O objetivo do presente estudo foi determinar a cinética e a integridade e funcionalidade da membrana plasmática após a seleção espermática com um filtro de membrana sintética em câmaras de PVC com dois diâmetros diferentes e dois tempos de filtração. Foram utilizados 12 ejaculados de três garanhões. Imediatamente após a coleta, o sêmen foi diluído com leite desnatado (T0) e analisado. Duas câmaras diferentes em PVC foram produzidas com dois joelhos conectados com um tubo dividido ao meio por um filtro de membrana sintética com poros de 5 μm. Uma câmara de 26 mm e a outra de 36 mm de diâmetro interno. Foi colocado leite desnatado a 37° C em um lado da câmara (A). No outro lado da câmara (B) depositou-se uma amostra do sêmen diluído, com um número conhecido de espermatozoides. Após 7 e 15 min, obteve-se uma amostra do lado "A" de cada câmara e calculou-se a concentração espermática e analisou-se o sêmen. A motilidade total, a motilidade progressiva e a integridade da membrana plasmática melhoraram (P <0,05) após a filtração em ambos os dispositivos e tempos de filtração. A concentração espermática foi menor (P <0,05) em ambas as câmaras nos dois tempos em relação ao T0. O dispositivo de filtração demonstra ser uma alternativa prática e fácil para a seleção espermática. A seleção usando as câmaras permite um aumento da cinética e da integridade da membrana e funcionalidade independente do tempo e do diâmetro do dispositivo. / The aim of the present study was to determine the kinetics and plasma membrane integrity and functionality after sperm selection with a synthetic membrane filter in PVC chambers with two different diameters and two filtrations times. A total of 12 ejaculates from three stallions was used. Immediately after collection semen was diluted with skim milk (T0) and analyzed. Two different chambers in PVC were made with two elbows connected with a pipe divided in half by a 5 μm pore synthetic membrane filter. One chamber had an inner diameter of 26 mm and the other 36 mm. Skim milk at 37° C was placed in a side of the chamber (A). In the other side of the chamber (B) a sample of the extended semen, with known number of spermatozoa was deposited. After 7 and 15 min a sample was obtained from the ‘A’ side of each chamber and sperm concentration was calculated and semen analyzed. Total motility, progressive motility and plasma membrane integrity were improved (P<0.05) after filtration in both devices and filtration times. Concentration was lower (P<0.05) in both chambers at all times in relation to T0 semen. The filtration device demonstrates to be a practical and easy alternative for sperm selection. Selection using the chambers allows an increase in kinetics and membrane integrity and functionality independent of time and device diameter.

A bacteriospermia pode prejudicar a qualidade das doses de sêmen suíno. Desta forma, a adição de antimicrobianos (ATM) aos diluentes de sêmen é imprescindível para a manutenção da qualidade das doses inseminantes. Contudo, a crescente ocorrência de resistência bacteriana tem impulsionado a redução do uso de ATM na suinocultura. Nesse sentido, o armazenamento das doses inseminantes em baixas temperaturas pode ser uma alternativa para a remoção dos ATM dos diluentes comerciais. Sendo assim, no presente estudo, foram realizados dois experimentos para avaliar a qualidade espermática e a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de doses de sêmen suíno submetidas a baixas temperaturas de armazenamento, na ausência ou presença de ATM. No experimento 1, as motilidades (total e progressiva) das doses com ATM foram maiores conforme aumentou a temperatura de armazenamento (P<0,01). Nas doses sem ATM, as motilidades foram inferiores nas mantidas a 5 °C do que nas demais (P<0,05). O número de UFC/mL foi menor nas doses sem ATM mantidas a 5 e 10 °C do que a 17 °C (P<0,05), mas não houve diferença entre as temperaturas de armazenamento nas doses com ATM (P>0,05). As integridades de acrossoma e de membrana plasmática não foram afetadas (P>0,05) pelo uso de ATM, mas foram influenciadas pela temperatura de armazenamento (P<0,0001) No experimento 2, os machos foram categorizados em BONS e RUINS de acordo com a motilidade progressiva das doses com ATM armazenadas a 5 °C nas 120 h, sendo investigado o efeito dessas categorias sobre as variáveis estudadas. A motilidade total das doses armazenadas a 17 °C foi superior à das mantidas a 5 °C diluídas sem ATM (P<0,05). Os percentuais de motilidade progressiva e de acrossomas normais foram superiores nas doses mantidas a 17 °C do que nas mantidas a 5 °C, com ou sem ATM (P<0,05). O número de UFC/ml foi maior nas doses diluídas sem ATM do que nas demais (P<0,05). Após a categorização dos machos, as motilidades (total e progressiva) foram maiores nos machos BONS do que nos RUINS (P<0,05), sem diferença significativa (P>0,05) nas integridades (acrossomal e de membrana plasmática). Apesar de a qualidade espermática ter sido afetada negativamente pelas baixas temperaturas, o armazenamento das doses de sêmen suíno a 5 °C é possível, uma vez que foi mantida a viabilidade espermática in vitro, por até 5 dias, acima do nível mínimo considerado adequado para a inseminação artificial. Contudo, o uso de doses sem antimicrobianos ainda precisa de otimização, posto que que as baixas temperaturas de armazenamento reduzem, mas não inibem por completo o crescimento bacteriano. / Bacteriospermia can impair boar semen dose quality. Thus, the addition of antibiotics (ATB) is indispensable for maintaining semen doses quality. Nevertheless, growing bacterial resistance occurrence have had driven to a reduction in use of ATB in pig industry. In this sense, storage of semen doses at low temperature may be an alternative to removal ATB of commercial semen extenders. Therefore, the aim of the present study was to assess sperm quality and number of colony-forming units (CFU mL-1) in boar semen doses stored at low storage temperatures with or without ATB, in two experiments. In experiment 1, in semen doses with ATB, total and progressive motility increased as the storage temperature increased (P<0.01). In semen doses without ATB, total and progressive motility were observed to be lower when stored at 5 °C than at 10 and 17 °C (P<0.05). The number of CFU mL-1 was lower in semen doses without ATB stored at 5 and 10 °C than at 17 °C (P<0.05), but there was no difference among storage temperatures in doses with ATB (P>0.05). Acrosome and sperm membrane integrity were not influenced (P>0.05) by using ATB, but they were influenced by storage temperature (P<0,0001) In experiment 2, boars were grouped in GOOD and POOR according to progressive motility in doses stored for up to 120 h at 5 °C. So, the effect of this classification on assessed variables, was investigated. Total motility was higher in doses stored at 17 °C than in doses without ATB stored at 5 °C (P<0.05). The percentages of progressive motility and normal acrosomes were higher in doses stored at 17 °C than in doses stored at 5 °C, with or without ATB (P<0.05). The number of CFU mL-1 was higher in doses without ATB than in remaining ones (P<0.05). Total and progressive motility were observed to be higher in GOOD than in POOR boars (P<0.05). There was no difference between groups of boars in acrosome and membrane integrity (P>0.05). Despite sperm quality was negatively affected by low temperatures, the storage of boar semen doses at 5 °C is possible, since sperm viability in vitro was maintained for up to 5 days, fulfilling the requirements of semen quality to be used in artificial insemination. Nevertheless, the use of semen doses without ATB will need optimization, since low storage temperatures decreased bacterial growth, but not completely inhibit it.

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility

Hyperthyroidism may lead to an increase in oxidative stress (OS) in testis, may cause male reproductive disorders, among them, the loss in the sperm quality. The effect of resveratrol (RSV) on sperm motility and on OS parameters in testis of euthyroid and hyperthyroid rats was investigated. Hyperthyroidism was induced by daily intraperitoneal injection (i.p.) of triiodothyronine (T3) (100 μg/kg, i.p.) for six weeks. After two weeks, concomitantly to T3 treatment, animals received daily injections of RSV at dose of 1 mg/kg e 10 mg/kg (i.p.) during four weeks, totaling six experimental weeks. At the end of experimental period animals were euthanized for removal of organs. Sperm of cauda epididymal was collected for sperm motility and morphology analysis Testis were homogenized for determination of lipoperoxidation by lipid hydroperoxides and thiobarbituric reactive substances (TBARS) levels; activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST); and non-enzimatic antioxidant glutathione (GSH). Hyperthyroid rats presented lower sperm motility, higher lipid hydroperoxides and TBARS levels, lower CAT and GPx activities and higher GST activity in testis than animals of control groups. RSV treatment at doses of 1 mg/kg and 10 mg/kg was able to prevent the loss on sperm motility induced by hyperthyroidism. In addition, RSV decreased lipid hydroperoxides and TBARS levels; reversed the decrease in CAT and GPx activities; and also prevented the increase in GST activity caused by hyperthyroidism in adult rat testis. Together these data show the protective effect of RSV in the testis, preserving sperm motility, and protecting testis against oxidative damage caused by hyperthyroidism, which suggests the RSV as a possible target of studies in the search for therapeutic strategies in order to preserve testicular function. / O hipertireoidismo pode levar ao aumento do estresse oxidativo (EO) nos testículos, podendo causar desordens na função reprodutiva masculina, entre elas, a perda na qualidade espermática. Este estudo avaliou o efeito do resveratrol (RSV) na qualidade espermática e em parâmetros de EO no testículo de ratos eutireóideos e hipertireóideos. O hipertireoidismo foi induzido pela injeção intraperitoneal (i.p) diária de triiodotironina (T3) (100 μg/kg) durante seis semanas. Após duas semanas do início do experimento, concomitante ao tratamento com T3, os animais começaram a receber injeções diárias de RSV nas doses de 1 mg/kg ou 10 mg/kg (i.p.) por quatro semanas, totalizando as seis semanas de tratamento. No final do período experimental, os animais foram eutanasiados para retirada dos órgãos. Os espermatozóides da cauda do epidídimo foram coletados para análise de motilidade e morfologia. Os testículos foram homogeneizados para determinação da lipoperoxidação através dos níveis de hidroperóxidos lipídicos e de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS); da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa-S-transferase (GST); e dos níveis do antioxidante não-enzimático glutationa (GSH). Os ratos hipertireóideos apresentaram menor motilidade espermática, maiores níveis de hidroperóxidos lipídicos e de TBARS, menor atividade da CAT e da GPx e maior atividade da GST do que os animais dos grupos controle. O tratamento com RSV, nas doses de 1 mg/kg e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir a perda de motilidade espermática induzida no hipertireoidismo. Em adição, o RSV também diminuiu níveis de hidroperóxidos lipídicos e de TBARS; reverteu a diminuição na atividade da CAT e da GPx; além de prevenir o aumento na atividade da GST causado pelo modelo de hipertireoidismo em testículos de ratos adultos. Em conjunto estes dados mostram o efeito protetor do RSV no testículo, preservando a motilidade espermática e protegendo contra danos oxidativos causados pelo hipertireoidismo, o que sugere o RSV como um possível alvo de estudos na busca de estratégias terapêuticas com o objetivo de preservar a função testicular.

Made available in DSpace on 2017-07-10T18:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauricio Spagnolo Adames.pdf: 2594661 bytes, checksum: 4bbc4710428addfb51d141108a994f72 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effects of fructose as a modulator of sperm movement on the optimization of the sperm: oocyte in artificial reproduction procedures with the use of cryopreserved semen in Rhamdia quelen. Through the Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) were evaluated in four replicas the motility rates, speed and time of sperm activation of the cryopreserved semen after thawing (10 seconds after activation) into six activating solutions containing fructose, concentrated at 0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%. For the testing of fertilization an factorial experimental design (5 x 6) composed of five sperm:oocyte ratio (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), six activating solutions containing fructose (0.0; 0.9; 1.8; 2.7; 3.6 and 4.5%) and three replicas or experimental blocks ("pools" of oocytes from three female groups). The effects were evaluated over variable rates of fertilization, hatching and larval normality. In the evaluation of sperm variables a regression analysis showed effect (p<0,05) of the solutions in motility, speed and duration of sperm activation. It was also verified effect (p<0,05) in the index obtained from clustering of such variables called index of sperm movement, with results of theoretical peak performance when 2.85% of fructose in solutions was employed. In the fertilization assay the analysis of response surface showed interactive effect (p<0.05) between sperm:oocyte ratio and fructose concentrations in activating solutions, on the fertilization and hatching rates and of the clustering index of two variables called index of reproductive success. According to the statistical model, sperm:oocyte ratio can be reduced keeping up the rates of fertilization and hatching. The inclusion of fructose in activating solutions has promoted similar theoretical maximum levels for fertilization and hatching when compared to fertilization only in distilled water, however with a saving of 17.77% of mobile spermatozoa: oocyte. The larval normality showed effect (p<0.05) just for the block. It is concluded that the sperm:oocyte ratio can be reduced through the employment of fructose-based activating solutions, without affecting the fertilization, hatching rates and larval normality. / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da frutose como modulador do movimento espermático sobre a otimização da relação espermatozoide:ovócito em procedimentos de reprodução artificial com o uso do sêmen do Rhamdia quelen criopreservado. Através do Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) foram avaliadas em quatro réplicas a motilidade, a velocidade e o tempo de duração da ativação espermática do sêmen criopreservado após o descongelamento (10 segundos após a ativação) em seis soluções ativadoras contendo frutose na concentração de 0,0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%. Para o ensaio de fertilização foi aplicado um delineamento experimental em esquema fatorial (5 x 6) composto de cinco relações espermatozoides:ovocito (1x104, 3x104, 5x104, 7x104 e 9x104), seis soluções ativadoras contendo frutose (0; 0,9; 1,8; 2,7; 3,6 e 4,5%) e três replicas ou blocos experimentais ( pools de ovócitos provenientes de três grupos fêmeas). Os efeitos foram avaliados sobre as taxas de fertilização, eclosão e normalidade larval. Na avaliação das variáveis espermáticas, a análise de regressão mostrou efeito (p<0,05) das soluções na motilidade, velocidade e tempo de duração da ativação espermática. Também foi verificado efeito (p<0,05) no índice obtido pelo agrupamento destas variáveis, denominado de índice de movimento espermático, com resultados de máximo desempenho teórico quando empregado 2,85% de frutose na solução ativadora. No ensaio de fertilização a analise de superfície de resposta mostrou efeito interativo (p<0,05) entre a relação espermatozoides:ovócito e as concentrações de frutose das soluções ativadoras, sobre as taxas de fertilização e de eclosão e do índice de agrupamento das duas variáveis denominado índice de sucesso reprodutivo. De acordo com o modelo estatístico a relação espermatozoides:ovócito foi reduzida mantendo-se as taxas de fertilização e eclosão. A inclusão de frutose nas soluções ativadoras promoveu níveis máximos teóricos semelhantes para fertilização e eclosão quando comparada à fertilização apenas em água destilada, porém com uma economia de 17,77% de espermatozoides móveis. A normalidade larval apresentou efeito (p<0,05) apenas do bloco. Conclui-se que a relação espermatozóides:ovócito pode ser reduzida através do emprego de soluções ativadoras a base de frutose, sem causar prejuízos ás taxas de fertilização e eclosão e normalidade larval.