useful in biological activity prevision for other molecules, as well as providing ideas for a planned synthesis of new compounds with promissory antagonist activity.

A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada de alta prioridade nos programas de pesquisa e desenvolvimento da Organização Mundial da Saúde (OMS). Endêmica em 21 países da América Latina, a doença tem recentemente se tornado uma preocupação de saúde em outras regiões do planeta, como a América do Norte, Europa, Oceania e Ásia. Causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a doença de Chagas atinge 8-10 milhões de pessoas, de acordo com estimativas da OMS. Os únicos dois medicamentos disponíveis para o tratamento da doença são ineficazes e causam graves efeitos adversos. Este panorama tem evidenciado a urgência por novos agentes terapêuticos. O objetivo desta dissertação de mestrado é o desenvolvimento de modelos de relações quantitativas entre a estrutura e atividade (QSAR, na sigla inglesa para quantitative structure-activity relationships) para uma série de derivados piridínicos inspirados em um composto líder com potente ação anti-T. cruzi. Os modelos de QSAR foram gerados com os métodos holograma QSAR (HQSAR, na sigla inglesa para hologram QSAR); análise comparativa dos campos moleculares (CoMFA, na sigla inglesa comparative molecular field analysis); e análise comparativa dos índices de similaridade estrutural (CoMSIA, na sigla inglesa para comparative molecular similarity indices analysis). Os modelos identificaram as principais características estruturais que determinam a potência biológica destes compostos. Além disso, os modelos possuem alta consistência estatística e elevada capacidade de predição para novas moléculas. Os resultados apresentados revelam a utilidade dos modelos de QSAR no planejamento de novos antichagásicos mais potentes dentro da diversidade química explorada. / Chagas disease is a neglected tropical disease of high priority for the World Health Organization (WHO) drug discovery and development programs. Endemic in 21 countries in Latin America, the disease has recently become a public health problem in other regions of the planet, such as North America, Europe, Oceania and Asia. Caused by the parasite Trypanosoma cruzi, Chagas disease affects 8-10 million people worldwide, according to WHO. The only two available drugs are ineffective and cause serious side effects. These drawbacks have demonstrated the urgency for novel therapeutic agents. The main goal of this masters dissertation is the development of quantitative structure-activity relationships models (QSAR) for a series of pyridine derivatives having prominent activity against T. cruzi. The compounds were inspired in the structure of a lead compound with potent anti-T. cruzi action. The QSAR models were created using the methods hologram QSAR (HQSAR); comparative molecular field analysis (CoMFA); and comparative molecular similarity indices analysis (CoMSIA). The resulting models have identified key molecular features that determine the biological potency of the compounds. Furthermore, these models possess high statistical consistency and distinct ability to predict the potency of new molecules. The results reported reveal the usefulness of the developed QSAR models in the design of new antichagasic agents within this structural diversity.

Foi construído o modelo tridimensional da enzima gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi, o causador da doença de Chagas, usando técnicas computacionais de modelagem por homologia. O modelo foi comparado a enzima muscular homóloga de humanos quanto as diferenças no sitio de ligação do cofator NAD+. Sobre o modelo da enzima de T.cruzi foram construidas moléculas anaJogas ao grupo adenosina do cofator NAD+ como tentativa de se obter um inibidor seletivo a enzima do parasita e não efetivo quanto à enzima de humanos. Alguns dos compostos haviam sido ensaiados quanto à afinidade pela enzima análoga de Trypanosoma brucei. Foi escrito um programa de visualização gráfica de modelos moleculares que permite a análise dos parâmetros esteroquímicos com rapidez e simplicidade / The three-dimensional model of the glycossomal enzyme gliceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, was built using homology modeling computational techniques. The model was compared against the human muscle homologous enzyme with regard to the differences in the NAD+ binding site. Adenosine analogs were designed based on the model of the T.cruzi enzyme as an attempt to build selective inhibitors of the parasite enzyme with no activity against the human enzyme. Some of the compounds were previously tested for their affinity for the homologous enzyme from Trypanosoma brucei. A graphical program was written that allows the representation and analysis of stereo chemical parameters of molecular models with ease and speed

A busca de alternativas terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas é de grande importância, visto que atualmente existem apenas dois fármacos disponíveis, o benznidazol e o nifurtimox. Ambos apresentam efeitos adversos consideráveis, sendo utilizado, no Brasil, apenas o benznidazol. Compostos nitro-heterocíclicos com atividade frente ao Trypanosoma cruzi, agente causal da doença de Chagas, tem apresentado resultados promissores. Assim, este trabalho abrange o planejamento, síntese, identificação, avaliação da atividade anti-T. cruzi de 5-nitro furfurilidênicos (IC50 T. cruzi) e a citotoxicidade destes compostos frente a macrófagos de linhagem J774 (IC50 J774). A nifuroxazida, composto-protótipo, inspirou as modificações moleculares originando duas séries de compostos furfurilidênicos, uma com estrutura azometínica, série I, e outra com estrutura oxadiazolínica, série II. A escolha de substituintes foi baseada no diagrama de Craig, sendo selecionados dez substituintes para cada série. Foi avaliada a atividade dos vinte compostos planejados frente ao T. cruzi, dos quais os mais ativos foram: 4-butil-[N\'- (5-nitrofuran-2-il)metileno]benzidrazida (4g - IC50 T. cruzi = 1,05 &#181;M, DP = 0,07) e 3-Acetil-5-(4-butilfenil)-2-(5-nitrofuran-2-il)-2,3-di-idro-1,3,4-oxadiazol (5g - IC50 T. cruzi = 8,27 &#181;M, DP = 0,42). Comparados com os fármacos de referência, benznidazol (IC50 T. cruzi = 22,69 &#181;M, DP = 1,96) e nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3,78 &#181;M, DP = 0,10), o composto 4g demonstrou atividade anti-T. cruzi superior a ambos. Todos os compostos apresentaram atividade maior do que a nifuroxazida (IC50 T. cruzi = 120,46 &#181;M, DP = 4,06). Para os ensaios de citotoxicidade, obteve-se para o composto mais ativo frente ao T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28,05 &#181;M, DP = 1,05, e para o composto 5g, obteve-se IC50 J774 = > 400 &#181;M, o que representa que a concentração máxima avaliada deste composto não afetou as células. Ambos apresentaram boa seletividade ao efetuar a relação entre o IC50 J774 e o IC50 T. cruzi. Adicionalmente, foram realizados cálculos de propriedades físico-químicas das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (hierarchical clusters analysis - HCA) e análise de componentes principais (principal component analysis, PCA), possibilitando a identificação das propriedades que mais influenciam na atividade anti-T. cruzi nas séries dos compostos estudados. Os resultados indicaram uma forte influência das propriedades ClogP e momento dipolo, evidenciando a necessidade de um equilíbrio lipofílico/hidrofílico no planejamento de novas moléculas com ação anti-T. cruzi. / The search for alternative therapies for the treatment of Chagas disease presents great importance, since there are only two currently available drugs, nifurtimox and benznidazole. Both have considerable adverse effects and, in Brazil, is used only benznidazole. Nitro-heterocyclic compounds with activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, has shown promising results. Thus, this work includes the design, synthesis, identification, evaluation of anti-T. cruzi activity of 5-nitro-2- furfuriliden (IC50 T. cruzi) and cytotoxicity of these compounds against J774 macrophages cell line (IC50 J774). The nifuroxazide, as a lead compound, inspired the molecular modification leading to two series of furfuriliden compounds, a azometinic structure, series I, and other with oxadiazolinic structure, series II. The choice of substituents was based on the Craig\'s diagram, and ten substituents were selected for each series. We evaluated the activity of twenty compounds designed against T. cruzi, and the most active compounds were: 4-butyl-[N\'-(5-nitrofuran-2-yl) methylene] benzidrazide (4g - IC50 T. cruzi = 1.05 &#181;M, SD = 0.07) and 3-acetyl-5-(4-butylphenyl)-2 -(5-nitrofuran-2-yl)- 2,3-dihydro, 1,3,4-oxadiazole (5g - IC50 T. cruzi = 8.27 &#181;M, SD = 0.42). Compared to the reference drugs, benznidazole (IC50 T. cruzi = 22.69 &#181;M, SD = 1.96) and nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3.78 &#181;M, SD = 0.10), the compound 4g demonstrated anti-T. cruzi activity superior to both drugs. All compounds showed better activity than nifuroxazide (IC50 T. cruzi = 120.46 &#181;M, SD = 4.06). For cytotoxicity assays, was found for the most active compound against T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28.05 &#181;M, SD = 1.05, and for compound 5g was obtained IC50 J774 = >400 &#181;M, that represents the maximum concentration of the compound evaluated which did not affect the cells. Both showed good selectivity in the calculation of the ratio between the IC50 T. cruzi and IC50 J774. Additionally, we performed calculations of the physicochemical properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis including hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), which contributed to the identification of properties that influence the activity anti-T. cruzi in the series of compounds studied. The findings indicated a significant influence of ClogP and dipole moment properties, pointing out the need of a lipophilic/hydrophilic balance in the designing of novel anti-T. cruzi molecules.

Sistemas de transporte tipo ABC são responsáveis pelo transporte de uma grande variedade de substâncias dentre elas os oligopeptídeos e molibdato. Neste trabalho estudamos dois sistemas de transportadores do tipo ABC (mod, envolvido na captação de molibdato e o opp na capação de oligopeptídeos) presentes na bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). Em particular analisamos a organização genética dos óperons mod e as proteínas ModA e OppA, componentes solúveis localizados no periplasma e responsáveis pela ligação aos substratos. Por meio de técnicas de modelagem molecular, definimos modelos estruturais para as proteínas ModA e OppA. Para a proteína ModA caracterizamos cinco resíduos que compõem a cavidade ligadora e são responsáveis pelas interações com o íon molibdato, assim como a sua similaridade estrutural e sequencial com ortólogos de 3 grupos distintos de bactérias. Para a OppA, descrevemos o seu comportamento na ancoragem de diferentes oligopeptídeos. Avaliamos parâmetros como a extensão da cadeia e estabelecemos uma ordem crescente de afinidade entre os oligopeptídeos com diferente composição residual e a proteína OppA. / ABC transport system are responsable for the uptake of a large variety of substrates, including oligopeptides and molybdate. In this work we studied two ABC transporter systems (mod and opp responsable for molybdate and oligopeptide uptake, respectively) present in plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac). We investigated the genetic organization of mod operon and, particularly, structural feature of periplasmic components, ModA and OppA proteins, of the uptake systems. Using molecular modeling techniques, we defined the structural models of both ModA and OppA proteins. Based on the ModA structural model, amino acid residues involved in molybdate interaction were identified. In addition, both the structural and sequence similarities of Xac ModA and other bacterial orthologs with experimentally defined structural organizations were described. Based on the OppA structural model, we applied molecular docking tools to determine the binding specificity for different oligopeptide regarding number and amino acid composition. Collectively, our results represent an important contribution to the study of ABC transporters in an economically relevant phytopathogen bacterial species.

A busca de alternativas terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas é de grande importância, visto que atualmente existem apenas dois fármacos disponíveis, o benznidazol e o nifurtimox. Ambos apresentam efeitos adversos consideráveis, sendo utilizado, no Brasil, apenas o benznidazol. Compostos nitro-heterocíclicos com atividade frente ao Trypanosoma cruzi, agente causal da doença de Chagas, tem apresentado resultados promissores. Assim, este trabalho abrange o planejamento, síntese, identificação, avaliação da atividade anti-T. cruzi de 5-nitro furfurilidênicos (IC50 T. cruzi) e a citotoxicidade destes compostos frente a macrófagos de linhagem J774 (IC50 J774). A nifuroxazida, composto-protótipo, inspirou as modificações moleculares originando duas séries de compostos furfurilidênicos, uma com estrutura azometínica, série I, e outra com estrutura oxadiazolínica, série II. A escolha de substituintes foi baseada no diagrama de Craig, sendo selecionados dez substituintes para cada série. Foi avaliada a atividade dos vinte compostos planejados frente ao T. cruzi, dos quais os mais ativos foram: 4-butil-[N\'- (5-nitrofuran-2-il)metileno]benzidrazida (4g - IC50 T. cruzi = 1,05 &#181;M, DP = 0,07) e 3-Acetil-5-(4-butilfenil)-2-(5-nitrofuran-2-il)-2,3-di-idro-1,3,4-oxadiazol (5g - IC50 T. cruzi = 8,27 &#181;M, DP = 0,42). Comparados com os fármacos de referência, benznidazol (IC50 T. cruzi = 22,69 &#181;M, DP = 1,96) e nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3,78 &#181;M, DP = 0,10), o composto 4g demonstrou atividade anti-T. cruzi superior a ambos. Todos os compostos apresentaram atividade maior do que a nifuroxazida (IC50 T. cruzi = 120,46 &#181;M, DP = 4,06). Para os ensaios de citotoxicidade, obteve-se para o composto mais ativo frente ao T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28,05 &#181;M, DP = 1,05, e para o composto 5g, obteve-se IC50 J774 = > 400 &#181;M, o que representa que a concentração máxima avaliada deste composto não afetou as células. Ambos apresentaram boa seletividade ao efetuar a relação entre o IC50 J774 e o IC50 T. cruzi. Adicionalmente, foram realizados cálculos de propriedades físico-químicas das estruturas tridimensionais dos compostos, seguido pela análise exploratória de dados por análise de agrupamentos hierárquicos (hierarchical clusters analysis - HCA) e análise de componentes principais (principal component analysis, PCA), possibilitando a identificação das propriedades que mais influenciam na atividade anti-T. cruzi nas séries dos compostos estudados. Os resultados indicaram uma forte influência das propriedades ClogP e momento dipolo, evidenciando a necessidade de um equilíbrio lipofílico/hidrofílico no planejamento de novas moléculas com ação anti-T. cruzi. / The search for alternative therapies for the treatment of Chagas disease presents great importance, since there are only two currently available drugs, nifurtimox and benznidazole. Both have considerable adverse effects and, in Brazil, is used only benznidazole. Nitro-heterocyclic compounds with activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease, has shown promising results. Thus, this work includes the design, synthesis, identification, evaluation of anti-T. cruzi activity of 5-nitro-2- furfuriliden (IC50 T. cruzi) and cytotoxicity of these compounds against J774 macrophages cell line (IC50 J774). The nifuroxazide, as a lead compound, inspired the molecular modification leading to two series of furfuriliden compounds, a azometinic structure, series I, and other with oxadiazolinic structure, series II. The choice of substituents was based on the Craig\'s diagram, and ten substituents were selected for each series. We evaluated the activity of twenty compounds designed against T. cruzi, and the most active compounds were: 4-butyl-[N\'-(5-nitrofuran-2-yl) methylene] benzidrazide (4g - IC50 T. cruzi = 1.05 &#181;M, SD = 0.07) and 3-acetyl-5-(4-butylphenyl)-2 -(5-nitrofuran-2-yl)- 2,3-dihydro, 1,3,4-oxadiazole (5g - IC50 T. cruzi = 8.27 &#181;M, SD = 0.42). Compared to the reference drugs, benznidazole (IC50 T. cruzi = 22.69 &#181;M, SD = 1.96) and nifurtimox (IC50 T. cruzi = 3.78 &#181;M, SD = 0.10), the compound 4g demonstrated anti-T. cruzi activity superior to both drugs. All compounds showed better activity than nifuroxazide (IC50 T. cruzi = 120.46 &#181;M, SD = 4.06). For cytotoxicity assays, was found for the most active compound against T. cruzi, 4g, IC50 J774 = 28.05 &#181;M, SD = 1.05, and for compound 5g was obtained IC50 J774 = >400 &#181;M, that represents the maximum concentration of the compound evaluated which did not affect the cells. Both showed good selectivity in the calculation of the ratio between the IC50 T. cruzi and IC50 J774. Additionally, we performed calculations of the physicochemical properties of three-dimensional structures of the compounds, followed by exploratory data analysis including hierarchical cluster analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), which contributed to the identification of properties that influence the activity anti-T. cruzi in the series of compounds studied. The findings indicated a significant influence of ClogP and dipole moment properties, pointing out the need of a lipophilic/hydrophilic balance in the designing of novel anti-T. cruzi molecules.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-04-12T19:05:59Z No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-04-12T19:06:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T19:06:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_isabella_vfinal.pdf: 6145955 bytes, checksum: e3ed369e970ad7eb06b79a77ef921a9b (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) / Molecular docking is a methodology that aims to predict the binding modes and affinity of a small molecule within the binding site of the receptor target of interest. It is an approach widely used by the pharmaceutical industry and the academic community for identification and optimization of lead compounds, contributing to the reduction of cost, time and failures in the development of new drugs. Current docking methods and the associated scoring functions exhibit good performances in identifying experimental binding modes. However, the detection of active compounds among a decoy set of ligands and the accurate prediction of binding affinity remain challenging tasks. The DockThor program developed in our group has obtained promising results in comparative studies with other well established and widely used protein-ligand docking programs for predicting experimental binding modes. Despite useful for pose prediction, the current scoring function implemented in DockThor is not suitable for predicting binding affinities of protein-ligand complexes, obtaining no correlation with measured affinity data. In this work, we develop several scoring functions with physically-based features for predicting binding affinities of protein-ligand complexes trained with diverse machine learning techniques. The final scoring functions consist of force-field based terms related to the intermolecular interactions (electrostatic and van der Waals potentials), an original term for the ligand entropy (number of frozen rotatable bonds), ligand and protein desolvation and the hydrophobic effect. Then, we developed general and target-classes scoring functions, the last to account for binding characteristics associated with a target class of interest, focusing on proteases, kinases and protein-protein interactions complexes (PPIs). The scoring functions were derived using linear regression (MLR) and seven more advanced machine learning techniques for nonlinear problems. The training and testing were carried out using high-quality datasets composed of experimental structures of diverse protein-ligand complexes with binding affinities data available (Kd or Ki). Additionally, we also derived general scoring functions trained with redocking results from the DockThor program. The scoring functions trained with docking results obtained promising performances when evaluated in both experimental and docking structures, indicating that they are reliable to be used in real virtual screening experiments. The scoring functions developed in this work have demonstrated to be competitive with the best-evaluated linear and nonlinear scoring functions in benchmarking studies described in the literature. The scoring functions derived for specific classes of targets also exhibited promising performances, achieving great improvements when using nonlinear approaches compared to the linear models. Moreover, the consensus scoring strategy investigated in this work exhibited impressive results, ranking among the top-three models with the best predictive performances on all cases. The development of the scoring functions implemented in this thesis is a crucial step to make the DockThor an even more competitive program, enabling the development of the high-throughput virtual screening program and portal DockThor-VS. / Atracamento molecular é uma metodologia que tem por objetivo prever a conformação e a afinidade de uma pequena molécula no sítio de ligação do receptor alvo de interesse. É uma abordagem amplamente utilizada pela indústria farmacêutica e pela comunidade acadêmica para identificação e otimização de compostos líderes, contribuindo para a redução de custo, tempo e falhas no desenvolvimento de novos fármacos. As metodologias atuais de atracamento molecular e as funções de avaliação associadas possuem bom desempenho em identificar modos de ligação. Entretanto, a detecção de compostos ativos dentre inativos e a predição acurada da afinidade de ligação ainda são grandes desafios. O programa DockThor, desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, tem obtido resultados promissores em estudos comparativos com outros programas de atracamento molecular bem estabelecidos e amplamente utilizados pela comunidade científica para a predição de modos de ligação. Apesar de ser bastante útil para predição de poses, a função de avaliação atualmente implementada no DockThor não é adequada para prever afinidade de complexos proteína-ligante, não obtendo correlação com dados experimentais. Neste trabalho, nós desenvolvemos diversas funções de avaliação com características baseadas na física para prever afinidade de ligação de complexos proteína-ligante, treinadas com diversas técnicas de aprendizagem de máquina. As funções de avaliação finais consistem de termos baseados em campo de força relacionados com as interações intermoleculares (potenciais eletrostático e de van der Waals), um termo original para a entropia do ligante (número de ligações rotacionáveis congeladas), dessolvatação do ligante e da proteína e o efeito hidrofóbico. Desenvolvemos então funções de avaliação gerais e específicas para classes de alvos, esta para considerar características específicas associadas com a classe de alvo de interesse, focando em proteases, cinases e complexos de interações proteína-proteína (PPIs). As funções de avaliação foram derivadas utilizando regressão linear (MLR) e sete outras técnicas mais avançadas de aprendizagem de máquina para problemas não lineares. O processo de treinamento e teste foi realizado utilizando conjuntos de dados de alta qualidade compostos de estruturas experimentais de diversos complexos proteína-ligante com dados de afinidade de ligação disponíveis (Kd ou Ki). Adicionalmente, também derivamos funções de avaliação gerais treinadas com resultados do atracamento molecular com o programa DockThor. As funções treinadas com resultados de atracamento obtiveram desempenho promissor quando avaliadas tanto em estruturas experimentais quanto provenientes de atracamento molecular, indicando que elas são confiáveis para serem usadas em experimentos reais de triagem virtual. As funções desenvolvidas neste trabalho demonstraram ser competitivas com as melhores funções de avaliação lineares e não lineares em estudos comparativos descritas na literatura. As funções específicas para classes de alvos também exibiram desempenhos promissores, alcançando significativa melhoria quando utilizando abordagens não lineares comparadas com os modelos lineares. Além disso, a estratégia de avaliação consenso investigada neste trabalho exibiu resultados impressionantes, ficando entre os três melhores modelos com melhores desempenhos preditivos em todos os casos. O desenvolvimento das funções de avaliação implementadas nesta tese é um passo crucial para tornar o programa DockThor ainda mais competitivo, possibilitando o desenvolvimento do programa e do portal de triagem virtual em larga escala DockThor-VS.

Submitted by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:17:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Cristina (library@lncc.br) on 2017-05-04T13:18:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T13:18:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - LNCC - Pablo Ivan Pereira Ramos.pdf: 25881844 bytes, checksum: 3737e5c6b0b1a08ca20ed86f209a96d7 (MD5) Previous issue date: 2016-06-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) / The emergence of clinically important bacteria presenting a wide spectrum of antibiotic resistance represents a global concern. Although bacterial resistance was reported in the literature from the beggining of antibiotic use, early in the 20th century, we currently face the threat of pan-resistance, pathogens that can escape the action of all currently available antibiotic classes. A better understanding of virulence and resistance mechanisms, as well as new therapeutic options, are of paramount importance. This thesis proposal is based on the study of Klebsiella pneumoniae Kp13, a clinical isolate obtained in 2009 during a clonal outbreak in South Brazil which had its complete genome determined by our group. This strain is multidrug resistant and presents high-level resistance against polymyxin B (MIC 32 mg L􀀀1), a \last resort" drug for the treatment of Gram-negative multidrug-resistant bacteria. Using techniques from bioinformatics, transcriptomics (RNA-seq), systems biology and molecular modeling, we sought to better understand the gene expression response in K. pneumoniae in face of changes in abiotic characteristics and polymyxin B exposure. How these factors influence the metabolic repertoire of K. pneumoniae was also object of research. We also aimed to delineate a computational strategy for priorization of metabolic pathways that could serve as new targets for therapeuticals, by integrating expression, metabolic and structural reconstruction data. In parallel, this strategy was also applied to the study of Mycobacterium tubercluosis H37Rv (Mtb), the best characterized strain of this bacteria. E orts were made to study the metabolic complement of this pathogen, identifying important pathways related to its growth and correlating to molecular targets from a structural standview. The transcriptomic analyses allowed the identi cation of novel intracellular targets (such as ArcA-ArcB) that go beyond the \classic" e ect of polymyxin B mode of action, based in membrane interaction, besides drug-induced metabolic modulation which may lead to fermentative pathways of growth. The computational strategy for whole-genome target priorization led to the nding of pathways already known as druggable, such as S-methyl 5'-adenosin, as well as pathways not previously classi ed as druggable, but which could serve as candidates for future development of therapeutical compounds. / A emergência de isolados clínicos bacterianos apresentando resistência a uma ampla gama de medicamentos antibióticos representa uma preocupação global. Embora bactérias resistentes a alguns antibióticos já tenham sido relatadas na literatura médica desde o princípio do uso destas substâncias, no início do século XX, atualmente enfrentamos bactérias ditas panresistentes com capacidade de evadir à ação de todas as classes de drogas hoje disponíveis. O melhor entendimento dos mecanismos de resistência e virulência, bem como o delineamento de novas estratégias para o desenvolvimento de opções terapêuticas alternativas torna-se, portanto, imperativo. A presente proposta de tese de doutoramento tem como objeto de estudo central a bactéria Klebsiella pneumoniae Kp13, isolada no Sul do Brasil em 2009 na ocasião de um surto clonal e cujo genoma foi completamente determinado por nosso grupo. Esta cepa possui resistência multi-droga incluindo polimixina B (MIC > 32 mg L􀀀1), antibiótico considerado de último recurso no tratamento de patógenos Gram-negativos multi-resistentes. Utilizando técnicas de bioinformática, transcritômica (RNA-seq), biologia de sistemas e modelagem molecular, busca-se maior entendimento da resposta da ativação/desativação gênica de K. pneumonia frente a variações do meio e a exposição à polimixina B e como estes infuenciam no repertório metabólico exibido por esta bactéria. Ademais, objetiva-se delinear uma estratégia computacional para priorização de vias metabólicas servir como novos alvos terapêuticos para o controle deste importante patógeno, utilizando uma estratégia que integra os dados de expressão, metabólicos e da reconstrução estrutural. Em paralelo, esta estratégia foi também aplicada ao estudo de Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Mtb), a cepa mais bem caracterizada desta bactéria. Foi dado um foco no complemento metabólico de Mtb, realizando a reconstrução de vias metabólicas importantes ao seu crescimento, correlacionando-as com alvos proteicos do ponto de vista estrutural. A análise transcritômica permitiu identificar possíveis alvos intracelulares que vão além do efeito “clássico" de ação da polimixina, baseado em interação com a membrana externa, tais como o sistema ArcA-ArcB, al_em de modulação metabólica induzida pelo fármaco, levando ao crescimento fermentativo da bactéria. A priorização de alvos moleculares permitiu identificar vias reconhecidamente drogáveis, tais como o metabolismo de S-metil 5'-adenosina, além de vias anteriormente não identificadas como drogáveis, mas que poderiam servir como candidatos para o desenvolvimento de novos fármacos.

A melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos e farmacológicos aliados a métodos modernos de investigação tornaram possível a descoberta e o desenvolvimento de fármacos para diversas doenças e disfunções orgânicas em humanos. Os fármacos desenvolvidos atualmente são resultados de intensos esforços em pesquisa por equipes multidisciplinares, impactando diretamente na qualidade de vida das diversas populações no mundo. Nesse cenário, os grupos de pesquisas estabelecidos em Universidades com foco no planejamento de fármacos para doenças tropicais têm crescido. A Malária e a Doença de Chagas figuram com especial importância, a primeira pela expressiva mortalidade mundial, enquanto a segunda pela morbidade e seus impactos na população brasileira. O tratamento de ambas possui limitações que se agravam, seja pelo baixo número de opções terapêuticas, ou pelo desenvolvimento de cepas resistentes. As enzimas investigadas nesse doutoramento, enolase (PfEnolase) de Plasmodium falciparum e gliceraldeído3fosfato desidrogenase de Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), são componentes da via glicolítica destes parasitas e são considerados alvos moleculares atrativos para o desenvolvimento de inibidores enzimáticos, dada a importância destas enzimas no processo de obtenção de energia do parasita. Os estudos fundamentamse na busca por modulação seletiva da atividade biológica dos alvos selecionados através do desenvolvimento de novas moléculas bioativas. O estabelecimento de protocolo de expressão e purificação para enzima Pfenolase permitiu sua obtenção em quantidade e pureza suficiente para condução de estudos cinéticos e de triagem biológica, com a identificação de cinco novas classes químicas bastante promissoras; além de ensaios de cristalização, que culminaram na determinação da enzima em diversos complexos cristalográficos. Os dados estruturais produzidos foram fundamentais para condução da abordagem computacional de triagem virtual, que permitiu a identificação de 31 moléculas candidatas a inibidoras de Pfenolase. Avanços significativos foram obtidos também com a enzima TcGAPDH, destacando-se as adaptações nos processos de obtenção da proteína recombinante e ensaio cinético, condução de ensaio de bioprospecção orientada com a identificação e caracterização da molécula isolada (tilirosídeo). Novas condições de cristalização foram identificadas e poderão ser empregadas no processo de obtenção de complexos cristalográficos futuros. Adicionalmente, desenvolveu-se uma ferramenta computacional, Kinecteasy, para processamento automatizado dos dados produzidos das etapas de triagem biológica. Os trabalhos integrados de biologia estrutural e química medicinal desenvolvidos contribuem significativamente para o avanço no processo de planejamento de novos inibidores para as enzimas selecionadas. / A better understanding of the pathophysiological and pharmacological mechanisms together with the modern research methods made possible the discovery and development of drugs for several humans´ diseases. The drugs currently developed are the result of intense efforts in research of multidisciplinary teams having as a direct consequence a remarkable impact on life quality of populations all over the world. In this scenario, research groups established at universities, with their focus on drug development for tropical diseases, are increasing. Malaria and Chagas disease deserve special attention, the former by the expressive world mortality, while the second by the morbidity and its impact on Brazilian population. Treatment for both has limitations, whether by the low number of therapeutic options, or by development of resistance. The target enzymes for this PhD project, enolase (PfEnolase) of Plasmodium falciparum and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi (TcGAPDH), are essential components of glycolytic pathway and therefore related to the parasite energy production, thus, are considered attractive molecular targets for enzyme inhibitors development. Essentially, the proposed studies seek selective modulation of the target´s biological activity through the development of new bioactive molecules. The expression and purification protocols developed for Pfenolase have allowed us to obtain recombinant protein at suitable yield and purity for conducting screening assays, which has revealed five new chemical classes as Pfenolase inhibitors. Crystallization experiments were successfully conducted and 3D structure were determined for different complexes. Structural data was essential for performing the computational approach of virtual screening, which has allowed us to identify 31 inhibitor candidates for Pfenolase. Significant advances were obtained with TcGAPDH, highlighting the adaptations on recombinant protein protocol and kinetic assay. Assay-guided bioprospecting experiments were successfully performed with identification and characterization of isolated inhibitor (tiliroside). New crystallization conditions were identified and will be employed in future co-crystallization and soaking studies. Additionally, Kinecteasy, a computational tool, were developed for automated data processing of biological screening assays. The structure and medicinal chemistry studies presented here contribute significantly in the process of drug development for the selected enzymes.

Doenças negligenciadas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos. A exemplo destas encontram-se doenças como a leishmaniose e a doença de Chagas que representam relevantes problemas de saúde pública. As terapias disponíveis para estas doenças tropicais, contudo, estão longe de serem satisfatórias e eficazes, considerando-se que os quimioterápicos existentes apresentam reconhecida toxicidade, alto custo e eficácia moderada. Com o propósito de obter alternativas terapêuticas otimizadas, este projeto de pesquisa teve como objetivo a obtenção de pró-fármacos de compostos nitroderivados com comprovada atividade leishmanicida e antichagásica para serem utilizados em sistemas ADEPT visando maior eficácia e menor toxicidade no tratamento destas parasitoses. A princípio, duas frentes de trabalho em paralelo foram adotadas: uma teórica, para determinação do mecanismo catalítico da carboxipeptidase G2 (CPG2) e obtenção de informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos, e a outra sintética, para obtenção dos compostos propriamente ditos. Estudos teóricos de ancoramento e dinâmica molecular da CPG2 com um de seus reconhecidos substratos, o metotrexato, indicaram que o mecanismo de ação proposto para metaloproteases em geral também pode ser aplicado a esta enzima. Informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos também foram obtidas. A rota sintética inicialmente proposta para a obtenção dos pró-fármacos partia da ligação dos nitroderivados ao ácido glutâmico por intermédio de um agente espaçante, o ácido succínico. Com base nas informações obtidas nos estudos teóricos, entretanto, o projeto foi reformulado focando-se na síntese dos pró-fármacos sem agente espaçante, pois estes se mostraram mais favoráveis ao reconhecimento pela enzima. Com relação à síntese, a obtenção dos compostos planejados não foi alcançada a despeito dos esforços empreendidos. Estudos teóricos e experimentais de reatividade parecem comprovar a tese de que o grupo nitro desativa as funções nucleofílicas das estruturas dos nitrocompostos que seriam fundamentais para as reações de acoplamento ao transportador ácido glutâmico. Este achado, contudo, constitui um importante problema a ser solucionado, visto que nitroderivados parecem exercer suas atividades principalmente mediante redução do grupo nitro e produção de espécies reativas de oxigênio nas redondezas dos parasitas. / Neglected diseases affect millions of people around the world for the most part in underdeveloped countries. Leishmaniasis and Chagas disease are example of important public health problems spread through Africa, Asia and Latin America. Unfortunately, currently available chemotherapy to treat these diseases remains ineffective, being the most frequently applied drugs toxic, expensive and of moderate potency. By considering this actual picture and envisioning new therapeutic alternatives, the aim of this work was to design and synthesize potential antichagasic and antileishmanial prodrugs of nitroderivatives to be used in Antybody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a drug design approach which results in targeted delivery of the active compounds, increasing their potencies in addition to lowering their toxicity. Theoretical studies to determine the catalytic mechanism of the carboxypeptidase G2 (CPG2) and to obtain information about the cleavage mechanism of proposed prodrugs were performed whereas different synthetic approaches were made to obtain the compounds. Docking and molecular studies of the CPG2 considering theoretical interactions with its known substrate, methotrexate, indicated that the proposed general mechanism for metalloproteases could be indeed applied to this enzyme. Information about the cleavage mechanism of prodrugs was also obtained. Initially prodrugs proposed were composed by nitroderivatives structures attached to glutamic acid, the chosen transporter agent, by a spacer group, the succinic acid. Theoretical studies, however, had showed that prodrugs constructed without a spacer agent could be better recognized by the enzyme. These results re-directed the synthetic approach to new prodrug structure without spacer. Despite all efforts spent, it was impossible to obtain the proposed prodrug structures. Experimental reactivity studies were then accomplished, since it was possible that the nitro group, from nitroderivatives structure, was able to reduce the nucleophilic power of particular functional groups chosen to accomplish the coupling between the active compound and the transporter. The results corroborate this hypothesis and the absence of nitro group facilitates the prodrug synthesis. This, however, constitute an important problem to be solved since the nitroderivative seams to exert their function mainly by nitro group reduction and production of free radical species in the surrounding of the parasites.