Gracias a su acción como biocida, el tributilestaño (TBT) ha sido ampliamente utilizado en pinturas anti-incrustantes. Por un lado, su aplicación ha dado lugar a enormes ahorros para el sector del transporte marítimo; sin embargo, por otro, ha generado un grave problema para los ecosistemas marinos debido a su persistencia y toxicidad en el medio. Una vez liberado en el agua, el TBT puede sufrir, rápidamente, distintos procesos de adsorción/desorción y acumularse en el sedimento y la biota. Además, puede degradarse a di y monobutilestaño (DBT y MBT, respectivamente) a través de diversos procesos entre los que se destaca la biodegradación producida por ciertos microrganismos (bacterias, microalgas y hongos). A causa de los daños que puede causar en el medio marino, diversos países han impuesto regulaciones para controlar el uso del TBT en la formulación de pinturas anti-incrustantes para embarcaciones. En Argentina, la institución que regula el transporte marítimo (Prefectura Naval Argentina) prohibió en 1998 el uso de pinturas anti-incrustantes a base de TBT en todos los tipos de buques (Ordenanza nº 4/98). En este trabajo de Tesis se evaluó la presencia y distribución de los compuestos organoestánnicos (OTC, por sus siglas en inglés) en distintas muestras del estuario de Bahía Blanca (sedimentos, agua, material particulado en suspensión (MPS) y moluscos bivalvos), teniendo en cuenta sitios fuertemente antropizados (por ej., zonas portuarias y cercanas a diques secos) y sitios libres de intervención (por ej., islotes de la reserva ambiental). El pretratamiento de las muestras de sedimento superficiales, MPS y moluscos bivalvos autóctonos (mejillín, Brachidontes rodriguezii), se llevó a cabo aplicando energía de ultrasonido en las etapas de extracción y derivatización. De esta manera, se logró disminuir considerablemente el tiempo de análisis, obteniendo mejores parámetros analíticos con respecto al método convencional (UNEP/IOC/IAEA, 1994). El tratamiento de las muestras de agua se llevó a cabo mediante una extracción líquido-líquido empleando hexano para extraer los analitos derivatizados. La determinación cuantitativa de los compuestos estudiados se realizó mediante cromatografía gaseosa acoplada a detector de masas (GC-MS). Los resultados indican que todas las muestras y sitios evaluados han sido impactadas por la presencia de TBT, DBT y MBT. También, ha quedado demostrado, que en algunos casos existe una variabilidad estacional con respecto a las concentraciones de los OTC, y que la distribución de estos compuestos está influenciada por ciertas variables fisicoquímicas (salinidad, temperatura, turbidez y materia orgánica). Se estima que, en general, el ingreso de TBT al estuario de Bahía Blanca es antiguo y se encuentra bajo un proceso de degradación general. Esta degradación, parece ser acelerada por la presencia de una elevada concentración de biomasa fitoplanctónica, característica del área de estudio. Por último, a lo largo del estuario parecen existir fuentes adicionales de DBT y MBT, más allá de la degradación natural a partir de TBT. Algunas posibles fuentes difusas de estos compuestos son las aguas residuales domésticas, lodos de depuradora, efluentes industriales (relacionados con la planta de PVC), así como también, la lixiviación de DBT y MBT de las cañerías de distribución de agua y de desagüe que están fabricadas de PVC. / Organotin compounds, particularly tributyltin (TBT), have been widely used as antifouling paints for the skulls of different kind of boats. Using TBT has been financially advantageous for the seaborne trade. However, it has also generated a severe damage for the maritime ecosystem, mainly due to both its persistence and toxicity. Once released into the water, the TBT may rapidly undergo adsorption/desorption processes and, then, accumulate within the sediments and biota. Also, this compound can be degrade to other less substituted organotin compounds, such as di- and monobutyltin (DBT and MBT, respectively) throughout different processes, being the biodegradation (by bacteria, microalgae and fungi) the most important one. Several countries have enacted regulations to control and monitor the use of TBT in antifouling paints formulations in order to preserve the marine environment. Prefectura Naval Argentina, in 1998, banned the use TBT-based antifouling paints in all kind of boats (Ordinance nº 4/98). This Thesis evaluates the presence and distribution of organotin compounds (OTC) in different samples (sediments, water, suspended particulate matter (SPM) and mussels) in the Bahía Blanca estuary. The sites studied have been either strongly affected by anthropogenic activities –such as ports and dry docks– or relatively free from human intervention (small islands in the natural reserve). The OTC pretreatment of all surface sediment, SPM and mussel samples (Brachidontes rodriguezii) was performed by application of ultrasound in both extraction and derivatization steps. In this way, the time analysis was considerably reduced and the analytical performance was also improved respect to the conventional method (UNEP/IOC/IAEA, 1994). The pretreatment of water samples was carried out by liquid-liquid extraction with hexane. The OTC determination was conducted using gas chromatography coupled to mass detector (GC-MS). The obtained results show that all the samples in all the studied sites have been impacted by the pollution of TBT, DBT and MBT. Also, a seasonal variability was observed in the OTC concentrations and the distribution of these compounds is affected by certain physicochemical variables such as salinity, temperature, turbidity and organic matter content. The presence of TBT in the Bahía Blanca estuary could be considered, in a global way, as ʹoldʹ pollution. Moreover, this compound seems to be under a general degradation process, which could be accelerated by the presence of large amounts of phytoplanctonic biomass, typical of this area. Finally, other additional sources of DBT and MBT seem to contribute to the total amount of these pollutants in the estuary, beyond the amounts derived of the TBT degradation. Sources such as domestic wastes, sewage sludges, industrial efluents (related to the PVC plant) and the lixiviation from water and drain pipes, could be pointed out as examples.

Los contaminantes emergentes (CECs, por sus siglas en inglés) son sustancias, productos y materiales químicos que se esparcen en el ambiente y se detectan, con frecuencia, en suelos y aguas superficiales, subterráneas y potables. Debido a la alta y continua producción de estas sustancias y su consumo masivo, es inevitable su continua introducción al ambiente, principalmente a través de efluentes industriales y plantas de tratamiento de aguas residuales. Si bien la presencia de estos CECs no es reciente, sí lo es la preocupación por las posibles consecuencias de los mismos en seres vivos. Por ello, es de suma importancia la determinación de estos contaminantes en matrices ambientales. Esta Tesis se centró en el desarrollo de nuevos métodos analíticos para la extracción y preconcentración de CECs en muestras ambientales. En el primer trabajo, se desarrolló un método de microextracción coacertiva para la determinación fluorescente de glibenclamida. El segundo trabajo consistió en la utilización de técnicas en flujo y de extracción en fase sólida miniaturizada para la extracción y preconcentración de progestinas con su posterior separación y detección por HPLC-UV. En el tercer y cuarto trabajo se desarrollaron films de agarosa y nanopartículas a base de carbono para la extracción en fase sólida de antiinflamatorios no esteroideos y progestágenos, con su posterior separación y detección por HPLC-UV. Los métodos analíticos desarrollados durante esta Tesis Doctoral se enfocaron no sólo en lograr límites de detección apropiados para los analitos seleccionados, sino que proponen alternativas amigables con el ambiente a través de la miniaturización, automatización, uso de reactivos renovables y generación de menor cantidad de residuos tóxicos. / Emerging contaminants (ECs) are substances, products, and chemical materials that are spread in the environment and are frequently detected in soils, surface waters, groundwater, and drinking water. Due to their high and continuous production as well as their widespread use, these substances are inevitably introduced into the environment, primarily through industrial effluents and wastewater treatment plants. While the ECs’ presence is not recent, the concern for their potential consequences on living organisms is relatively recent. Therefore, the determination of these contaminants in environmental matrices is of importance. This thesis focused on the development of new analytical methods for the extraction and preconcentration of ECs in environmental samples. The first study involved the development of a novel coacervative microextraction method for the fluorescent determination of glibenclamide. The second research is based on flow and miniaturized solid-phaseextraction techniques for the extraction and preconcentration of progestins, followed by their separation and detection using HPLC-UV. In the third and fourth studies, agarose films and carbon-based nanoparticles sorbents were developed for the solid-phase extraction of non-steroidal anti-inflammatory drugs and progestogens, with subsequent separation and detection by HPLC-UV. The analytical methods developed during this thesis were focused not only on achieving appropriate detection limits for the selected analytes, but also on proposing environmentally friendly alternatives through miniaturization, automation, use of renewable reagents, and generation of less toxic waste.

Esta tesis pretende obtener datos de calidad para mejorar en el conocimiento del material particulado orgánico atmosférico. Este objetivo se logrará con el desarrollo o adecuación de diferentes metodologías analíticas que permitan la determinación de la composición química y de las propiedades físicas del material particulado atmosférico. Además, se estudiarán su emisión directa y formación a través de los procesos químicos que envuelven la degradación atmosférica de diferentes contaminantes Para ello, se emplearán cámaras de simulación atmosférica de alto volumen (fotoreactores EUPHORE) y se realizarán medidas de aire en diferentes localizaciones. Se han seleccionado diferentes compuestos de interés atmosférico en términos de impacto ambiental o de su utilidad como compuestos trazadores. El estudio de material particulado primario se centrará en los hidrocarburos aromáticos policíclicos. Estos compuestos son altamente cancerígenos y se emiten en los procesos de combustión incompleta. Un reto de la presente tesis es identificar y cuantificar estas especies presentes en las emisiones de motores diesel generadas en diferentes modos de operatividad y utilizando combustibles de diferente naturaleza en cuanto a su composición y/u origen. El estudio del material particulado secundario se enfocará al análisis de las reacciones de degradación atmosféricas de compuestos precursores de material particulado orgánico atmosférico - biogénicos y antropogénicos -. Esto implica diferentes ámbitos de trabajo desde el desarrollo de nuevas metodologías para el avance en la caracterización física y química de sus productos de degradación hasta el desarrollo y comprensión de los mecanismos químicos y de la reactividad de contaminantes una vez han sido liberados a la atmósfera. La estrategia a seguir es que todas las metodologías y procedimientos puestos a punto sean validadas y aplicadas a muestras obtenidas en las cámaras de simulación y a muestras ambientales - en localizaciones urbanas, semi-urbanas y rurales - para confirmar experimentalmente las propuestas realizadas sobre los procesos de degradación atmosférica y su relevancia ambiental. / Borrás García, EM. (2013). Caracterización de material particulado atmosférico generado en reactores fotoquímicos y procedente de muestras ambientales [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31645

Dentro de la problemática ambiental, los plaguicidas son, posiblemente, una de lasfamilias de contaminantes que más preocupan en la actualidad, debido a su toxicidad yelevado uso en todo el planeta, así como a la posibilidad de contaminación de distintos tipos de muestras (suelos, aguas, aire, productos alimenticios). El elevado número de plaguicidas actualmente en uso, junto con la gran variabilidad que presentan en cuanto a sus propiedades físico-químicas, dificulta de forma considerable su análisis a nivel de residuos. Aunque se han realizado numerosos estudios ambientales, la mayoría de programas de control de estos contaminantes, tanto en el medio ambiente, como en alimentos o seres vivos expuestos, se centran en tan sólo unos pocos productos (normalmente el plaguicida inalterado), a pesar de que se conocen algunos productos de transformación/metabolitos relativamente estables, persistentes y tóxicos.Esta carencia de información generalizada sobre la presencia de productos de transformación (TPs) en el medio ambiente es debida, principalmente, a la falta de metodología analítica. Así pues, parece necesario generar información sobre las rutas de degradación/transformación de estos compuestos, desarrollar metodología analítica que permita determinar sus niveles en el medio ambiente, así como evaluar su impacto en elmismo, especialmente en aguas superficiales y subterráneas. Para este fin, es necesario utilizar técnicas modernas y poderosas, en especial la espectrometría de masas, que en los últimos años se ha mostrado como una técnica indispensable en muchas áreas de la Química Analítica.En esta Tesis se ha explorado el potencial analítico y las aplicaciones del acoplamiento instrumental cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) con analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) e híbrido cuadrupolo-tiempo de vuelo (QTOF) en la determinación de plaguicidas, principalmente en el campo medioambiental, poniendo especial énfasis en los aspectos cualitativos, es decir, en la correcta confirmación de la identidad de los compuestos detectados, siguiendo los criterios de las actuales guías europeas.El trabajo ha sido estructurado en cuatro partes. En primer lugar, se ha explorado elpotencial del acoplamiento LC-QTOF MS en el análisis cualitativo. La versatilidad de la LC, junto con la elevada exactitud de masa del QTOF y la posibilidad de obtener espectros de iones producto con masa exacta, ha permitido la detección, identificación y elucidación de TPs/metabolitos de plaguicidas seleccionados. Inicialmente, se seleccionó como caso de estudio una familia de herbicidas ampliamente utilizada (triazinas). En vista del éxito de los resultados obtenidos, se decidió ampliar el trabajo a otros plaguicidas aplicados en la Comunidad Valenciana, como por ejemplo, bromacilo, diuron o diazinon. En el caso del diazinon, además, se llevaron a cabo estudios in vitro (con microsomas hepáticos humanos) e in vivo (con ratas), con el fin de elucidar sus principales metabolitos, demostrando así la gran capacidad analítica de esta técnica tanto en el campo ambiental como biológico.Adicionalmente, la metodología desarrollada fue ligeramente modificada para el estudio de compuestos desconocidos (non-target), tras la inyección directa de muestras acuosas de diferentes orígenes. La aplicación de esta metodología permitió la identificación de varios contaminantes en muestras de agua de la Comunidad Valenciana.En segundo lugar, se ha estudiado el potencial del acoplamiento LC-QqQ MS para la determinación cuantitativa de residuos de plaguicidas y de sus TPs en muestras ambientales. Se han puesto a punto dos métodos basados en SPE-LC-MS/MS: el primero de ellos para la determinación multirresiduo de plaguicidas seleccionados y de sus TPs en muestras de agua, y el segundo para la determinación de compuestos altamente polares como el glifosato, su producto de transformación (AMPA) y el glufosinato, ante la imposibilidad de incluirlos en el método multirresiduo anteriormente descrito. Los métodos fueron optimizados y validados tanto en muestras de agua subterránea como superficial siguiendo el "espíritu" de las Buenas Prácticas de Laboratorio, según los criterios de las guías SANCO de la Union Europea, estableciendo los parámetros de linealidad, especificidad, exactitud y precisión. En el caso del glifosato y AMPA, el método fue además validado en muestras de suelo. Posteriormente, la metodología se aplicó al análisis de muestras reales, con el fin de obtener información sobre el nivel de contaminación de las aguas de la Comunidad Valenciana.En tercer lugar, se ha comparado el potencial de los distintos equipos instrumentalesutilizados en cuanto a su poder de confirmación de plaguicidas y TPs en muestras reales de agua, de acuerdo con las actuales guías europeas (2002/657/EC). Se han mostrado ejemplos ilustrativos de muestras reales de agua, sobre las que se han detectado diferentes plaguicidas y TPs, y se han discutido las posibilidades de reportar falsos positivos o falsos negativos. En general, se ha demostrado que el triple cuadrupolo puede utilizarse de manera eficiente para la confirmación de muestras positivas siempre y cuando se adquieran varias transiciones MS/MS. El uso de 2 transiciones SRM (Selected Reaction Monitoring) es una alternativa válida, siempre que se realice una selección adecuada considerando su especificidad. Por lo que se refiere al QTOF, su modo de operar permite monitorizar todos los iones producto simultáneamente sin necesidad de preseleccionarlos previamente, lo que, unido a las medidas de masa exacta, le proporciona un extraordinario potencial con fines identificativos. El QTOF, sin embargo, presenta una limitación respecto al QqQ en modo SRM debido a su menor sensibilidad, lo que puede imposibilitar la confirmación de ciertos positivos a bajas concentraciones.Finalmente, se han efectuado dos revisiones científicas en las que se muestran diferentes estrategias para afrontar la determinación de plaguicidas por LC-MS/MS. La estrategia a seguir dependerá del objetivo perseguido y del instrumento disponible, ya que los requisitos del método a utilizar diferirán dependiendo de si se quiere detectar, cuantificar o confirmar la presencia de un posible residuo. A modo de resumen, el triple cuadrupolo se considera muy adecuado para la cuantificación y el cribado (screening) de compuestos predefinidos (target analytes). Esta aproximación presenta, sin embargo, una limitación debido a la necesidad de preseleccionar los compuestos objeto de estudio. En cuanto a la confirmación, el uso de transiciones no específicas, como por ejemplo pérdidas de agua, puede resultar esporádicamente en falsos positivos incluso adquiriendo dos transiciones, ya que aumenta la probabilidad de encontrar interferentes que compartan la misma transición. Por otra parte, también podrían resultar falsos negativos en el caso de que una de las transiciones fuera compartida por un interferente, ya que afectaría a la relación de abundancias iónicas experimental. Esta posibilidad aumenta cuando el analito se encuentra a niveles de concentración del orden de sub-ppb. Por este motivo, se considera que la mejor aproximación para una confirmación segura de residuos es la adquisición del mayor número posible de transiciones disponibles.El QTOF en cambio, debido a su elevada sensibilidad en modo scan y a la posibilidad de realizar experiencias en modo MS y MS/MS con medidas de masa exacta, es ideal para la búsqueda de compuestos desconocidos (sin necesidad de ser preseleccionados) y para la elucidación estructural. En cuanto a la confirmación de positivos, el QTOF puede considerarse como la herramienta ideal que permite la identificación inequívoca del analito. Sin embargo, existe la posibilidad de reportar falsos negativos si se encuentra presente en la muestra algún interferente isobárico que coeluya con el analito. En este caso, la mejor opción sería mejorar la separación cromatográfica, lo cual demuestra que ésta juega un papel fundamental en los métodos analíticos, incluso cuando va acoplada a técnicas poderosas de medida como MS/MS con analizadores de QTOF. En esta Tesis se ha establecido una metodología de trabajo moderna, altamente especializada y con herramientas analíticas poderosas, que podría aplicarse a otros campos de interés relacionados con el impacto de contaminantes orgánicos sobre el medio ambiente, alimentos, y, en definitiva, sobre los seres vivos.

[ES] De entre los patógenos emergentes presentes en agua, las bacterias del género Helicobacter son de las más alarmantes, ya que se encuentran directamente relacionadas con el cáncer gástrico y hepatobiliar y su epidemiología aún no está clara. Se ha planteado que H. pylori puede ser adquirida por diferentes vías de transmisión, entre las que se destaca el agua. Se ha demostrado su capacidad de supervivencia frente a los tratamientos comunes de desinfección de aguas. Por todo ello, en esta tesis se ha investigado la presencia de células viables, y por tanto infectivas, de H. pylori en aguas potables y de riego, mediante la mejora y la optimización de técnicas de cultivo y moleculares. Este trabajo se inició con la búsqueda de un medio de cultivo óptimo. Se obtuvieron resultados muy positivos con el medio de cultivo Agar Dent con sulfato de polimixina B, independientemente del origen de la muestra. Seguidamente, se desarrolló un método de pre-tratamiento con Propidium Monoazide y PEMAXTM para la detección y cuantificación de células de H. pylori viables, por PCR. Se confirmó que el PMA a una concentración de 50 µM y un periodo de incubación de 5 minutos sería la metodología óptima de tratamiento antes del análisis mediante qPCR. A continuación, se analizaron 20 muestras de agua residual. Mediante la técnica de cultivo, fue posible la detección de 4 colonias sospechosas de Helicobacter spp. y H. pylori, cuya identificación fue confirmada mediante amplificación y posterior secuenciación. La técnica DVC-FISH indico la presencia de células viables de Helicobacter spp. en 15 (75%) de las muestras. Respecto a la detección de células de H. pylori, mediante DVC-FISH y FISH, estos microorganismos se observaron en 10 (50%) y 11 (55%) de las 20 muestras analizadas, respectivamente. La técnica qPCR determino la presencia de H. pylori en las muestras, con un porcentaje de detección del 60%. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de 16 muestras de aguas residuales. Los filos dominantes de las muestras analizadas fueron Proteobacteria, seguido de Bacteroidetes y Firmicutes. H. pylori se detectó en 6 muestras de aguas residuales. Además, se detectaron otras especies de Helicobacter spp., como H. hepaticus, H. pullorum y H. suis. Igualmente, mediante PCR se identificó el gen cagA en 5 muestras de agua residual y una de agua potable. Respecto el genotipo vacAs1, se observó en 4 muestras de agua residual; el genotipo vacAm1, se identificó en una muestra de agua potable y 2 de agua de riego. En las biopelículas analizadas, 2 fueron positivas para el tipo vacAm1, y otros dos para el gen de resistencia pbp1A. Del mismo modo se analizaron 45 muestras de heces. No se observaron colonias sospechosas en Agar Dent selectivo. Mediante qPCR se evidenció H. pylori en 41 muestras (45,56%). Fue posible cuantificar 10 muestras directas y 18 enriquecidas, con concentraciones entre 3,39*103 y 2,61*103 UG/mL, las restantes presentaban niveles superiores al umbral de fiabilidad (>35 ciclos). Por DVC-FISH se observaron células viables de H. pylori en 26 (57,78%) de las 45 muestras directas. La identificación de mutaciones en el 23S rDNA, de la resistencia a la claritromicina, mostro que el 37,79% de las muestras de heces presentaban células de H. pylori potencialmente resistentes. Mediante secuenciación dirigida y posterior análisis bioinformático se identificó H. pylori en 13 muestras directas y 13 muestras enriquecidas, y otras especies como H. hepaticus y H. pullorum. Por último, se evaluó la capacidad de H. pylori para formar biopelículas y su resistencia frente a los tratamientos comunes de desinfección. Se analizaron 27 biopelículas procedentes del sistema de distribución de agua potable para detectar la presencia de H. pylori mediante qPCR. El porcentaje de detección fue del 23%, siendo posible la cuantificación en 5 muestras, con concentraciones entre 7,32*101 y 1,16*101 unidades genómicas/mL. Los resultados obtenidos en esta Tesis confirman la existencia de células viables de H. pylori y otros Helicobacter spp. en aguas residuales tras su tratamiento, lo que significa un riesgo potencial para la Salud Pública. De igual forma se demuesta su presencia en muestras de heces, proporcionando un punto de partida para el estudio del riesgo que puede suponer para el ser humano la trasmisión fecal-oral de estas especies. Este trabajo también demuestra la capacidad de H. pylori de formar biopelículas y su resistencia frente a tratamientos comunes de desinfección y confirma su existencia en sistemas de distribución de agua potable. / [CAT] D'entre tots els patògens emergents presents en aigua, els bacteris del gènere Helicobacter són dels més alarmants, ja que es troben directament relacionats amb el càncer gàstric i hepatobiliar i la seua epidemiologia encara no és clara. S'ha plantejat que H. pylori es pot transmetre per diferents vies de transmissió, entre les quals destaca l¿aigua. S'ha demostrat la seua capacitat de supervivència enfront dels tractaments comuns de desinfecció d'aigües. Per tant, en aquesta tesi s'ha investigat la presència de cèl·lules viables, i per tant infectives, d' H. pylori en aigües potables i de reg, mitjançant la millora i l'optimització de tècniques de cultiu i moleculars. Aquest treball es va iniciar amb la cerca d'un cultiu òptim. Es van obtenir resultats molt positius amb el mitjà de cultiu Agar Dent amb sulfat de polimixina B, independentment de l'origen de la mostra. Seguidament, es va desenvolupar un mètode de pretractament amb Propidium Monoazide i PEMAXTM per a la detecció i quantificació exclusiva de cèl·lules d' H. pylori viables per PCR. Es va confirmar que el PMA a una concentració de 50 µM i un període d'incubació de 5 minuts seria la metodologia òptima de tractament abans de l'anàlisi mitjançant qPCR. A continuació, es van analitzar 20 mostres d'aigua residual. Mitjançant la tècnica de cultiu, va ser possible la detecció de 4 colònies sospitoses d' Helicobacter spp. i H. pylori, la identificació de la qual va ser confirmada mitjançant amplificació i posterior seqüenciació. La tècnica DVC-FISH va demostrar la presència de cèl·lules viables d' Helicobacter spp. en 15 (75%) de les mostres, sense necessitat d'un pas previ d'enriquiment. Respecte a la detecció de cèl·lules d' H. pylori, mitjançant DVC-FISH i FISH, aquests microorganismes es van observar en 10 (50%) i 11 (55%) de les 20 mostres analitzades, respectivament. La tècnica qPCR determinà la presència d' H. pylori a les mostres amb un percentatge de detecció del 60%. Finalment, mitjançant metagenòmica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de 16 mostres d'aigües residuals. Els talls dominants de les mostres analitzades van ser Proteobacteria, seguit de Bacteroidetes i Firmicutes. H. pylori es va detectar mitjançant aquesta tècnica en 6 mostres d'aigües residuals. A més, es van detectar altres espècies d' Helicobacter spp., com H. hepaticus, H. pullorum i H. suis. Igualment mediant PCR es va identificar el gen cagA en 5 mostres d'aigua residual i una d'aigua potable. Respecte al genotip vacAs1, es va observar en 4 mostres d'aigua residual; el genotip vacAm1, es va identificar en una mostra d'aigua potable i 2 d'aigua de reg. En les biopel·lícules analitzades, 2 van ser positives per al tipus vacAm1, i altres dos per al gen de resistència pbp1A. De la mateixa manera es van analitzar 45 mostres de femta. No es van observar colònies sospitoses en Agar Dent selectiu. Mitjançant la tècnica qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori en 41 mostres (45,56%). Va ser possible quantificar 10 mostres directes i 18 enriquides, amb concentracions d'entre 3,39*103 i 2,61*103 UG/ml, les restants presentaven nivells per damunt del llindar de fiabilitat (>35 cicles). Mitjançant DVC-FISH es van observar cèl·lules viables d' H. pylori en 26 (57,78%) de les 45 mostres directes. La detecció de mutacions en el 23S rDNA, específiques de la resistència a la claritromicina, va indicar que el 37,79% de les mostres de femta presentaven cèl·lules d' H. pylori potencialment resistents. Mitjançant seqüenciació dirigida i posterior anàlisi bioinformàtica es va identificar H. pylori en 13 mostres directes i 13 mostres enriquides, i altres espècies com H. hepaticus i H. pullorum. Finalment, es va avaluar la capacitat d' H. pylori per a formar biopel·lícules i la seua resistència enfront dels tractaments comuns de desinfecció. Es van analitzar 27 biopel·lícules procedents del sistema de distribució d'aigua potable per a detectar la presència d' H. pylori mitjançant qPCR. El percentatge de detecció va ser del 23%, sent possible la quantificació en 5 mostres corresponents a concentracions d’entre 7,32*101 i 1,16*101 unitats genòmiques/ml. Els resultats obtinguts en aquesta Tesi confirmen la presència de cèl·lules viables d' H. pylori i altres Helicobacter spp. en aigües residuals després del seu tractament, la qual cosa suposa un risc potencial per a la Salut Pública. D'igual forma, s'evidencia la seua presència en mostres de femta, proporcionant un punt de partida per a l'estudi del risc que la transmissió fecal-oral d'aquestes espècies pugui suposar per als humans. Aquest treball també demostra la capacitat d' H. pylori de formar biopel·lícules i la seua resistència enfront als tractaments comuns de desinfecció, i confirma la seua presència en sistemes de distribució d'aigua potable. / [EN] Among all the emergent pathogens in water, bacteria of the Helicobacter genus are among the most disturbing, as they are directly related to gastric and hepatobiliary cancer and their epidemiology is still unclear. It has been suggested that H. pylori can be acquired through different transmission routes, among which water stands out. Its ability to survive against common water disinfection treatments has been demonstrated. In addition, H. pylori can form insoluble biofilms, which favors its resistance to the different disinfection and potabilization treatments. Therefore, in this thesis has investigated the presence of viable cells, and therefore potentially infective, of H. pylori in drinking and irrigation waters, through the improvement and optimization of culture and molecular techniques. This work began with the development of an optimal culture medium. Positive results were obtained with the culture medium Agar Dent with polymyxin B sulfate. Subsequently, a pretreatment method with Propidium Monoazide and PEMAXTM was developed for the exclusive detection and quantification of viable H. pylori cells by PCR. It was confirmed that PMA at a concentration of 50 µM and an incubation period of 5 minutes, would be the optimal treatment methodology before analysis by qPCR. A total of 20 wastewater samples, aseptically collected at the outlet of the biological reactor and after disinfection treatment, were then analyzed. Using the culture technique, it was possible to detect 4 suspicious colonies of Helicobacter spp. and H. pylori, whose identification was confirmed by amplification and subsequent sequencing. DVC-FISH technique demonstrated the presence of viable Helicobacter spp. cells in 15 (75%) of the samples. Regarding the detection of H. pylori cells, by DVC-FISH and FISH, these microorganisms were observed in 10 (50%) and 11 (55%) of the 20 samples analyzed, respectively. The qPCR technique determined the presence of H. pylori in the samples with a detection rate of 60%. Finally, using deep-amplicon sequencing, the microbiome of 16 wastewater samples was analyzed. The dominant phylum in the samples analyzed were Proteobacteria, followed by Bacteroidetes and Firmicutes. H. pylori was detected by this technique in 6 wastewater samples. In addition, others Helicobacter spp., such as H. hepaticus, H. pullorum and H. suis were detected. PCR technique was used to identify the cagA gene in 5 wastewater samples and one drinking water sample. Regarding the vacAs1 genotype, it was observed in 4 samples of wastewater; the vacAm1 genotype, was identified in one drinking water sample and 2 irrigation water samples. In the biofilms analyzed, 2 were positive for the vacAm1 type, and two for the resistance gene pbp1A. Likewise, 45 stool samples were analyzed. No suspicious colonies were observed on selective Dent Agar. The qPCR technique demonstrated the presence of H. pylori in 41 samples (45.56%). It was possible to quantify 10 direct samples and 18 enriched samples, with concentrations between 3.39*103 and 2.61*103 GU/mL, the remaining samples had levels above the reliability threshold (>35 cycles). DVC-FISH showed viable H. pylori cells in 26 (57.78%) of the 45 direct samples. Detection of 23S rDNA mutations specific for clarithromycin resistance indicated that 37.79% of stool samples had potentially resistant H. pylori cells. Through Deep-amplicon sequencing and subsequent bioinformatics analysis, H. pylori was identified in 13 direct samples and 13 enriched samples, as well as other species such as H. hepaticus and H. pullorum. Finally, the ability of H. pylori to form biofilms and their resistance to common disinfection treatments was evaluated. Twenty-seven biofilms from the drinking water distribution system were also tested for the presence of H. pylori by qPCR. The detection rate was 23%, being possible the quantification in 5 samples corresponding to concentrations between 7.32*101 and 1.16*101 GU/mL. / Esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a las ayudas de carácter predoctoral: “Ayuda de conselleria para la contratación de personal investigador en formación -Irene Hortelano Martin (determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros helicobacters patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica) (ACIF/2016/150) Generalitat Valenciana (2016-2019). Y a la financiación de los proyectos: “Helicobacter pylori y otros helicobacters patógenos en aguas y alimento: Desarrollo y aplicación de herramientas moleculares dirigidas a la evaluación del riesgo para el consumidor (REF. AGL2014-53875-R)”. Ministerio de Economía y Competitividad, España. “Determinación del riesgo para la salud pública debido a la presencia de H. pylori en agua y alimentos: Detección (AICO/2018/273)”. Generalitat Valenciana (2018-2020). / Hortelano Martín, I. (2021). Determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros Helicobacter spp. patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178942