El Centro de Conservación y Mejora de la Agrodiversidad (COMAV) de la Universidad Politécnica de Valencia alberga una de las colecciones más importantes de entradas del género Lycopersicon, incluyendo el tomate cultivado (Lycopersicon esculentum, L. esculentum var. cerasiforme) y sus especies silvestres relacionadas (L. cheesmanii, L. pimpinellifolium, L. hirsutum, L. pennellii, L. chmilewskii, L. parviflorum L. peruvianum y L. chilense). A pesar de ser el tomate una de las hortalizas de mayor importancia económica a nivel mundial, siguen existiendo ambigüedades en su taxonomía así como dudas sobre su domesticación. De hecho, se observan en muchas ocasiones formas intermedias entre el tomate cultivado y la variedad botánica cerasiforme, así como entre la forma cerasiforme y la especie L. pimpinellifolium. Igualmente se han detectado formas intermedias entre L. pimpinellifolium y la especie L. cheesmanii, endémica de las islas Galápagos. Estas especies constituyen el subgénero Eulycopersicon, interfértiles con el tomate cultivado. De ellas, la variedad botánica cerasifrome está considerada como el ancestro del tomate y se ha comprobado la existencia de fenómenos de introgresión entre L. pimpinellifolium y el tomate. Las teorías sobre la domesticación del tomate no son únicas, oponiéndose las teorías de Jenkins (1948) y Rick (1958) frente a las más recientes de Rick y Fobes (1975) y Rick y Holle (1990). Para contribuir a la clarificación de estos aspectos, en la presente Tesis Doctoral se persiguen los siguientes objetivos: 1.- Estudio de la variabilidad morfológica y molecular de estas especies 2.- Esclarecimiento de las relaciones filogenéticos entre las especies del subgénero Eulycopersicon. 3.- Establecimiento de estrategias de conservación de estas especies y en especial de Lycopersicon pimpinellifolium, para la que se han descrito diferencias importantes en el grado de alogamia. 4.- Inicio de la formación de una colección nuclear en la colección de entradas de L. pimpinellifolium del COMAV / Domingos, JP. (2003). Análisis de la variabilidad en las especies del subgénero Eulycopersicon más relacionadas con el tomate cultivado [Tesis doctoral]. Editorial Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10914

Dormancy is one of the most important adaptive mechanisms developed by perennial plants, in order to survive the low temperatures of autumn and winter in temperate climates. The study of the genes regulated during dormancy release is crucial to understand the process, with the final objective of the development of new varieties with a better adaptation to certain environments; in particular in the Mediterranean area. The general aim of this work is to understand the molecular and physiological mechanisms underlying the maintenance and release of seasonal dormancy in peach. The first part of this work is focused on the identification of peach genes related to dormancy release by suppression subtractive hybridization (SSH) and microarray hybridization. A significant number of genes identified in this work were homologous to ABA and drought related genes from other species. Our data contribute to highlight a prominent role of ABA in dormancy processes and also uncover elements of the ABA and drought regulatory response in peach, as an ABA-INSENSITIVE5 (ABI5) binding protein (AFP)-like, a dehydration-responsive element (DRE)-binding protein (DREB2C)-like, a calcium-binding annexin, and several genes regulated by stress signalling pathways. Other identified genes were also evaluated to assess the chilling requirement of cultivars by analysis of expression showing a very good correlation between the expression pattern of DAM5, together with other transcripts (BD396, DB247, SB280 and PpB63) and the chilling requirements values of five different varieties ('Big Top', 'Catherina', 'Fergold', 'Maruja' and 'Springlady') measured following Utah and Dynamic models. Furthermore, a study of chromatin modifications associated to dormancy release in the DAM6 gene is presented. A ChIP analysis of DAM6 promoter and structural gene revealed chromatin modification events similar to those observed in vernalization of Arabidopsis and cereals. / Leida, CA. (2012). Molecular aspects of dormancy in peach (Prunus persica [L.] Batsch.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15864

En esta tesis se han desarrollado diferentes dispositivos de liberación controlada, utilizando materiales híbridos, y su aplicación como puerta nanoscópica molecular. Se describe en primer lugar, un método de liberación controlada para la vitamina B2 o riboflavina (vitamina hidrosoluble necesaria para el metabolismo de los hidratos de carbono, grasas y especialmente en el metabolismo de las proteínas que participan en el transporte de oxígeno) a través del uso de puertas nanoscópicas moleculares preparadas mediante el anclaje de agrupaciones poliaminicas en la superficie externa de los poros de sólidos mesoporosos, que actúan como puerta molecular. El pH y la presencia de ciertos aniones van a controlar el estado abierto/cerrado de la puerta y van a permitir la liberación de la vitamina, la cual esta encapsulada en el interior de los poros. En medio ácido los grupos amino de la superficie se protonan adquiriendo cargas positivas y, como consecuencia, aparecen repulsiones electrostáticas que mantienen cerrada la puerta. A pH neutro, por la ausencia de repulsiones electrostáticas, la puerta se encuentra abierta, produciéndose la liberación de la vitamina. En segundo lugar, se describe el desarrollo, síntesis, caracterización y funcionamiento de un material mesoporoso. Este material esta cargado con un colorante y funcionalizado con un disacárido, que actúa como puerta nanoscópica molecular, el cual se abre en presencia de una enzima intestinal. El sólido esta formado por un material mesoporoso, MCM-41, cargado con el colorante [Ru(bipi)3]2+ y funcionalizado con un alcoxisilano derivado del disacárido lactosa. Debido al impedimento estérico que representa ese azúcar, la salida de los poros se encuentra bloqueada. La presencia en la disolución de una ß-D-galactosidasa capaz de hidrolizar el enlace O-glucosídico que une a los monosacáridos de la lactosa, es capaz de abrir los poros permitiendo así la liberación del colorante. En tercer lugar, se describe la síntesis de / Bernardos Bau, A. (2011). Desarrollo y síntesis de materiales híbridos, para la liberación controlada de moléculas bioactivas [Tesis doctoral]. Editorial Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/27151

[EN] The genus Crocus belonging to the family Iridaceae, is known for its cultivated species, saffron (Crocus sativus L.). The genus includes about 100 species, many of which are of interest as ornamentals for their products or secondary metabolism, and others are exclusively wild. On the whole, they are a source of genetic variability of enormous interest. The rapid disappearance of the culture of saffron in Europe due to the significant amount of manpower required, has led to significant genetic erosion. In order to slow down and improve this situation, several national and European programs for the collection, multiplication, and characterization of germplasm of saffron and related species were initiated. In this context, this Thesis aims to complete the existing collections and characterize the available germplasm of the Spanish wild species of the genus Crocus, conserved in the Plant Germplasm Bank of the Center for Research in Agroforestry in Albaladejito (Cuenca). Seven wild species of this genus can be found in Spain, which are both autumn flowering species (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus and C. cambessedesii) and spring flowering species (C. nevadensis, C. carpetanus and C. vernus), and in this work a morphological, physiological, biochemical and molecular characterization of them has been carried out. After a thorough review of the locations of these species in Spain, we have collected accessions from different locations in which their presence was described. We have developed location maps, and the description of the ecosystems these species inhabit. Of this set of accessions, a maximum of 60, which form a representation of the observed variability, were characterized morphologically. It should be noted that a microscopic characterization of the anatomy of the leaves and seed coat also identifies most species. A total of 115 accessions, representing different populations of each species collected, have been characterized phenologically. In addition, 1-2 accessions of each autumn flowering species, C. serotinus and C. nudiflorus (with hysterantia), and the spring-flowering species, C. nevadensis, C. carpetanus and C. vernus (this last species has the latter flowering date), have been characterized physiologically. We have studied the influence of temperature on the development of floral meristems in flowering, in the vegetative development, set and development of fruit and leaf senescence. These physiological studies have also allowed developing methods to break dormancy and germination, which allow a percentage of germination of the Spanish species of Crocus of around 81-95%. The biochemical characterization of 15 accessions belonging to 5 species of Spanish wild Crocus has revealed the lower content of crocins in its styles. Two of these species, C. carpetanus and C. nevadensis, have no crocins in the style. The analysis of the absence and presence of main peaks corresponding to crocins and flavonoids has enabled to separate each species which has crocins, but has provided no separation between C. nevadensis and C. carpetanus. The molecular characterization of 133 individuals, corresponding to 26 different accessions of the 7 species, using RAPDs, indicates that these markers can be a useful tool for differentiating species that share ecological niche, or with very similar vegetative morphological features. Microsatellite markers have proved to be a complementary tool for the distinction of materials which cannot be distinguished by the use of RAPDs. / [ES] El género Crocus perteneciente a la familia de las Iridáceas, es conocido por su especie cultivada, el azafrán (Crocus sativus L.). El género incluye aproximadamente 100 especies, muchas de las cuales tienen interés como ornamentales o por sus productos de metabolismo secundario, y otras son exclusivamente silvestres. En su conjunto, constituyen una fuente de variabilidad genética de enorme interés. La rápida desaparición del cultivo del azafrán en Europa, debido a la importante cantidad de mano de obra que requiere, ha conducido a una importante erosión genética. Con el fin de frenar y mejorar esta situación, se han iniciado varios programas de ámbito nacional y europeo para la recolección, multiplicación, y caracterización de germoplasma de azafrán y especies afines. En ese contexto, se enmarca esta Tesis que tiene como objetivo completar las colecciones existentes y caracterizar el germoplasma disponible de especies silvestres españolas del género Crocus, del Banco de Germoplasma Vegetal del Centro de Investigación Agroforestal de Albaladejito (Cuenca). En España pueden encontrarse 7 especies silvestres de este género, que son tanto de floración otoñal (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus y C. cambessedesii) como primaveral (C. nevadensis, C. carpetanus y C. vernus), y en este trabajo se ha llevado a cabo una caracterización morfológica, fisiológica, bioquímica y molecular de las mismas. Tras una revisión minuciosa de las citas sobre la localización de estas especies en España, se han conseguido entradas de distintas áreas de las zonas en las que se ha descrito su presencia. Se han elaborado mapas de localización, así como la descripción de los ecosistemas que habitan estas especies. De este conjunto de entradas, un máximo de 60, que configuran una representación de la variabilidad observada, fueron caracterizadas morfológicamente. Hay que destacar una caracterización microscópica de la anatomía de las hojas y de la cubierta de las semillas que permite también identificar la mayoría de las especies. Un total de 115 entradas, que representan las diferentes poblaciones recolectadas de cada especie, se han caracterizado fenológicamente. Asimismo, se han caracterizado fisiológicamente 1-2 entradas de las especies de floración otoñal C. serotinus y C. nudiflorus (con histerantia), y de tres especies de floración primaveral C. nevadensis, C. carpetanus y C. vernus (esta última con floración más tardía). Se ha estudiado la influencia de la temperatura en el desarrollo de los meristemos florales, en la floración, en el desarrollo vegetativo, el cuajado y desarrollo del fruto y sobre la senescencia de las hojas. Estos estudios fisiológicos también han permitido poner a punto métodos de rotura de latencia y germinación que permiten un porcentaje de germinación de entre un 81-95%. La caracterización bioquímica de 15 entradas correspondientes a 5 de las especies analizadas, ha revelado el menor contenido en crocinas de los estilos de estas especies silvestres, dándose la ausencia total de las mismas en C. carpetanus y C. nevadensis. El análisis de la ausencia y presencia de los principales picos que corresponden a crocinas y a flavonoides, ha permitido separar entre sí las especies que presentan crocinas, pero no ha facilitado la separación entre C. nevadensis y C. carpetanus. La caracterización molecular de 133 individuos que corresponden a 26 entradas diferentes mediante RAPD, indica que estos marcadores pueden ser una herramienta útil para la diferenciación de especies que comparten nicho ecológico, o con rasgos morfológicos vegetativos muy similares. Los marcadores microsatélites se han mostrado como una herramienta complementaria que permite la distinción de materiales que no es posible llevar a cabo mediante el empleo de marcadores tipo RAPD. / [CA] El gènere Crocus pertanyent a la família de les Iridaceae, és conegut per la seua espècie conreada, el safrà (Crocus sativus L.). El gènere inclou aproximadament 100 espècies, moltes de les quals tenen interès com a ornamentals o pels seus productes de metabolisme secundari, i altres són exclusivament silvestres. El seu conjunt, constitueix una font de variabilitat genètica d'enorme interès. La ràpida desaparició del cultiu del safrà a Europa, a causa de la important quantitat de mà d'obra que requereix, ha conduït a una important erosió genètica. Per tal de frenar i millorar aquesta situació, s'han iniciat diversos programes d'àmbit nacional i europeu per a la recol·lecció, multiplicació, i caracterització de germoplasma de safrà i espècies afins. En aquest context, s'emmarca aquesta Tesi que té com a objectiu completar les col·leccions existents i caracteritzar el germoplasma disponible d'espècies silvestres espanyoles del gènere Crocus, del Banco de Germoplasma Vegetal del Centro de Investigación Agroforestal de Albaladejito (Cuenca). A Espanya es poden trobar 7 espècies silvestres d'aquest gènere, que són tant de floració tardoral (C. serotinus, C. clusii, C. nudiflorus i C. cambessedesii) com primaveral (C. nevadensis, C. carpetanus i C. vernus), i en aquest treball s'ha dut a terme una caracterització morfològica, fisiològica, bioquímica i molecular de les mateixes. Després d'una revisió minuciosa de les cites sobre la localització d'aquestes espècies a Espanya, s'han aconseguit entrades de diferents àrees de les zones en què s'ha descrit la seua presència. S'han elaborat mapes de localització, així com la descripció dels ecosistemes que habiten aquestes espècies atenent: tipus de sòl, altitud, clima, comunitat vegetal i els estressos abiòtics o biòtics més freqüents. D'aquest conjunt d'entrades, un màxim de 60, que configuren una representació de la variabilitat observada, van ser caracteritzades morfològicament. Cal destacar una caracterització microscòpica de l'anatomia de les fulles i de la coberta de les llavors que permet també identificar la majoria de les espècies. Un total de 115 entrades, que representen les diferents poblacions recol·lectades de cada espècie, s'han caracteritzat fenológicament. Així mateix, s'han caracteritzat fisiològicament 1-2 entrades de les espècies de floració de tardor C. serotinus i C. nudiflorus (amb histerantia), i de tres espècies de floració primaveral C. nevadensis, C. carpetanus i C. vernus (aquesta última amb floració més tardana). S'ha estudiat la influència de la temperatura en el desenvolupament dels meristemes florals, en la floració, en el desenvolupament vegetatiu, el quallat i desenvolupament del fruit i sobre la senescència de les fulles. Aquests estudis fisiològics també han permès posar a punt mètodes de trencament de latència i germinació que permeten un percentatge de germinació de llavors de les espècies espanyoles de Crocus entre un 81-95%. La caracterització bioquímica de 15 entrades corresponents a 5 de les espècies analitzades, ha revelat el menor contingut en crocinas d'aquestes espècies silvestres, donant-se l'absència total de les mateixes en C. carpetanus i C. nevadensis. L'anàlisi de l'absència i presència dels principals pics que corresponen a crocinas i flavonoides, ha permès separar entre si les espècies que presenten crocinas, però no ha facilitat la separació entre C. nevadensis i C. carpetanus. La caracterització molecular de 133 individus que corresponen a 26 entrades diferents mitjançant RAPD, indica que aquests marcadors poden ser una eina útil per a la diferenciació d'espècies que comparteixen nínxol ecològic, o amb trets morfològics vegetatius molt similars. Els marcadors microsatèl·lits s'han mostrat com una eina complementària que permet la distinció de materials que no és possible dur a terme mitjançant l'ús de marcadors tipu / Pastor Férriz, MT. (2016). Caracterización fenológica, morfológica, fisiológica, fitoquímica, y molecular de las especies silvestres españolas del género Crocus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62827

Abstract Helicobacter pylori occupies a prominent position among emerging human pathogens, one of the most common causes of chronic bacterial infection in humanity and closely linked to peptic ulcers and gastric cancer. It has been suggested that H.pylori can be acquired by different routes of transmission, including water. The growing demand for water due to increasing world population and the concurrent expansion of the industry necessitates the use of treated wastewater. However, H. pylori resistance to water disinfection treatment constitutes a risk to health. Similarly, H.pylori has resilience to water purification treatments and at high concentrations of free chlorine in distribution systems by biofilm formation. The VBNC state of H.pylori in both matrices is the usual in stress conditions, necessitating the application of molecular techniques for detection and identification. In this thesis we have studied the presence and viability of this important pathogen in both wastewater and drinking water. A total of 60 wastewater samples, including samples of the biological reactor inlet, the outlet of this one and samples after tertiary ultraviolet disinfection treatment, were analyzed for the presence of H.pylori by PCR, q-PCR and FISH and the traditional cultivable technique. The FISH technique proved to be an effective and rapid method for the detection of H. pylori in waste and debugged water (61.2 %), without the need for a preliminary step enrichment of samples. The PCR and q-PCR techniques determined the presence of H. pylori in the samples, with detection rates of both 15 %. It was possible to quantify only in 3 direct samples belonging to the reactor inlet and outlet (1.8x10; 1.5x10 and 6.3x10 GU/mL), the other samples had the Ct above the threshold of reliability (> 35 cycles). Although the culture turned out to be a not fully resolutive method, the method of isolation by 0.65 µm membrane, tuned in this thesis, was effective in reducing the accompanying microbiota and to obtain cultivable H. pylori for the first time from debugged water. Similarly, 63 drinking water samples from 51 public drinking water sources located on the coastal area in Eastern Spain, were analyzed and could be confirmed for the first time the presence of viable cells of the pathogen in drinking water. FISH and q-PCR techniques were effective for detecting H. pylori with detection rates of 46 % and 50.8 % respectively. For detection of viable cells of H. pylori in drinking water DVC-FISH technique it proved to be a more effective tool than the PMA-qPCR, with a detection rate of 38 % viable cells. Quantitation of viable cells was possible by obtaining values between 4x102 and 1.6x103 viable cells of H.pylori/mL. Despite the difficulty of culturing the pathogen H. pylori it was identified in a sample after 24 hours enrichment. Detection of mutations in the 23S, in specific resistance to clarithromycin, indicated that 41.6% of the samples of wastewater and 17.4% of drinking water samples had H.pylori with this potential resistance. The results confirm the ability of H.pylori to survive the water purification treatments in a wastewater treatment plant, it should be considered when evaluating the potential risk in reuse for irrigation. Moreover, H.pylori is found in the distribution systems of drinking water, so its consumption may be a risk to human health, since they are a possible route of transmission of the pathogen. The presence of clarithromycin-resistant H.pylori in the environment, show the need to monitor effective control of the pathogen, since water can pose a risk to the expansion of resistance and consequent therapeutic failures in clinical practice. Given the role of water in the transmission of H.pylori, confirmed in this thesis, the established protocols are proposed, mainly the DVC-FISH method, as they can be validated for an efficient environmental control of H.pylori. / Resumen Helicobacter pylori ocupa una posición destacada entre los patógenos humanos emergentes, siendo una de las causas más comunes de infección crónica bacteriana en la humanidad y estrechamente relacionada con la úlcera péptica y el cáncer gástrico. Se ha sugerido que H.pylori puede ser adquirido por diferentes vías de transmisión, entre ellas el agua. El aprovechamiento de las aguas residuales depuradas y la resistencia de H. pylori a los tratamientos de desinfección del agua constituye un riesgo para la salud. De igual forma, H.pylori presenta capacidad de resistencia a tratamientos de potabilización y a concentraciones elevadas de cloro libre en los sistemas de distribución gracias a la formación de biopelículas. El estado VNC de H.pylori, en ambas matrices, hace necesario la aplicación de técnicas moleculares para su detección e identificación. En esta tesis doctoral se ha estudiado la presencia y viabilidad de este importante patógeno tanto en agua residual como potable. Un total de 60 muestras de agua residual, incluyendo muestras de la entrada del reactor biológico, de la salida de éste y tras el tratamiento de desinfección con UV, se analizaron para detectar la presencia de H. pylori mediante las técnicas moleculares PCR, q-PCR y FISH y cultivo en placa. La técnica FISH resultó ser un método eficaz y rápido para la detección de H. pylori en las aguas residuales y depuradas (61.2 %), sin la necesidad de un paso previo de enriquecimiento de las muestras. Las técnicas PCR y q-PCR determinaron la presencia de H.pylori en las muestras, con porcentajes de detección de ambas del 15 %. Fue posible cuantificar únicamente en 3 muestras directas, pertenecientes a la entrada y salida del reactor (1.8x10; 1.5x10 y 6.3x10 GU/ mL). Aunque el cultivo resultó ser un método poco resolutivo, el método de aislamiento mediante membrana de 0.65 µm, puesto a punto en esta tesis doctoral, resultó eficaz para reducir la microbiota acompañante y poder obtener H.pylori cultivable por primera vez a partir de aguas depuradas. De igual modo, se analizaron 63 muestras de agua potable procedentes de 51 fuentes públicas de agua potable, pudiendo confirmar por primera vez la presencia de células viables del patógeno en aguas de consumo. Las técnicas FISH y q-PCR resultaron eficaces para la detección de H. pylori con unas tasas de detección de 46 % y 50.8 % respectivamente. Para la detección de células viables de H.pylori en agua potable la técnica DVC-FISH resultó ser una herramienta efectiva. Fue posible la cuantificación de células viables obteniendo valores comprendidos entre 4x102 y 1.6x103 células viables de H. pylori /mL. A pesar de la dificultad de cultivar el patógeno, se identificó H. pylori en una muestra tras el enriquecimiento de 24 horas. La detección de mutaciones en el 23S, específicas en la resistencia a la claritromicina, indicó que el 41.6% de las muestras de agua residual y el 17.4 % de las muestras de agua potable presentaban H.pylori con dicho potencial. Los resultados obtenidos confirman la capacidad de H.pylori de sobrevivir a los tratamientos de depuración del agua en una estación de depuración de aguas residuales, lo que debería ser considerado al evaluar el riesgo potencial de su reutilización para el riego. Por otra parte, H.pylori se encuentra en los sistemas de distribución de agua potable, por lo que el consumo de éstas puede representar un riesgo para la salud humana. La presencia de H.pylori resistente a la claritromicina en el ambiente, evidencia la necesidad de monitorizar un control eficaz del patógeno, ya que el agua puede suponer un riesgo para la expansión de las resistencias, y los consiguientes fallos terapéuticos en la práctica clínica. Dado el papel del agua en la transmisión de H. pylori, confirmado en esta tesis doctoral, se proponen los protocolos establecidos, principalmente el método DVC-FISH, como validables para el / Resum Helicobacter pylori ocupa una posició destacada entre els patògens humans emergents, sent una de les causes més comuns d'infecció crònica bacteriana en la humanitat i estretament relacionada amb l'úlcera pèptica i el càncer gàstric. S'ha suggerit que H. pylori pot ser adquirit per diferents vies de transmissió, entre elles l'aigua. L'aprofitament de les aigües residuals depurades i la resistència d'H. pylori als tractaments de desinfecció de l'aigua constitueix un risc per a la salut.De la mateixa manera, H. pylori presenta capacitat de resistència a tractaments de potabilització i a concentracions elevades de clor lliure en els sistemes de distribució gràcies a la formació de biopel¿lícules. L'estat VNC de H. pylori, en ambdues matrius, fa necessari l'aplicació de tècniques moleculars per a la seva detecció i identificació. En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la presència i viabilitat d'aquest important patogen tant en aigua residual com potable. Un total de 60 mostres d'aigua residual, incloent mostres de l'entrada del reactor biològic, de la sortida d'aquest i després del tractament de desinfecció amb UV, es van analitzar per detectar la presència de H. pylori mitjançant les tècniques moleculars PCR, q-PCR i FISH i cultiu en placa. La tècnica FISH va resultar ser un mètode eficaç i ràpid per a la detecció de H. pylori en les aigües residuals i depurades (61.2 %), sense la necessitat d'un pas previ d'enriquiment de les mostres. Les tècniques PCR i q-PCR van determinar la presència de H. pylori en les mostres, amb percentatges de detecció de les dues del 15 %. Va ser possible quantificar únicament en 3 mostres directes, pertanyents a l'entrada i sortida del reactor (1.8x10; 1.5x10 i 6.3x10 GU/mL). Tot i que el cultiu va resultar ser un mètode poc resolutiu, el mètode d'aïllament mitjançant membrana de 0.65 µm, posat a punt en aquesta tesi doctoral, va resultar eficaç per reduir la microbiota acompanyant i poder obtenir H. pylori cultivable per primera vegada a partir d'aigües depurades. De la mateixa manera, es van analitzar 63 mostres d'aigua potable procedents de 51 fonts públiques d'aigua potable, i confirmar per primera vegada la presència de cèl¿lules viables del patogen en aigües de consum. Les tècniques FISH i q-PCR van resultar eficaces per a la detecció de H. pylori amb unes taxes de detecció de 46 % i 50.8 % respectivament. Per a la detecció de cèl¿lules viables de H. pylori en aigua potable la tècnica DVC-FISH va resultar ser una eina efectiva. Va ser possible la quantificació de cèl¿lules viables obtenint valors compresos entre 4x102 i 1.6x103 cèl¿lules viables d'H. pylori /mL. Tot i la dificultat de conrear el patogen, es va identificar H. pylori en una mostra després de l'enriquiment de 24 hores. La detecció de mutacions en el 23S, específiques en la resistència a la claritromicina va indicar que el 41.6 % de les mostres d'aigua residual i el 17.4 % de les mostres d'aigua potable presentaven H. pylori amb aquest potencial. Els resultats obtinguts confirmen la capacitat de H. pylori de sobreviure als tractaments de depuració de l'aigua en una estació de depuració d'aigües residuals, el que hauria de ser considerat en avaluar el risc potencial de la seva reutilització per al reg. D'altra banda, H. pylori es troba en els sistemes de distribució d'aigua potable, per la qual cosa el consum d'aquestes pot representar un risc per a la salut humana. La presència de H. pylori resistent a la claritromicina en l'ambient, evidència la necessitat de monitoritzar un control eficaç del patogen, ja que l'aigua pot suposar un risc per a l'expansió de les resistències, i els consegüents errors terapèutics en la pràctica clínica. Donat el paper de l'aigua en la transmissió d'H.pylori, confirmat en aquesta tesi doctoral, es proposen els protocols establerts, principalment el mètode DVC-FISH, com validables per al control ambient / Santiago Cuéllar, P. (2016). TRANSMISIÓN DE HELICOBACTER PYLORI A TRAVÉS DEL AGUA: ESTUDIO DE LA PRESENCIA DEL PATÓGENO E IDENTIFICACIÓN DE FORMAS VIABLES MEDIANTE TÉCNICAS MOLECULARES [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75086

Bacteria of the Arcobacter genus are microorganisms belonging to the Campylobacteraceae family. Currently, the Arcobacter genus comprises 23 species, isolated from a variety of hosts and ecological niches. Although most of the pathogenic species are from fecal origin, seawater is considered to be the habitat for most of them. The transmission to humans seems to be associated to the consumption of raw food or not entirely-cooked. In this regard, the presence of pathogenic Arcobacter species in food of marine origin and vegetables has not been deeply studied. When the detection and identification of Arcobacter is performed exclusively using conventional culture-based methods, the process is slow, tedious and rarely effective many times, originating frequently false negatives. Molecular biology-based methods analyzing nucleic acids with the use of the Polymerase Chain Reaction (PCR), are alternative procedure characterized by being reliable, faster, more sensitive. In this thesis we have analysed the presence of Arcobacter spp in 100 samples from shellfish and another 100 samples from vegetables using both approaches, on one side through the isolation and characterization by plate culture in and on the other side by PCR. The results obtained by both methods confirm the presence of Arcobacter spp. in the samples. An enrichment period followed by PCR has proved to be more sensitive than culture for the detection of the microorganism in the samples. In this study, Arcobacter contamination has been detected in 71 % of the shellfish samples and 20 % of vegetable samples. The obtained Arcobacter isolates have been identified to the species level analyzing the 16 rRNA gene by PCR-RFLP. This technique has allowed the identification of the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. defluvii in the shellfish isolates, being the first time that A. defluvii is identified in clams. Additionally, it is also the first time that Arcobacter spp. is detected in cockles. A. butzleri and A. cryaerophilus have been isolated in vegetables being the last one the first time in this type of samples. The sensitivity of the obtained isolates to ciprofloxacin and levofloxacin has also been studied. 2 % in analysed shellfish and 1 % in vegetables were contaminated with resistant strains. Three isolates from shellfish and 2 from vegetables, previously identified as A. butzleri, have shown resistance to both fluoroquinolones. In all of them, a mutation in the 254 position (C normal to T mutant) in the Quinolone Resistance-Determining Region (QRDR) of the gyrA gene has been detected. Our results regarding the presence of the pathogen in both types of samples are sufficiently relevant as to consider that the consumption of these contaminated foods with Arcobacter, especially A. butzleri, could suppose a risk for human health. In addition, in this thesis the analisys of Helicobacter spp. and H. pylori by conventional PCR and real-time PCR has been carried out. The Helicobacter genus comprises a large number of species considered pathogenic. The most studied specie is H. pylori, one of the most common pathogens in humans and responsible of 90 % of peptic ulcers and closely related to the development of gastric cancer. Although it seems clear that H. pylori is transmited by fecal-oral route through the water, its presence in food is poorly known. Therefore, another objective of the present study has been to study the presence of these organisms in shellfish and vegetable samples. Helicobacter spp. or H. pylori could not be detected by conventional PCR. However, the real-time PCR technique allowed the detection of H. pylori in a sample from vegetables (lettuce). / Las bacterias del género Arcobacter son microorganismos pertenecientes a la familia Campylobacteraceae. Actualmente, el género Arcobacter comprende 23 especies, aisladas de una gran diversidad de hospedadores y nichos ecológicos. Las aguas de mar son consideradas el hábitat natural para muchas de ellas, aunque la mayor parte de las especies patógenas son de origen fecal. La transmisión al hombre parece estar asociada al consumo de alimentos crudos o poco cocidos. Sin embargo, la presencia de especies patógenas de Arcobacter en alimentos de origen marino y vegetales ha sido muy poco estudiada. Cuando la detección e identificación de Arcobacter, se establece exclusivamente en función de métodos convencionales de cultivo, el proceso resulta lento, tedioso y poco efectivo en muchas ocasiones, originando frecuentes falsos negativos. Los métodos de detección molecular basados en el análisis de ácidos nucleicos, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Por todo ello, en este trabajo se ha realizado la detección de Arcobacter spp. mediante aislamiento por cultivo en placa y PCR, a partir de 100 muestras de moluscos y 100 de verduras. Los resultados obtenidos por ambos métodos confirman la existencia de Arcobacter en las muestras. La PCR, realizada tras un periodo de enriquecimiento, ha resultado ser más sensible que el cultivo para la detección del microorganismo en las muestras. En este trabajo se ha detectado contaminación por Arcobacter en el 71 % de las muestras de moluscos y el 20 % de las muestras de verduras. Los aislados de Arcobacter obtenidos han sido identificados a nivel de especie mediante un análisis PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Esta técnica ha permitido identificar las especies A. butzleri, A. cryaerophilus y A. defluvii de los aislados de moluscos, siendo la primera vez que es identificada A. defluvii de muestras de almejas. También es la primera vez que se detecta Arcobacter spp. en berberechos. En el caso de las verduras, se han aislado A. butzleri y A. cryaerophilus. Esta última especie ha sido identificada por primera vez en este tipo de muestras. También se ha estudiado la sensibilidad de los aislados obtenidos a ciprofloxacino y levofloxacino. El porcentaje de muestras contaminadas con cepas resistentes fue del 2 % en moluscos y del 1 % en verduras. Tres aislados procedentes de moluscos y 2 de verduras, identificados previamente como A. butzleri, han mostrado resistencia a ambas fluoroquinolonas. En todos ellos se ha detectado la existencia de una mutación en la posición 254 (C normal por T mutante) en la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR) del gen gyrA. Nuestros resultados sobre la presencia del patógeno en ambos tipos de muestras son lo suficientemente relevantes como para considerar que el consumo de estos alimentos contaminados con Arcobacter, especialmente A. butzleri, podría suponer un riesgo para la salud humana. Adicionalmente, en este trabajo se ha realizado un análisis de detección de Helicobacter spp. y H. pylori mediante PCR convencional y PCR a tiempo real. El género Helicobacter comprende un gran número de especies consideradas patógenas. La especie más estudiada es H. pylori, uno de los patógenos más comunes en humanos, responsable del 90 % de las úlceras pépticas y relacionado estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Aunque parece claro que H. pylori se transmite por la vía fecal-oral a través del agua, su presencia en los alimentos es poco conocida. Por lo tanto, en este estudio se tomó como objetivo estudiar la presencia de estos microorganismos en las muestras de moluscos y verduras. El análisis mediante PCR convencional no mostró resultados positivos para la detección de Helicobacter spp. ni H. pylori. La técnica PCR a tiempo real, sin embargo, ha permitido la detección de H. pylori en una muestra procedente de verduras (lechuga). / Els bacteris del gènere Arcobacter són microorganismes pertanyents a la família Campylobacteraceae. Actualment, el gènere Arcobacter comprèn 23 espècies, aïllades d'una gran diversitat d'hostes i nínxols ecològics. Les aigües de la mar són considerades l'hàbitat natural per a moltes d'aquestes espècies, encara que la major part de les patògenes són d'origen fecal. La transmissió a l'home sembla estar associada al consum d'aliments crus o poc cuits. No obstant això, la presència d'espècies patògenes d'Arcobacter en aliments d'origen marí i vegetals ha sigut molt poc estudiada. Quan la detecció i identificació d'Arcobacter s'estableix exclusivament en funció de mètodes convencionals de cultiu, el procés resulta lent, tediós i sovint poc efectiu, i origina amb freqüència falsos negatius. Els mètodes de detecció molecular basats en l'anàlisi d'àcids nucleics, com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), poden suposar una alternativa més ràpida, sensible i fiable. Per tot això, en aquest treball s'ha realitzat la detecció d'Arcobacter spp. mitjançant aïllament per cultiu en placa i PCR, a partir de 100 mostres de mol·luscos i 100 de verdures. Els resultats obtinguts pels dos mètodes confirmen l'existència d'Arcobacter en les mostres. La PCR, després d'un període d'enriquiment, ha resultat ser més sensible que el cultiu per a la detecció del microorganisme en mostres de mol·luscos. En aquest treball, s'ha detectat contaminació per Arcobacter en el 71 % de les mostres de mol·luscos i el 20 % de les mostres de verdures. Els aïllats d'Arcobacter obtinguts han sigut identificats a nivell d'espècie mitjançant una anàlisi PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Aquesta tècnica ha permès identificar les espècies A. butzleri, A. cryaerophilus i A. defluvii en els aïllats de mol·luscos. Aquesta és la primera vegada que A. defluvii és identificada en mostres de cloïsses. També és la primera vegada que es detecta Arcobacter spp. en catxels. En el cas de les verdures, s'han aïllat A. butzleri i A. cryaerophilus. Aquesta última espècie ha sigut identificada per primera vegada en aquest tipus de mostres. També s'ha estudiat la sensibilitat dels aïllats obtinguts a la ciprofloxacina i la levofloxacina. El percentatge de mostres contaminades amb soques resistents va ser del 2 % en mol·luscos i de l'1 % en verdures. 3 aïllats procedents de mol·luscos i 2 de verdures, identificats prèviament com A. butzleri, han mostrat resistència a ambdues fluoroquinolones. En tots aquests s'ha detectat l'existència d'una mutació en la posició 254 (C normal per T mutant) en la regió determinant de resistència a quinolones (QRDR) del gen gyrA. Els nostres resultats sobre la presència del patogen en els dos tipus de mostres són prou rellevants per a considerar que el consum d'aquests aliments contaminats amb Arcobacter, especialment A. butzleri, podria suposar un risc per a la salut humana. Addicionalment, en aquest treball s'ha fet una anàlisi de detecció d'Helicobacter spp. i H. pylori mitjançant PCR convencional i PCR a temps real. El gènere Helicobacter comprèn un gran nombre d'espècies considerades patògenes. L'espècie més estudiada és H. pylori, un dels patògens més comuns en humans, responsable del 90% de les úlceres pèptiques i relacionada estretament amb el desenvolupament de càncer gàstric. Encara que sembla clar que H. pylori es transmet per la via fecal-oral a través de l'aigua, la presència d'aquest bacteri en els aliments és poc coneguda. Per tant, en aquest estudi es va definir com a objectiu estudiar la presència d'aquests microorganismes en les mostres de mol·luscos i verdures. L'anàlisi mitjançant PCR convencional no va mostrar resultats positius per a la detecció d'Helicobacter spp. ni d'H. pylori. La tècnica PCR a temps real, en canvi, ha permès la detecció d'H. pylori en una mostra procedent de verdures (encisam). / Bayas Morejón, IF. (2016). Aportaciones a la epidemiología de Arcobacter y Helicobacter spp.: Aplicación de métodos moleculares a su detección e identificación en alimentos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75087

Tesis por compendio / La vid es un cultivo de propagación vegetativa y de gran importancia económica cuyo cultivo se distribuye mundialmente por zonas templadas. Su producción va destinada principalmente a la elaboración de vino, seguido de la producción de uva de mesa. Aunque existen miles de variedades, una decena de ellas son las que se utilizan mayoritariamente a nivel mundial lo que conlleva a una pérdida de variabilidad. Desde la llegada de la filoxera, el cultivo de la vid se realiza mediante injerto en pies resistentes a este áfido. Según la Comisión Directiva 2005/43/EC el material de propagación de vid debe estar libre de los siguientes virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV y ArMV. En este trabajo se han evaluado y desarrollado distintas metodologías relacionadas con el cultivo in vitro de plantas encaminadas al saneamiento, multiplicación y conservación de germoplasma de vid. La conservación de variedades de vid in vitro es muy importante para complementar la conservación de germoplasma de las colecciones de campo. Para ello es importante seleccionar el material a conservar, determinar su estado sanitario, sanear si es el caso y establecer las condiciones adecuadas para su conservación. En un primer capítulo de esta tesis (Capítulo 1) se describen los ensayos realizados para inducir la embriogénesis somática en 16 variedades de vid que incluyen seis variedades infectadas con los virus GFLV, GLRaV-3 y GFkV. La embriogénesis somática ha sido descrita en vid como una metodología útil para el saneamiento de plantas infectadas con virus y es la vía común de regeneración adventicia.. En este trabajo se utiliza como material de partida semillas cortadas y se han obtenido plantas libres de virus y porcentajes de regeneración elevados en todas las variedades evaluadas. La utilización de marcadores microsatélites nos ha servido para seleccionar entre las plantas regeneradas aquellas que muestran el mismo genotipo que las plantas de partida. Por otra parte, en este trabajo se ha desarrollado un protocolo de micropropagación a partir de planta sana de la variedad 'Monastrell' cultivada in vitro obteniéndose tasas de multiplicación elevadas y plantas que se han aclimatado a condiciones de campo (Capítulo 2). El medio de cultivo MW, utilizado para el desarrollo de las plantas, se ha evaluado en otras 16 variedades y también se ha comparado el crecimiento en este medio y en variaciones de éste, como son la disminución de la concentración de azúcar a la mitad y la eliminación del ácido indolbutírico. La finalidad de estos ensayos ha sido determinar para cada variedad qué condiciones son las más adecuadas para mantener el germoplasma vegetal en cultivo in vitro activo, pero alargando el tiempo entre subcultivos optimizando costes (Capítulo 3). En el Capítulo 4 se incluye un trabajo para localizar, identificar, descartar o detectar la presencia de los virus anteriormente comentados, sanear si es el caso, y conservar in vitro las variedades de interés en las que se lleva a cabo una identificación utilizando marcadores SSR y un análisis de variabilidad genética cuando se dispone de varias accesiones. A modo de ejemplo, en este trabajo se publica el perfil de marcadores microsatélites para dos de las variedades colectadas y/o conservadas, la variedad 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') y accesiones de 'Valencí Blanc' en las que se ha detectado diferencias para el marcador VVMD32 que agrupa las accesiones de Alicante por una parte, y al resto de accesiones por otra. También se ha validado un protocolo de crioconservación en la variedad 'Esclafacherre'. Por último, el Capítulo 5 hace referencia a un estudio llevado a cabo para determinar el estado actual de la aplicación de la transformación genética en vid, centrándonos en los factores limitantes de las metodologías empleadas. La transformación genética es una herramienta de gran potencial para la mejora de los cultivos, principalmente en plantas de p / Grapevine is a crop of vegetative propagation with great economical importance which is distributed worldwide in temperate zones. It is mainly used for wine and table grape production. Despite the fact thousands of varieties exist only few are commonly used, producing a loss of variability. Since the arrival of the phylloxera aphid the grapevine culture is performed using resistant rootstocks. The Directive Commission 2005/43/EC amending the Directive Council annexes 68/193/EEC, indicates that grapevine material should be free of these viruses: Grapevine fanleaf virus (GFLV), Grapevine leafroll associated virus 1 (GLRaV-1), Grapevine leafroll associated virus 3 (GLRaV-3), Grapevine fleck virus (GFkV) and Arabis mosaic virus (ArMV). In this work different methodologies related with in vitro culture were evaluated and developed with the aim of sanitate, mutiplicate and preserve grapevine germplam. In vitro preservation of grapevine varieties is a complementary stratregy of field preservation. In a preservation program it is important the selection of the starting material, determine its sanitary status, sanitate if it is necessary and, establish the appropriate in vitro conditions for its preservation. In the first chapter of this thesis (Chapter 1) the assays carried out for inducing somatic embryogenesis in 16 grapevine varieties which include six that were infected by the viruses GFLV, GLRaV-3 and GFkV are described. In grapevine, somatic embryogenesis has been described as a usefull methodology for virus sanitation and is the common pathway to adventitious regeneration. Efficient regeneration prototocols are necessary to address breeding by genetic transformation. In this work, cut seed are used as starting material and virus-free plants and high precentages of regeneration were obtained in all the varieties evaluated. The use of microsatellite markers has been useful to select those plants with the same genotype than the mother plant. From the other side, in this work, a micropropagation protocol starting from a healthy plant of the cultivar 'Monastrell' was developed and high multiplication rates with good adaptation to field conditions were obtained (Chapter 2). The culture medium MW was evaluated in 16 grapevine varieties as well as the following modifications: reduction in a half of the sugar content and elimination of the Indolebutyric Acid. The aim of these assays was to determine for each variety which conditions are the most appropiate to maintain in active in vitro culture this germplasm, lengthen the time between subcultures for reducing costs (Chapter 3). In Chapter 4 it is included a divulgation report that summarized the steps followed in the MINECO proyect CGL2015-70843-R for localizing and identifying grapevine varieties; discard or detect the presence of the viruses, sanitizing if it is necessary and, conserve in vitro the most interesting accessions. Microsatellite markers were used for genotyping. Analysis of variability were performed when several accessions were available. As an example, in this work it is published the microsatellite profile for two accessions of the endangered cultivar 'Esclafacherre' ('Esclafagerres') localized in two fields of the Valencian Community, and those of several accessions of 'Valencí Blanc' which differed for the VVMD32 marker, grouping the Alicante accessions and the rest of accessions from other origins. It was also validated a cryoconservation protocol for the 'Esclafacherre' variety. By last, Chapter 5 makes reference to a review performed with the goal to know the state of the art of genetic transformation in grapevine focusing on the main limiting factors of the employed methodologies. Genetic transformation is a potential tool for crop breeding, mainly in vegetative propagation plants. / La vinya és un cultiu de propagació vegetativa i de gran importància econòmica que es distribueix mundialment per zones temperades. La seua producció va destinada principalment a l'elaboració de vi, seguit de la producció de raïm de taula. Encara que existeixen milers de varietats, una desena d'elles son les que s'utilitzen majoritàriament a nivell mundial, el que comporta una pèrdua de variabilitat. Des de l'arribada de la fil·loxera, el cultiu de vinya es realitza mitjançant l'ampelt en peus resistents a aquest àfid. Segons la Comissió Directiva 2005/43/EC, el material de vinya ha d'estar lliure dels següents virus: GFLV, GLRaV-1, GLRaV-3, GFkV i ArMV. En este treball s'han avaluat i desenvolupat diferents metodologies relacionades amb el cultiu in vitro de plantes encaminades al sanejament, multiplicació i conservació de germoplasma de raïm. La conservació de varietats de raïm in vitro és molt important per a complementar la conservació de germoplasma en les col·leccions de camp. En el primer capítol d'esta tesi (Capítol 1) es descriuen els assaigs realitzats per a induïr l'embriogènesi somàtica en 16 varietats de raïm que inclouen sis varietats infectades amb els virus GFLV, GLRaV-3 i GFkV. En vinya, l'embriogènesi somàtica ha sigut descrita com una metodologia útil per al sanejament de plantes infectades amb virus i és la via comú de regeneració adventícia. En este treball s'utilitza com a material de partida llavors tallades i s'han obtingut plantes lliures de virus i percentatges de regeneració elevats en totes les varietats avaluades. La utilització de marcadors microsatèl·lits ens ha servit per a seleccionar entre les plantes regenerades aquelles que mostren el mateix genotip que les plantes de partida. Per altra banda, en este treball s'ha desenvolupat un protocol de micropropagació a partir de planta sana de la varietat 'Monastrell' cultivada in vitro, obtenint-se taxes de multiplicació elevades i plantes que s'han aclimatat a condicions de camp (Capítol 2). En el medi de cultiu MW, utilitzat per al desenvolupament de les plantes, s'han avaluat un total de 16 varietats i també s'ha comparat el creixement en este medi i en variacions d'este, com son la disminució de la concentració de sucre a la meitat i la eliminació de l'àcid indolbutíric. La finalitat d'estos assaigs ha sigut determinar per a cada varietat quines condicions són les més adequades per a mantindre el germoplasma vegetal en cultiu in vitro actiu però allargant el temps entre subcultius i optimitzant costos (Capítol 3). En el Capítol 4 s'inclou un treball de divulgació per a localitzar, identificar, descartar o detectar la presència dels virus anteriorment comentats, sanejar si cal, i conservar in vitro les varietats d'interés en les que es porta a cap una identificació utilitzant marcadors SSR i l'anàlisi de la variabilitat genètica quan es disposa de diverses accessions. A mode d'exemple, en estre treball es publica el perfil de marcadors microsatèl·lits per a dos de les accessions col·lectades de la varietat en perill d'extinció 'Esclafacherre' ('Esclafagerres'). També, es mostra el genotipat d'accessions de 'Valencí Blanc' en les que s'han detectat diferències per al marcador VVMD32 que agrupa les accessions d'Alacant per una banda, i a la resta d'accessions per altra. També s'ha validat un protocol de crioconservació en la varietat 'Escalfacherre'. Per últim, el Capítol 5 fa referència a un estudi portat a terme per a determinar l'estat actual de l'aplicació de la transformació genética en raïm, centrant-nos en els factors limitants de les metodologies empleades. La transformació genética és una ferramenta de gran potencial per a la millora dels cultius, principalment en plantes de propagació vegetativa. / San Pedro Galán, TM. (2017). Desarrollo y aplicación de técnicas biotecnológicas para el saneamiento, multiplicación, caracterización y conservación de germoplasma de vid (Vitis vinifera L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/94622 / Compendio

La presente tesis doctoral, titulada "Diseño de scaffolds inteligentes para la prevención y tratamiento de la infección ósea", se centra en el desarrollo de materiales híbridos orgánico-inorgánicos capaces de realizar una liberación controlada de fármacos con fines biomédicos. En el primer capítulo, se presenta una introducción general sobre química supramolecular, materiales híbridos orgánico-inorgánicos y materiales porosos. En el segundo capítulo, se presentan tres proyectos sobre el diseño de puertas moleculares. En el primero, se muestran dos sistemas basados en el uso de un vidrio mesoporoso que actúa como soporte inorgánico, cargado y funcionalizado con moléculas orgánicas para llevar a cabo una liberación controlada de sustancias. La primera puerta molecular está compuesta por aminas y adenosín 5'-trifosfato (ATP), y la segunda está formada por 3-(trietoxisilil)propilisocianato unido a polímeros de ε-poli-L-lisina. Los dos sistemas se han caracterizado por resonancia magnética nuclear en estado sólido (RMN) y espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). También se han estudiado las propiedades bioactivas de ambos materiales. Después, ambas puertas moleculares se han implementado en sólidos cargados con el objetivo de demostrar se podía realizar una liberación controlada de la carga. En el primer caso, el soporte mesoporoso se ha cargado con doxorubicina y se ha tapizado con moléculas de ATP. El sistema se ha validado in vitro con células humanas de osteosarcoma (HOS). En el segundo caso, el soporte mesoporoso se ha cargado con levofloxacino y se ha tapizado con ε-poli-L-lisina, y el sistema se validado con bacterias E.coli. Una vez descritos estos sistemas, se presenta una segunda publicación donde también se utiliza la puerta molecular de ATP. En este caso, el vidrio mesoporoso bioactivo que actúa como soporte inorgánico tiene una composición de 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5, y se ha cargado con levofloxacino con el objetivo de conseguir propiedades antibióticas. El sólido se ha caracterizado mediante las técnicas correspoondientes, y se han estudiado sus propiedades bioactivas. Finalmente, se han utilizado bacterias E.coli para demostrar que el sólido posee actividad antibiótica, y es capaz de llevarala a cabo solo en presencia de fosfatasa ácida. El tercer proyecto presentado consiste en un soporte de MCM-41cargado con un colorante y funcionalizado con una secuencia peptídica que actúa como puerta molecular. El estímulo usado en este caso es la proteasa V8, típica del microorganismo S. aureus. El sistema ha sido correspondientemente caracterizado, y se han testado sus propiedades de liberación controlada de sustancias in vitro, demostrando la eficiencia del diseño. En el tercer capítulo, se utiliza un derivado de un componente de aceites esenciales (vanillina) para funcionar microesferas y scaffolds de fosfato de calcio, para dotarlos de propiedades antibióticas. En primer lugar, se ha sintetizado y se ha caracterizado el compuesto derivado de la vanillina, y se ha anclado en la superficie de los materiales de fosfato cálcico. Después, se han estudiado las propiedades antimicrobianas de ambos materiales en presencia de bacterias E.coli. También se han llevado a cabo ensayos de citotoxicidad con células tipo-fibroblasto L929 ynsayos de biocompatibilidad con células humanas tipo-osteoblasto MG-63, demostrando que las propiedades osteoregenerativas de los materiales originales no se ven modificadas tras el proceso de funcionalización. En resumen, se puede concluir que los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis han contribuido al campo de los materiales de liberación controlada y de los materiales con efecto antibactérico. Estos nuevos diseños pueden ser clave en futuras aplicaciones para la investigación biotecnológica y biomédica, particularmente en terapias para la regeneración y contra la infección ósea. / This thesis, entitled "Design of smart scaffolds for the treatment and prevention of bone infection", is focused on the development of smart organic-inorganic hybrid materials capable of perform controlled-delivery of drugs with biomedical purposes. In the first chapter, a general introduction about supramolecular chemistry, organic-inorganic hybrid materials and porous materials is given. The characterization and applications of porous materials are extensively explained, since those contents are highly related to the developing of this thesis. In the second chapter, three projects based on the design of gated devices are presented. In the first publication, two gated systems based on the use of a mesoporous silica material as an inorganic support, loaded and functionalised with organic molecules to achieve a controlled drug release are studied. The first molecular gate is composed by amino moieties and adenosine 5'-triphosphate (ATP), and the second one is composed by 3-(triethoxysilyl)propylisocyanate linked to ε-poly-L-lysine polymers. The two systems were characterized by solid state nuclear magnetic resonance (NMR) and Fourier transformed infrared spectroscopy (FTIR). The bioactivity capabilities of the materials were also studied. Then, both molecular gates have been implemented in loaded solids in order to demonstrate their controlled-release capabilities. In a first case, the mesoporous support was loaded with doxorubicin and capped with ATP molecules, and the system has been validated in a human osteosarcoma cell culture test. In a second case, the mesoporous support was loaded with levofloxacin and capped with the ε-poly-L-lysine molecular gates, and the system has been validated with E.coli bacteria. Once these two systems are described, a second project with the ATP molecular gates is presented. In this case, the mesoporous bioactive glass which acts as support has a composition of 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5, and it has been loaded with levofloxacin with the purpose of killing bacteria. The solid has been characterized by corresponding techniques, and its bioactive properties have been studied. Finally, E.coli bacteria have been used to demonstrate that the solid is able to perform an antimicrobial activity only in the presence of acid phosphatase. The third project consists of a MCM-41 support loaded with a dye and capped with a peptide sequence. The trigger used in this case is the V8 protease, typical of the microorganism S. aureus. The system has been correspondingly characterized, and its drug release properties in vitro have been tested, demonstrating the efficiency of the design. In the third chapter, calcium phosphate microspheres and scaffolds have been functionalised with an essential-oil component derivative in order to achieve antibacterial properties. First, the vanillin-derivative has been synthesized and characterised, and in a second step, it has been attached to the surface of the calcium phosphate materials. Then, the antimicrobial properties of both materials have been tested against E.coli bacteria. Cytotoxicity assays with L929 fibroblast-like cells have been performed in order to demonstrate that the functionalized scaffolds did not perform a cytototxic effect. Finally, biocompatibility assays have been made with MG-63 human osteoblast-like cells, demonstrating that the functionalization of the scaffolds with vanillin do not affect their osteoregenerative properties. To sum up, it can be concluded that the results obtained in this thesis have contributed to the field of stimuli-responsive materials and antibacterial devices. The new designs could be key in the development of future applications in biotechology and biomedical research, particularly in bone infection and bone regeneration therapeutics. / La present tesi doctoral, titulada "Disseny de scaffolds intel·ligents per la prevenció i tractament de la infecció òssia", es centra en el desenvolupament de materials híbrids orgànic-inorgànics capaços de realitzar una lliberació controlada de fàrmacs amb propòsits biomèdics. En el primer capítol, es presenta una introducció general sobre química supramolecular, materials híbrids orgànic-inorgànics i materials porosos. També s'explica extensivament la caracterització i les aplicacions d'aquests materials, ja que estos continguts estan altament relacionats amb el desenvolupament d'aquesta tesi. En el segon capítol, es presenten tres projectes sobre el disseny de portes moleculars. En el primer, es mostren dos sistemes basats en l'ús d'un vidre mesoporós que actua com a suport inorgànic, carregat i funcionalitzat amb molècules orgàniques per a dur a terme una lliberació controlada de substàncies. La primera porta molecular està formada per amines i adenosín 5'-trifosfat (ATP), i la segona està formada per 3-(trimetoxisilil)propilisocianat unit a polímers de ε-poli-L-lisina. Els dos sistemes s'han caracteritzat per resonància magnètica nuclear en estat sòlid (RMN) i espectroscopia infrarroja per transformada de Fourier (FTIR). També s'han estudiat les propietats bioactives de ambdós materials. Després, ambdues portes moleculars han sigut implementades en sòlids carregats amb l'objectiu de demostrar que es pot realitzar una lliberació controlada de la càrrega. En el primer cas, el suport mesoporós s'ha carregat amb doxorrubicina, i el sistema s'ha validat in vitro amb cèl·lules humanes d'osteosarcoma (HOS). En el segon cas, el suport mesoporós s'ha carregat amb levofloxací i s'ha entapissat amb ε-poli-L-lisina; el sistema s'ha validat amb bacteris E.coli. Una volta descrits aquests sistemes, es presenta una segona publicació on també s'utilitza la porta molecular d'ATP. En aquest cas, el vidre mesoporós bioactiu que actua com a suport inorgànic té una composició de 80%SiO2-15%CaO-5%P2O5., y s'ha carregat amb levofloxací amb l'objectiu d'aconseguir propietats antibiòtiques. El sòlid s'ha caracteritzat mitjançant les tècniques corresponents, i s'han estudiat les seues propietats bioactives. Finalment, s'han utilitzat bacteris E.coli per demostrar que el sòlid posseïx activitat antibiòtica, i que és capaç de dur-la a terme solament en presència de fosfatasa àcida. El tercer projecte presentat consisteix en un suport de MCM-41 carregat amb un colorant i funcionalitzat amb una seqüència peptídica que actua com a porta molecular. L'estímul utilitzat en aquest cas és la proteasa V8, típica del microorganisme S. aureus. El sistema ha sigut corresponentment caracteritzat, i s'han testat les seues propietats de lliberació controlada de substàncies in vitro, demostrant l'eficàcia del disseny. En el tercer capítol, s'ha utilitzat un derivat d'un component d'olis essencials (vanil·lina) per funcionalitzar microesferes i scaffolds de fosfat de calci amb l'objectiu de dotar-los de propietats antibiòtiques. En primer lloc, s'ha sintetitzat y caracteritzat el compost derivat de la vanil·lina, i s'ha unit a la superfície dels materials de fosfat càlcic. Després, s'han estudiar les propietats antimicrobianes d'ambdós materials en presència de bacteris E.coli. S'han dut a terme assajos de citotoxicitat amb cèl·lules tipus fibroblast L929i assajos de biocompatibilitat amb cèl·lules humanes tipus-osteoblast MG-63, demostrant que les propietats osteoregeneratives dels materials originals no es veuen modificades després del procés de funcionalització. En resum, es pot concluir que els resultats obtinguts en aquesta tesi han contribuït al camp dels materials de lliberació control·lada i materials amb propietats antibacterianes. Els nous dissenys poden ser claus per al desenvolupament de futures aplicacions en la recerca biotecnològica i bi / Polo Aguado, L. (2018). Design of smart scaffolds for the treatment and prevention of bone infection [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111824

Con el fin de relacionar la estructura y la actividad de series de compuestos, es importante usar descriptores moleculares relevantes. Los descriptores GRIND y VolSurf pertenecen a una nueva familia de descriptores llamado libre de alineamiento. Es decir, que no necesitan alinear los compuestos con el fin de comparar sus campos de interacciones molecular. En este estudio se ha aplicado esos descriptores para la selección de reactivos químicos a partir de una amplia base de datos. La selección se ha echo mediante un protocolo que permite maximizar la diversidad de la muestra y así obtener unos compuestos muy informativos. También se ha desarrollado nuevos descriptores de forma que están basado en los cambios de curvatura de la superficie molecular. Los resultados obtenidos indican que los nuevos descriptores de forma se integran muy bien en los descriptores GRIND originales y que permiten identificar los efectos de forma tanto favorable como desfavorable. Además, se ha desarrollado nuevos descriptores libre de alineamiento llamado 'anchor-GRIND' que usan un átomo de cada molécula como punto de referencia para la comparación de los campos de interacciones molecular. Los descriptores 'anchor-GRIND' permiten una descripción mas precisa y mas sencilla que los descriptores GRIND lo que los hace mas relevante para el análisis de ciertas familias de compuestos. / In order to correlate the differences of structure with the differences of activity of series of compounds, it is important to use relevant molecular descriptors. The GRIND and VolSurf descriptors belong to the so-called alignment-free descriptors family. In other words, they do not require to align the compounds in order to compare its molecular interaction fields. In this study, we applied these descriptors to the selection of chemical reagent from a database of compounds. The selection has been done following a protocol which allows to maximize the diversity of the sample and so to obtain some compounds highly informative. In addition we developed new shape descriptors which are based on the changes of curvature of the molecular surface. The results obtained show that the new shape descriptors are well integrated in the original GRIND descriptors. Furthermore, we designed new alignment-free descriptors called 'anchor-GRIND' which use one atom of each molecule as a reference point for the comparison of the molecular interaction fields. The 'anchor-GRIND' descriptors allow a more precise and more simple description than the GRIND descriptors, which makes them more relevant for the analysis of some families of compounds.

A amebíase é uma infecção causada pela Entamoeba histolytica. Entretanto, a diferenciação entre a E. histolytica e a Entamoeba dispar, espécies morfologicamente semelhantes, é fundamental para a conduta terapêutica, prevenção da doença invasiva e para a saúde pública. O propósito desde trabalho foi avaliar a Multiplex-PCR na detecção e diferenciação entre a E. histolytica e a E. dispar. Foi feita uma comparação entre os métodos de exame microscópico das fezes usando o conjunto diagnóstico Coprotest, a detecção de antígenos nas fezes usando um ensaio imunoenzimático comercial e o Multiplex-PCR padronizado no laboratório, para o diagnóstico da amebíase. A Multiplex-PCR foi padronizada usando amostras com parasitos obtidos de culturas padrões. Posteriormente, 127 amostras de fezes provenientes de duas comunidades do Estado do Rio de Janeiro, foram testadas e os resultados comparados. A análise de 127 amostras de fezes pelo exame parasitológico de fezes demonstrou que 27 (21%) amostras foram positivas para o complexo E. histolytica/E. dispar. Dessas amostras, 12 foram positivas pelo Multiplex-PCR, sendo que nove apresentaram o padrão de E. dispar (96 bp) e três o padrão E. histolytica (132 bp). Entre as amostras negativas detectadas pelo exame microscópico, três foram positivas para E. dispar e uma foi positiva para E. histolytica pelo Multiplex-PCR. Esse fato mostrou que a PCR foi mais eficiente do que o exame parasitológico realizado com uma amostra de fezes. Os resultados obtidos pelo ensaio de detecção de antígeno de E. histolytica foram concordantes com o do Multiplex-PCR. A análise estatística comparando os resultados do ELISA coproantígeno com o Multiplex-PCR, não pode ser feita devido ao baixo número de casos de E. histolytica. Os resultados acima indicam a necessidade do uso de métodos mais sensíveis para o diagnóstico da amebíase e a importância de se usar técnicas específicas na diferenciação entre E. histolytica e E. dispar. / Amebiasis is defined as an infection caused by Entamoeba histolytica. However, precise differentiation between E. histolytica and Entamoeba dispar, which are morphologically identical species, is essential for treatment decision, prevention of the invasive disease and public health. The purpose of the present study was to evaluate a Multiplex-PCR for detection and differentiation of E. histolytica from E. dispar. Microscopic examination of stools using the coprotest kit, detection of stool antigen using a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit and a home made Multiplex-PCR, were compared for the diagnosis of amebiasis infection. The Multiplex-PCR was standardized using stool samples with parasites obtained from standard cultures. Afterwards, 127 stool samples obtained from individuals living in two villages of the state of Rio de Janeiro were tested and the results were compared. Analysis of the 127 stools samples by microscopy examination demonstrated that only 27 (21%) samples were positive for E. histolytica /E. dispar complex. Among these stool samples, 12 were positive by Multiplex-PCR, with nine presenting the diagnostic fragment characteristic of E. dispar (96 bp) and three presenting diagnostic fragment of E. histolytica (132 bp). Among the negative samples detected by microscopic examination, three were positive for E. dispar and one was positive for E. histolytica by Multiplex-PCR. This denotes that Multiplex-PCR was more efficient than microscopic examination when single stool samples were analyzed. The results obtained by detection of E. histolytica antigen were in agreement with those obtained by the multiplex-PCR. Statistical analyses comparing coproantigen ELISA with Multiplex-PCR results were not done because of the low number of E. histolytica cases. The overall results indicate the need to use more sensitive methods for the diagnosis of amebiasis infection and the importance of using specific techniques for the differentiation between E. histolytica and E. dispar.