Mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada por uma deficiência na enzima a- L-iduronidase (IDUA), que está envolvida na metabolização de heparan e dermatan sulfato. Existem três fenótipos clínicos, que vão desde a forma grave, Hurler, caracterizada por anormalidades esqueléticas, hepatosplenomegalia e retardo mental grave. O fenótipo intermediário é caracterizado por um envolvimento somático progressivo, incluindo disostose múltipla, com pouco ou nenhum comprometimento neurológico. Já no fenótipo leve, ou Scheie, está presente doença cardíaca valvular, opacificação da córnea, limitadas anormalidades esqueléticas, mas ausência de retardo mental. Neste estudo, investigamos um grupo de 25 pacientes, diagnosticados com a MPS I, que foram inicialmente analisados para 6 mutações recorrentes, (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P e Q70X). Os pacientes não genotipados, após a análise das mutações conhecidas, foram analisados por SSCP e, aqueles com um padrão de migração de SSCP anormal foram seqüenciados. A análise mutacional confirmou uma elevada prevalência de W402X e P533R (28% e 18%). Os seqüenciamentos resultaram na identificação de cinco mutações previamente conhecidas e cinco mutações novas. O genótipo foi completamente definido em 60% (15/25) dos pacientes brasileiros e 76% dos alelos foram determinados. Assim, o nosso estudo mostrou que apesar da prevalência de W402X e P533R na população brasileira com MPS I, há ainda um grande número de mutações únicas para cada pacientes MPS I, ressaltando as dificuldades rastreio de mutações para esta desordem em populações mistas. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is caused by a deficiency of the enzyme a- L-iduronidase (IDUA), which is involved in the breakdown of dermatan and heparan sulphates. There are three clinical phenotypes, ranging from the severe Hurler form characterized by skeletal abnormalities, hepatosplenomegaly and severe mental retardation, to the milder Scheie phenotype in which there is cardiac valve disease, corneal clouding, limited skeletal problems, but no mental retardation. The intermediate form of MPS I (Hurler/Scheie) is characterized by progressive somatic involvement, including dysostosis multiplex, with little or no intellectual dysfunction. In this study, we have investigated a group of 25 patients, diagnosed with the MPS I that were screened for 6 known mutations (W402X, P533R, R383H, R89Q, A327P and Q70X). Patients not genotyped, after the analysis of known mutations, were analyzed by SSCP and those with an abnormal SSCP migration pattern were sequenced. Mutational analysis confirmed a high prevalence of W402X and P533R (28% and 18%). Sequecing resulted in the identification of five known mutations and five previously unknown sequence changes. The genotype was fully defined in 60% (15/25) of Brazilian patients and 76% of alleles was determined. In addition, our study has show that, despite the prevalence of W402X and P533R in the Brazilian MPS I population, there is still a large number of mutations unique to individual MPS I patients, highlighting the difficulties of mutation screening for this disorder in mixed populations.

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença lisossomal. A enzima envolvida com essa doença é a a-L-iduronidase (IDUA), e suas alterações levam a depósitos dos glicosaminoglicanos heparan e dermatan sulfato. As características fenotípicas da doença compreendem entre outras características malformações ósseas, hepatoesplenomegalia, problemas cardíacos, opacidade da córnea e retardo mental. O tratamento de MPS I atualmente se baseia em reposição enzimática e transplante de medula óssea. Levando em conta que esses tratamentos ainda não levam a uma correção dos danos ao sistema nervoso central (SNC), há necessidade do desenvolvimento de novos tratamentos para MPS I. Ainda outro problema da MPS I é a falta de estudos sobre os danos fisiológicos resultantes, principalmente no SNC. Visando contribuir com estes pontos, nosso trabalho teve como objetivo (a) o desenvolvimento de três vetores virais para posteriores ensaios pré-clínicos de terapia gênica e (b) o detalhamento da caracterização fisiopatológica de camundongos representando um modelo para MPS I, enfocando alguns aspectos do SNC. Foram produzidos três vetores virais com o cDNA da IDUA humana. O vetor baseado no vírus da imunodeficiência humana (HIV), apesar de baixos títulos virais, foi capaz de aumentar em até 60 vezes a atividade da IDUA nas células transduzidas. Um segundo vetor, baseado no vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) foi capaz de transduzir células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea do modelo murino de MPS I, sendo assim ótima ferramenta para terapia gênica ex vivo. O terceiro vetor, baseado no vírus da imunodeficiência felina (FIV) mostrou funcionalidade inferior quando comparado aos outros sistemas virais, e deve ser aperfeiçoado para utilização terapêutica. A caracterização do modelo foi feita através do estudo da fosforilação de proteínas de neurofilamentos em diferentes estruturas do cérebro de camundongos MPS I. Os resultados mostraram, além de alterações na fosforilação direta das proteínas analisadas, uma hiperfosforilação na ERK1/2 de córtex e hipocampo. Depósitos de gangliosídeos foram investigados de forma individual no cerebelo, córtex, hipocampo e hipotálamo, sendo detectadas diferenças específicas para cada estrutura. Ainda foram realizados estudos da neurotransmissão glutamatérgica e com isso foi identificada uma diminuição na captação de glutamato em hipocampo e córtex nos camundongos MPS I, além de uma diminuição no binding para glutamato no hipocampo. Como conclusão desses estudos, foram desenvolvidos vetores eficientes para transferência do gene terapêutico e, adicionalmente, os danos fisiológicos causados pela doença no SNC foram melhor elucidados no modelo murino de MPS I. As informações obtidas aqui serão de grande importância principalmente quando associadas a ensaios de terapia gênica, pois as características encontradas no SNC podem ser usadas para acompanhamentos de ensaios préclínicos usando os vetores desenvolvidos no trabalho. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a monogenic disease resulting from a defect in the gene that encodes the lysosomal hydrolase a-L-iduronidase (IDUA) and characterized by accumulation of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulfate. Phenotypic characteristics involve bone malformations, hepatosplenomegaly, heart problems, corneal opacity and mental retardation. Treatment of MPS I is currently based on enzymatic replacement and bone marrow transplantation. Since these treatments are not capable of correcting central nervous system (CNS) effects of the disease, new therapeutic approaches are needed. One of the problems in the investigation of MPS I is the paucity of studies about resulting physiological consequences, particularly those related to the CNS. Aiming to contribute to these aspects of MPS I, this study proposes (a) the development of three viral vectors to be used in gene therapy preclinical studies, and (b) the further investigation of physiopathological alterations in the CNS of a murine model of MPS I (MPS I mice). Three viral vectors, carrying the human IDUA gene, were produced. The vector based on the human immunodeficiency virus (HIV) was produced in low titers, but induced a 60-fold increase in the baseline activity of IDUA in transduced cells. A second vector, based on the Moloney murine leukemia virus (MoMLV), was capable to transduce mesenchymal stem cells isolated from the bone marrow of MPS I mice, representing an interesting tools for ex vivo gene therapy protocols. The third vector, was based on the feline immunodeficiency virus (FIV), was functionally inferior to the other two systems and needs optimization to be therapeutically useful. The model was characterized by the investigation of phosphorylation patterns of neurofilament proteins in different regions of the brain of MPS I mice. The results showed that, besides alterations in the direct phosphorylation profile of the proteins analyzed, ERK1/2 was hyperphosphorylated in the cortex and hippocampus. Ganglioside storage was individually investigated in the cortex, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, and specific differences were observed for each structure. An analysis of glutamatergic neurotransmission was also performed. MPS I animals showed a decrease in the glutamate uptake in the cortex and hippocampus. In addition, glutamate binding was decreased in the hippocampus. In conclusion, the present work resulted in the development of efficient viral vectors for the transfer of the therapeutic gene, and CNS physiological damages due to the disease were characterized in the murine model of MPS I. These results will be of great importance particularly when associated to gene therapy trials, since the CNS characteristics described in this work may be used for the follow-up of preclinical assays with the viral vectors developed.

Introdução: Não existem instrumentos específicos para avaliação da qualidade de vida (QV) de pacientes com Mucopolissacaridoses (MPS). Este estudo tem como objetivo apresentar as análises psicométricas das três versões do Mucopolissacaridose Quality of Life Questionnaire (MPS-QOL): Criança-CR (8-12 anos), Adolescente-ADOL (13-17 anos) e Adulto-ADU (≥ 18 anos), utilizados nas fase piloto e validação deste estudo. Métodos: Estudo transversal, multicêntrico, com amostragem por conveniência. A amostra foi composta por 53 pacientes (MPS I=8, MPS II=19, MPS III-A=1, MPS III-B=2, MPS IV-A=6, MPS VI=14; presença de envolvimento cognitivo= 21; sexo masculino=35; crianças=22; adolescentes=16; adultos=15) no estudo piloto e por 110 pacientes (MPS I=15, MPS II=27, MPS IV-A=27, MPS VI=34; Crianças= 42, Adolescentes= 33, Adultos=35) na fase de validação, para esta última etapa ainda foram incluídos 72 pacientes com outras oenças genéticas (Fenilcetonúria=27; Doença de Gaucher=13; Osteogênese Imperfeita=32). No estudo piloto, os pacientes ou seus responsáveis responderam uma das três versões do questionário MPS-QOL e um questionário genérico para avaliação de QV (crianças= CHQ-PF50; adolescentes e adultos= WHOQOL-BREF-DIS no estudo piloto; crianças e adolescentes=PedsQol específico para cada faixa etária e adultos= WHOQOL-BREF-DIS). Realizou-se a análise de frequência dos dados por efeito ceilling, floor e missing, confiabilidade interna através do Alfa de Cronbach, validade convergente entre o MPS-QOL e os outros instrumentos pelo Teste de Correlação de Spearman e validade discriminante através do Teste Mann-Whitney para ambas as fases. Resultados: A análise de frequência das questões indicou a exclusão de questões para os três instrumentos (MPS-QOL CR= 22; ADO=24; ADU= 21 no estudo piloto; MPS-QOL CR= 03; ADO=03; ADU= 06 na fase validação). A confiabilidade interna foi superior a 0,70 para os três questionários na fase piloto; e no estudo de validação foi maior do que 0,70 a MPS-QOL CR e MPS-QOL ADU. Análise da validade convergente sugeriu que os instrumentos de MPS-QOL ADOL e ADU são semelhantes aos do WHOQOL-BREF-DIS para ambas as fases do presente estudo. A validade discriminante demonstrou que os instrumentos MPS-QOL conseguiram discriminar quais questionários foram respondidos pelos pacientes e por Proxy no estudo piloto; no estudo de validação o MPS-QOL foi capaz de discriminar as diferenças entre os tipos de MPS (Domínio Psicológico para MPS-QOL CR (p=0,035), grupo de pacientes (MPS x controles; Domínio Físico para MPS-QOL CR (p=0,004), MPS-QOL ADOL (p=0,001) e MPS-QOL ADU (p=0,001) e Domínio Social para MPS-QOL ADU (p=0,007) e tratamento por TRE (Domínio Psicológico para MPS-QOL CR (p=0,027) e MPS-QOL ADU (p=0,038). Conclusões: Os resultados do estudo piloto e de validação sugerem que os instrumentos MPS-QOL são confiáveis para avaliar a QV de pacientes brasileiros com MPS I, II, IV-A e VI. / Introduction: There are no specific instruments to assess the quality of life (QOL) of patients with Mucopolysaccharidosis (MPS). The present study reports the results of psychometric analysis of the three versions of the Mucopolysaccharidosis Quality of Life Questionnaire (MPS-QOL): Child-CH (8-12 years), Adolescent-ADOL (13-17 years) and Adult-ADU (≥ 18 years), used in the pilot phase and validation of this study. Methods: Cross-sectional multicenter study with convenience sampling. The sample comprised 53 patients (MPS I=8, MPS II=19, MPS III-A = 1, MPS III-B=2, MPS IV-A=6, MPS VI=14; presence of cognitive involvement=21 ; male=35; children=22; adolescents=16; adults=15) in the pilot study and 110 patients (MPS I=15, MPS II=27, MPS IV-A=27, MPS VI=34; children=42, adolescents=33, adults=35) in the validation phase, 72 patients with other genetic disorders were also included in this last stage (Phenylketonuria=27; Gaucher Disease=13; Osteogenesis Imperfecta=32). In the pilot study, patients or their legal guardians answered one of the three versions of the MPS-QOL questionnaire and a generic questionnaire to evaluate QOL (children= CHQ-PF50; adolescents and adults= WHOQOL-BREF-DIS in the pilot study, children and adolescents= PedsQol specific for each age group, and adults= WHOQOL-BREF-DIS). Frequency of data analysis for ceiling, floor, and missing effect, internal reliability using Cronbach's Alpha, convergent validity between the MPS QOL and other instruments using the Spearman correlation test, and discriminant validity using the Mann-Whitney test for both phases were done. Results: The frequency analysis of the questions indicated the exclusion generic questions for the three instruments (MPS-QOL CH= 22; ADO= 24; ADU= 21 in the pilot study; MPS-QOL CH= 03; ADO= 03; ADU= 06 in the validation phase). Internal consistency was above 0.70 for the three questionnaires in the pilot phase; and in the validation study it was higher than 0.70 for MPS-QOL CR and MPS-QOL ADU. Analysis of convergent validity suggested that MPS-QOL ADOL and ADU instruments are similar to the WHOQOL-BREF-DIS for both stages of the present study. Discriminant validity demonstrated that the MPS-QOL instruments were able to discern which questionnaires were completed by patients themselves and those completed by Proxy in the pilot study. The validation study showed that the MPS-QOL instruments were able to detect the differences between MPS types (Psychological Domain for MPS-QOL CH (p=0.035), group of patients (MPS x non-MPS; Physical Domain for MPS-QOL CH (p=0.004), MPS-QOL ADOL (p=0.001) and MPS-QOL ADU (p=0.001), and Social Domain for MPS-QOL ADU (p=0.007) and treatment with ERT (Psychological Domain for MPS-QOL CH (p=0.027), and MPS-QOL ADU (p=0.038). Conclusions: The results of the pilot and validation study suggest that MPS-QOL instruments are reliable to evaluate the QOL of Brazilian patients with MPS I, II, IV-A and VI.

Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença de acúmulo lisossomal que leva a neurodegeneração e déficits neurológicos, entre outras conseqüências patológicas e clínicas. A ausência de estudos sobre parâmetros neurocomportamentais do modelo murino de MPS I capazes de avaliar sua função cognitiva motivou a realização deste trabalho. O primeiro nosso objetivo foi analisar parâmetros cognitivos que possam ser utilizados na avaliação de diferentes terapias e seus efeitos sobre o SNC. Durante a exploração do campo aberto, camundongos MPS I (Idua-/-) adultos mostraram locomoção e ansiedade normais, mas reduzido número de rearings. Camundongos Idua-/- tiveram uma performance normal no reconhecimento de objeto novo e mostraram memória de curta duração de esquiva inibitória normal. Entretanto a memória de longa duração de esquiva inibitória estava prejudicada. O déficit observado na esquiva inibitória não pode ser atribuído a redução na reatividade ao choque. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- apresentam um déficit na memória de longa duração para treinamento aversivo e comportamento exploratório. O segundo objetivo foi avaliar biomarcadores de estresse oxidativo neste modelo animal. Nós avaliamos atividade enzimática antioxidante, dano a proteínas e peroxidação lipídica no telencéfalo, cerebelo, coração, pulmão, diafragma, fígado, rim, e baço. De oito órgãos analisados, sete tiveram alteração em no mínimo um parâmetro. Os resultados indicam que camundongos Idua-/- podem estar sofrendo estresse oxidativo. / Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is a lysosomal storage disease that leads to neurodegeneration and neurological deficits, among other pathological and clinical consequences. The absence of behavioral parameters from the MPS I mouse model motivated the accomplishment of this work. Our first objective was to analyze behavioral parameters that might be used to essay the effect of different therapies on the CNS. During exploration of an open field, adult MPS I (Idua-/-) mice showed normal locomotion and anxiety, but reduced number of rearings. Idua-/- mice performed normally in a novel object recognition memory task and showed normal short-term retention of inhibitory avoidance training. By contrast, long-term retention of inhibitory avoidance was impaired. The deficit in inhibitory avoidance memory could not be attributed to reduced footshock reactivity. The results indicate that Idua-/- mice present deficits in long-term memory for aversive training and reduced exploratory behavior. The second aim was to evaluate oxidative biomarkers on this mice model. We evaluated antioxidant enzymatic activity, protein damage and lipid peroxidation on forebrain, cerebellum, heart, lung, diaphragm, liver, kidney and spleen. From eight analyzed organs, seven had alteration on at least one parameter. The results indicate that Idua-/- mice can be under oxidative stress.

A Incontinência Pigmentar (IP) é uma genodermatose multissistêmica rara caracterizada por diferentes manifestações clínicas que incluem anormalidades de pele, dentes, cabelos, unhas, olhos e sistema nervoso central. A doença tem um padrão de herança ligado ao X dominante, com letalidade no sexo masculino. A IP é causada por mutações no gene IKBKG, que codifica a subunidade regulatória de um complexo necessário para ativação do fator nuclear kB (NF-kB), envolvido em diferentes funções fisiológicas e patológicas essenciais, incluindo a sobrevivência celular. Cerca de 70-80% dos pacientes com IP carregam um rearranjo recorrente no lócus de IKBKG: a deleção dos éxons 4-10 do gene (IKBKGdel). O objetivo do presente estudo é investigar em uma série de casos de IP a prevalência da deleção recorrente, os achados clínicos associados e as histórias genéticas familiares. O estudo molecular incluiu 36 indivíduos, sendo 23 pacientes diagnosticados com IP (11 casos-índice e 12 familiares) e mais 13 familiares não-afetados. A prevalência da deleção IKBKGdel na amostra (73%) está de acordo com o relatado na literatura, indicando que, independente da origem étnica, essa é a principal mutação em IKBKG. As manifestações clínicas dos pacientes estão de acordo ao descrito em estudos prévios e apontam a importância de avaliações específicas que visem aos principais sinais da IP. A alta variabilidade clínica familiar indica uma ausência de correlação genótipo-fenótipo e sugere que outros fatores devem desenvolver um papel importante para a severidade da doença. Nós demonstramos, pela primeira vez, um desvio da proporção esperada pela segregação Mendeliana de meninos:meninas e meninas afetadas:não-afetadas nos casos familiares, indicando uma aparente transmissão preferencial do alelo IKBKG mutado. Estudos adicionais serão importantes para comprovar esse achado. Esse é o primeiro estudo genético em IP realizado no Brasil e contribui para a compreensão das bases genética e clínica envolvidas. / Incontinentia Pigmenti (IP) is a rare multisystem genodermatosis characterized by several clinical manifestations, including abnormalities of skin, teeth, hair, nail, eyes and central nervous system. The disease is X-linked dominant and lethal in males. IP occurs due to mutations in IKBKG gene, which encodes the regulatory subunit of a complex required for nuclear factor kB (NF-kB) activation, involved in many essential physiological and pathologic functions, including cell survival. Around 70-80% of IP patients carry a recurrent rearrangement in IKBKG locus: the exon 4-10 deletion (IKBKGdel). Our aim was to investigate in a case series of IP the recurrent deletion prevalence, the associated clinical findings and the familial genetic histories. The molecular study included 36 individuals, being 23 IP patients (11 index-cases and 12 relatives) and 13 non-affected relatives. The IKBKGdel prevalence in our sample (73%) is in accordance to that reported in literature, indicating that, irrespectively of ethnical origin, this is the major mutation in IKBKG. The clinical manifestations from our IP patients are consistent to those described in previous studies and point out the importance of a specific examination looking for the most prevalent IP signs. The high observed clinical intrafamilial variability indicates a lack of genotype-phenotype correlation and suggests that other factors might play an important role to disease’s severity. We show, in first instance, a deviation in the expected Mendelian proportion of male:female ratio and, among female, the affected:non-affected ratio in familial cases, indicating an apparent preferential transmission of the mutated IKBKG allele. studies are important to verify this finding. This is the first Brazilian genetic study in IP and it contributes to the understanding of the genetic and clinical bases involved.

A mucopolisacaridoses tipo I é uma doença lisossomal com características multisistêmicas. No sistema cardiovascular observa-se aumento do coração, disfunção das válvulas cardíacas, rigidez e dilatação aórtica. Trabalhos anteriores demonstraram que camundongos MPS I superexpressam catepsina B em múltiplos tecidos, incluindo aqueles do sistema cardiovascular. Neste trabalho hipotetizamos que a catepsina B poderia melhorar as anormalidades encontradas no coração, aorta e valvas de animais com MPS I . Em primeiro lugar, encontramos que a atividade de elastase total em aortas MPS I era elevada. Também, demostramos a ocorrência de liberação de catepsina B dos lisossomos em fibroblastos MPS I, o que poderia degradar os componentes da matriz extracelular da aorta, do coração e das válvulas cardíacas. Em seguida, utilizamos um inibidor de catepsina B in vivo em camundongos MPS I. Após 4 meses de tratamento, a inibição parcial de atividade catepsina B em camundongos tratados reduziu a dilatação da aorta, bem como o espessamento da válvula cardíaca e levou a melhorias nos parâmetros ecocardiográficos, porém nenhum destes parâmetros foram completamente normalizados. Com base nestes resultados, concluímos que as alterações no lisossomo nesta doença levam ao escape de catepsina B para fora da organela, onde esta proteína pode ter múltiplas funções patológicas. A atividade catepsina B pode ser, pelo menos em parte, responsável pelas anormalidades cardiovasculares observadas nesta doença. Este estudo destaca, pela primeira vez, a possibilidade de utilizar inibidores de catepsina como agente terapêutico numa doença de depósito lisossomal. / Mucopolysaccharidosis type I is a lysosomal storage disorder with multisystemic features, including heart enlargement, heart valve dysfunction, and aortic stiffness and dilatation. Previous studies have shown that MPS I mice overexpress cathepsin B in multiple tissues, including those from the cardiovascular system. Here we hypothesized that inhibiton of cathepsin B could ameliorate heart, aorta and valve abnormalities found in MPS I. Firstly we found that total elastase activity in MPS I aorta is elevated. Following that, we demonstrated that cathepsin B leaks from the lysosome in MPS I fibroblasts, and therefore could be degrading extracellular matrix components from aorta, heart, and heart valves. We then used a cathepsin B inhibitor in vivo in MPS I mice. After 4 months of treatment, partial inhibition of cathepsin B activity in treated mice reduced aortic dilatation, as well as heart valve thickening and lead to improvements in echocardiographic parameters, although none of these were completely normalized. Based on these results, we conclude that alterations in the lysosome in this disease lead to leakage of cathepsin B to outside the organelle, where this protein can have multiple pathological roles. Cathespin B activity may be, at least in part, responsible for the cardiovascular abnormalities observed in this disease. This study highlights for the first time the possibility of using cathepsin inhibitors as a therapeutic agent in a lysosomal storage disease.

Existe um interesse crescente pelo controle das condições de cultivo necessárias para a expansão de células-tronco de indivíduos adultos devido ao grande potencial para o desenvolvimento de pesquisa básica e de aplicações terapêuticas apresentado pelas mesmas. Atualmente, a literatura apresenta poucos trabalhos que detalhem a biologia da célula-tronco mesenquimal (MSC) de camundongo, revelando a necessidade de estudos voltados para este tema. Quatro culturas de longa duração foram produzidas com células da medula óssea de camundongos normais e IDUA knock-out através de técnicas de cultivo relativamente simples. Estas culturas puderam ser mantidas por até 40 passagens, e demonstraram ser morfologicamente homogêneas. Células dessas culturas puderam ser induzidas a diferenciarem-se ao longo de vias de diferenciação adipogênica e osteogênica, e revelaram ser capazes de suportar o crescimento e a proliferação de células-tronco hematopoiéticas. Por apresentarem tais características funcionais, essas populações celulares foram operacionalmente definidas como MSCs. Quando o repertório de marcadores de superfície dessas células foi observado por meio de citometria de fluxo, verificou-se que elas eram positivas para Sca-1, CD29, CD44 e CD49e, e eram negativas para CD11b, CD13, CD18, CD19, CD31, CD45, CD49d e Gr-1 Este perfil de moléculas de superfície assemelha-se àquele descrito para a MSC humana, e indica ausência de contaminantes hematopoiéticos. Uma verificação preliminar da freqüência da MSC na medula óssea de camundongo foi realizada, trazendo a estimativa de que uma MSC está presente numa faixa de 11.000 – 27.000 células. Finalmente, os dados revelaram que não há diferenças imediatamente perceptíveis entre camundongos normais e do modelo murino de MPS I no tocante à MSC, o que indica que os trabalhos futuros visando à correção da deficiência de α-L-iduronidase neste modelo utilizando a MSC são viáveis. O estabelecimento da metodologia para o cultivo e expansão da MSC murina através de técnicas simples vem preencher uma lacuna existente no campo dos modelos experimentais animais, trazendo novas perspectivas para o desenvolvimento de estratégias de terapia celular/genética em modelos experimentais murinos.

A Mucopolissacaridose do tipo I (MPS I) é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da hidrolase lisossomal α-L-iduronidase (IDUA, EC 3.2.1.76). Essa deficiência leva ao acúmulo progressivo dos glicosaminoglicanos (GAGs) heparan e dermatan sulfato nos tecidos com subsequente alteração da função celular e dano em múltiplos órgãos. Existem evidências na literatura de que a introdução precoce da Terapia de Reposição Enzimática (TRE) leva a um melhor prognóstico, principalmente para pacientes com a forma grave da doença (Síndrome de Hurler), prevenindo ou minimizando danos irreversíveis. Tendo em vista que a maioria dos pacientes brasileiros com MPS I é diagnosticada tardiamente e não recebe tratamento imediato, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da TRE na reversibilidade dos sintomas no modelo murino de MPS I. Animais com MPS I foram tratados dos 6 aos 8 meses com laronidase na dose de 1,2mg/kg a cada duas semanas e comparados com camundongos normais e MPS I não tratados de 8 meses. A TRE tardia foi efetiva na redução de GAGs urinários e viscerais. Apesar da normalização dos GAGs do miocárdio e da fração de encurtamento ventricular esquerda, a função cardíaca não foi completamente restaurada. A fração de ejeção ventricular esquerda e a razão entre aceleração e ejeção na artéria pulmonar dos camundongos tratados atingiram apenas níveis intermediários entre camundongos normais e não tratados. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na espessura da parede da aorta, mas as válvulas cardíacas foram significativamente reduzidas no grupo tratado. Uma grande variabilidade nos resultados dos testes comportamentais foi encontrada nos animais tratados. Esse achado não pode ser correlacionado com nenhuma outra variável como níveis de GAGs ou atividade de catepsina D no córtex cerebral, além da função cardíaca ou formação de anticorpos. Todos os animais que receberam laronidase desenvolveram anticorpos contra a enzima, sem que os níveis de anticorpos apresentassem correlação com os outros parâmetros analisados. Em conclusão, a administração da TRE tardia melhora diversos aspectos da doença e deve ser considerada sempre que possível. / Mucopolysaccharidosys type I (MPS I) is a rare disorder caused by deficiency of the lysosomal hydrolase α-L-iduronidase (IDUA, EC 3.2.1.76). This deficiency leads to progressive storage of glycosaminoglycans (GAGs) heparan and dermatan sulphate, with subsequent disturbances in cell function and multiorgan damage. There is a consensus in the literature that early Enzyme Replacement Therapy (ERT) leads to a better outcome, particularly in patients with the severe form of the disease (Hurler syndrome), preventing or minimizing irreversible damage. Since most Brazilian patients are diagnosed late and don’t receive immediate treatment, the aim of this study was to evaluate the effects of late ERT on symptom reversibility in a MPS I murine model. We treated 10 MPS I mice from 6 to 8 months (ERT 6-8mo) with 1.2mg laronidase/kg every 2 weeks and compared to 8 months-old wild-type (Normal) and untreated animals (MPS I). Late ERT was effective reducing urinary and visceral GAGs to normal levels. Although myocardium GAGs and left ventricular (LV) shortening fraction were normalized, cardiac function wasn’t completely restored. LV ejection fraction and acceleration/ejection ratio at the pulmonary valve reached intermediary levels between normal and untreated MPS I mice. While no significant results were found on aortic wall width, heart valves were significantly smaller in the ERT 6-8mo than in untreated mice. A wide variability was found on the behavior tests of treated animals. No correlation was found between this finding and any other variable, such as GAG levels, cerebral cortex cathepsin D activity, heart function or antibody formation. All animals treated with laronidase developed antibodies against the enzyme but no correlation was found with other parameters analyzed. In conclusion, late ERT improves many aspects of the disease and should be considered whenever possible.

Realizamos um estudo observacional de pacientes com mucopolissacaridose tipo VI, com o objetivo de determinar o perfil epidemiológico, clínico e bioquímico de um grupo de pacientes sul-americanos a fim de contribuir em estudos futuros de correlação genótipo-fenótipo e de avaliação de protocolos clínicos. Os critérios de inclusão foram: ter 4 anos ou mais e confirmação bioquímica da doença (níveis reduzidos da atividade da ARSB, aumento de GAGs urinários e atividade normal de outra sulfatase). Os critérios de exclusão foram: terapia com reposição enzimática atual ou prévia ou ter realizado transplante de medula óssea. Foram avaliados 28 pacientes por anamnese, exame físico, acocardiograma, eletrocardiograma, avaliação oftalmológica, medidas de glicosaminoglicanos urinários e da atividade da N-acetilgalactosamina-4-sulfatase em leucócitos. A amostra estudada tinha 92,9% de brasileiros, sendo 53,8% da região sudeste. No momento da avaliação, a média de idade foi de 97,1 meses e a média de idade ao diagnóstico foram de 48,4 meses. Em 88% da amostra os sintomas iniciaram com menos de 36 meses e em 27% das famílias houve relato de consangüinidade entre os pais. A média de peso e estatura ao nascimento foi de 3481 gramas e 51,3 centímetros, respectivamente. Da amostra, 57,1% nasceram de parto vaginal. Todos apresentavam alguma alteração ecocardiográfica, bem como opacificação corneana. As manifestações clínicas mais freqüentes foram: baixa estatura, opacificação corneana, facies grosseira, contraturas articulares e mãos em garra. A média da atividade enzimática em leucócitos foi de 5,4 nmoles/h x mg proteína e a excreção urinária de glicosaminoglicanos foi, em média, 7,9 vezes superior ao normal. O número de manifestações clínicas citadas não apresentou correlação significativa com a idade, com a excreção urinária de GAGs ou com a atividade enzimática em leucócitos. Também não houve correlação significativa entre a excreção urinária de GAGS e a atividade enzimática. Concluímos que a MPS VI é uma patologia com alta morbidade e que, comparados com a literatura, os pacientes da nossa amostra têm um diagnóstico tardio e maior freqüência de alterações cardiológicas. / An observational study of South-American patients with mucopolysaccharidosis type VI was carried out, aiming at determining their epidemiological, clinical and biochemical profile, and, to evaluate the correlation of signs/ symptoms reported with present age and biochemical findings (urinary excretion of GAGs and ARSB activity in lekocytes), so that it can serve as basis for future studies of the genotype-phenotype correlation and for protocols of future clinical studies. Each individual needed to meet the inclusion criteria: the signing of an informed term consent; age of four years or older; biochemical confirmation of the disease (reduction in level of ARSB activity and the increase in the levels of GAGs in urine, and a normal activity of another sulfatase). The exclusion criteria were: previous bone marrow transplant; previous or present enzyme replacement therapy. Twenty-eight patients were evaluated through anamnesis, physical examination, echocardiogram, electrocardiogram, ophthalmologic evaluation, and measurements of glycosaminoglycan levels in urine and of the activity of N-acetylgalactosamine-4-sulfatase (ARSB) in leukocytes. Of the sample studied, 92.9% were Brazilian, being 53.8% from the Brazil’s Southeast region. Mean age at evaluation was 97.1 months and at diagnosis 48.4 months. For 88% of patients, the onset of symptoms was before the age of 36 months, and in 27% of cases parental consanguinity was reported. Mean weight and height at birth were 3481 g and 51.3 cm, respectively. Birth was through vaginal delivery in 57.1% of cases. All patients presented some echocardiographic finding, as well as corneal clouding. The most frequently reported signs and symptoms were: short stature, corneal clouding, coarse facial features, joint contractures, and claw hands. Mean ARSB activity in leukocytes was 5,4 mmoles/h/mg prot. (rv: 72–174), and urinary excretion of glycosaminoglycans was, on average, 7.9 times higher than normal. The number of signs and symptoms reported has not shown a significant correlation with the age with the excretion of glycosaminoglycans nor with the level of enzyme activity in leukocytes. Also, no significant correlation was found between the excretion of glycosaminoglycans and the level of enzyme activity. It was concluded that MPS VI has high morbidity and that, when compared with data published in the literature, patients in our study had a later diagnosis and a higher frequency of cardiologic findings.

Existe um interesse crescente pelo controle das condições de cultivo necessárias para a expansão de células-tronco de indivíduos adultos devido ao grande potencial para o desenvolvimento de pesquisa básica e de aplicações terapêuticas apresentado pelas mesmas. Atualmente, a literatura apresenta poucos trabalhos que detalhem a biologia da célula-tronco mesenquimal (MSC) de camundongo, revelando a necessidade de estudos voltados para este tema. Quatro culturas de longa duração foram produzidas com células da medula óssea de camundongos normais e IDUA knock-out através de técnicas de cultivo relativamente simples. Estas culturas puderam ser mantidas por até 40 passagens, e demonstraram ser morfologicamente homogêneas. Células dessas culturas puderam ser induzidas a diferenciarem-se ao longo de vias de diferenciação adipogênica e osteogênica, e revelaram ser capazes de suportar o crescimento e a proliferação de células-tronco hematopoiéticas. Por apresentarem tais características funcionais, essas populações celulares foram operacionalmente definidas como MSCs. Quando o repertório de marcadores de superfície dessas células foi observado por meio de citometria de fluxo, verificou-se que elas eram positivas para Sca-1, CD29, CD44 e CD49e, e eram negativas para CD11b, CD13, CD18, CD19, CD31, CD45, CD49d e Gr-1 Este perfil de moléculas de superfície assemelha-se àquele descrito para a MSC humana, e indica ausência de contaminantes hematopoiéticos. Uma verificação preliminar da freqüência da MSC na medula óssea de camundongo foi realizada, trazendo a estimativa de que uma MSC está presente numa faixa de 11.000 – 27.000 células. Finalmente, os dados revelaram que não há diferenças imediatamente perceptíveis entre camundongos normais e do modelo murino de MPS I no tocante à MSC, o que indica que os trabalhos futuros visando à correção da deficiência de α-L-iduronidase neste modelo utilizando a MSC são viáveis. O estabelecimento da metodologia para o cultivo e expansão da MSC murina através de técnicas simples vem preencher uma lacuna existente no campo dos modelos experimentais animais, trazendo novas perspectivas para o desenvolvimento de estratégias de terapia celular/genética em modelos experimentais murinos.