Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), algunos de ellos tóxicos y mutagénicos, son compuestos hidrofóbicos altamente persistentes en el ambiente. Estudios previos realizados en la región Costera Patagónica, particularmente en un sitio crónicamente contaminado con hidrocarburos en Bahía Ushuaia, demostraron un alto potencial para la degradación microbiana de estos compuestos. Sin embargo, estos estudios sólo se orientaron al análisis de fragmentos de genes codificantes para enzimas oxigenasas de anillos aromáticos involucradas en el primer paso de la degración de HAPs. Con el objetivo de conocer la relevancia ecológica de los microorganismos con capacidad de degradar HAPs en este ambiente y revelar los mecanismos que utilizan para ello, en el presente trabajo se emplearon diferentes técnicas independientes del cultivo de microorganismos. La construcción y análisis de una biblioteca metagenómica en fósmidos permitió identificar fragmentos de ADN pertenecientes a microorganismos del phylum Proteobacteria, dos de los cuales podrían provenir de miembros estables de la comunidad microbiana altamente especializados en la degradación de compuestos aromáticos. Asimismo, se detectaron genes completos codificantes para enzimas de la vía alta de degradación de HAPs y de la vía baja de degradación por gentisato y catecol, sugiriendo que las poblaciones degradadoras de los sedimentos intermareales de Bahía Ushuaia utilizan diferentes rutas degradativas para el metabolismo de estos compuestos. Entre estos genes, aquellos codificantes para enzimas oxigenasas de clase A y extradiol dioxigenasas representan potenciales marcadores funcionales para el estudio de la abundancia y dinámica de los microorganismos degradadores de hidrocarburos aromáticos.

La reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un proceso ubicuo en laboratorios biológicos. Su uso específico que nos interesa en este trabajo es el de bio identificación de micro organismos en muestras biológicas ambientales, área conocida como metagenómica. Un PCR exitoso requiere pequeñas secuencias de nucleótidos llamadas “partidores”, las cuales deben satisfacer variadas condiciones termodinámicas y biológicas. El proceso de diseño de ellos es un tema de amplio estudio en bioinformática, pues es un proceso maduro y que necesita cada vez más contar con predicciones computacionales de su desempeño. El objetivo de esta memoria es desarrollar una herramienta de uso intensivo para el diseño de partidores de PCR en metagenómica, basándose en el trabajo previo del Laboratorio de Bioinformática y Matemática del Genoma (LBMG) de la Universidad de Chile. El sistema existente es una colección de programas, algunos de cómputo paralelo, que permiten definir un universo taxonómico, calcular partidores para dicho universo y simular su comportamiento numéricamente. Sin embargo, el sistema es de difícil operación e insuficiente extensibilidad. La metodología para este trabajo consiste de una revisión bibliográfica del estado del arte en la literatura científica y del LBMG, para posteriormente proceder a un re diseño que contemple las extensiones de interés y una re implementación del sistema acorde al re diseño. El resultado obtenido es el núcleo de la herramienta, con un diseño claro y escalable, junto con su correspondiente implementación, que tiene las mismas funcionalidades del sistema existente exceptuando la paralelización. Se obtiene además una especificación de las cualidades que se deben añadir o completar para contar con un sistema finalizado y operativo de uso intensivo. Se concluye que el trabajo realizado representa un avance importante en la sistematización del diseño de partidores para PCR sobre el cual basar trabajos futuros de extensión, aplicación a distintos dominios biológicos y como muestra de desarrollos concretos realizados íntegramente en el LBMG.

La resistencia a antimicrobianos es un problema a escala global que ha sido reconocido como una de las 10 principales amenazas para la salud pública mundial por parte de la Organización Mundial de la Salud. Dada su gran importancia, el análisis de los genes de resistencia a antibióticos, que otorgan resistencia frente a antibióticos a las bacterias que los tienen, pasa a tener un papel crucial para el desarrollo de estrategias que reduzcan la resistencia a antimicrobianos existente. Sabemos de la presencia de genes de resistencia a antibiótico está muy extendida en diferentes ambientes, y en esta tesis, centramos esfuerzos analizando puntos calientes y posibles vías de dispersión de GRA como son el aire y el agua. Para ello se aplicará principalmente la metagenómica, una de las metodologías no basadas en cultivo que mayor información puede dar sobre una muestra dada. Los puntos calientes de genes de resistencia a antibióticos analizados en este trabajo son el ser humano, aguas de depuradora y otras aguas relevantes y el aire de hospitales y depuradoras, este último medio, a pesar de su importancia en la dispersión de genes de resistencia a antibiótico ha sido menos explorado por sus dificultades técnicas y falta de estandarización. Además de puntos calientes de dispersión de genes de resistencia a antibiótico, también analizamos la dispersión desde éstos a ambientes prístinos, en los que la influencia del hombre es inexistente o escasa. / Esta tesis ha sido financiada gracias a la ayuda para la realización de contratos destinados a la formación predoctoral en colaboración con empresas (UAIND) con número de referencia I-PI 95-18 en colaboración con el Vicerrectorado de Investigación y Transferencia de Conocimiento de la Universidad de Alicante y el Hospital Universitario del Vinalopó.

En esta Tesis se estudia el posible papel de las FLA como reservorio de H. pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares. En primer lugar se realizó un ensayo de cocultivo entre la bacteria H. pylori y la ameba Acanthamoeba castellanii. Se comprobó, mediante técnicas moleculares específicas para la detección de células viables, PMA-qPCR y DVC-FISH, que la ameba es capaz de internalizar a la bacteria y que esta última permanece viable, demostrando que H. pylori se comporta como una bacteria ARB. Seguidamente, se analizaron un total de 120 muestras ambientales, 100 de agua y 20 de vegetales para comprobar la presencia, tanto de FLA como de H. pylori internalizado en estas FLA. En el caso de las muestras de agua, se analizaron 69 muestras de agua residual y 31 de agua potable. Un total de 55 (79,7%) muestras de agua residual y 12 (38,7%) de agua potable resultaron positivas para la presencia de FLA. Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA presentes en 28 (50,9%) y 11 (91,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Mediante DVC-FISH se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA presentes en las muestras eran viables en 16 (29,5%) y 5 (41,7%) de las muestras de agua residual y potable analizadas, respectivamente. Además, se consiguió recuperar formas viables cultivables de H. pylori procedente del interior de FLA en 10 (18,2%) de las muestras de agua residual analizadas. Las FLA aisladas e identificadas en las aguas residuales pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae y a la familia Vahlkampfiidae. En el caso del agua potable, las FLA aisladas e identificadas pertenecieron a los géneros Acanthamoeba, Echinamoeba y Vermamoeba. En el caso de las muestras de vegetales, concretamente lechugas, todas ellas resultaron positivas para el aislamiento de FLA (100%). Mediante la técnica PMA-qPCR se demostró la presencia de H. pylori internalizado en las FLA en 11 (55,0%) de las muestras y, mediante DVC-FISH, se demostró que las células de H. pylori internalizadas dentro de las FLA eran viables en 5 (25,0%) de las muestras. En este caso no se recuperaron formas viables cultivables de la bacteria. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de las FLA presentes en 20 de las muestras analizadas en esta Tesis (11 de agua residual, 3 de agua potable y 6 de lechugas). Para ello, se eligieron los iniciadores, se evaluaron in silico e in vitro y, una vez comprobada su idoneidad, se emplearon para la secuenciación de las muestras. En los tres tipos de muestras, la clase bacteriana más abundante fue la Gammaproteobacteria. Para los tres tipos de muestras, los filos más abundantes de las bacterias del microbioma de las FLA fueron Proteobacteria y Bacteroidetes y, en el caso del agua residual, también lo fue el filo Planctomycetes. H. pylori se detectó mediante esta técnica en los tres tipos de muestra. Además, como parte del microbioma de FLA de muestras ambientales, se detectaron otras bacterias de interés para la salud pública, tales como Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran la presencia de FLA patógenas en las muestras ambientales, así como el hecho de que, en algunos casos, estas son transportadoras de bacterias patógenas. Este trabajo también confirma que H. pylori se comporta como una bacteria ARB y que se encuentra viable en el interior de FLA presentes, tanto en aguas residuales y potables como en vegetales. De esta forma, se postula que un modo de transmisión de esta bacteria podría ser a través de las FLA presentes en agua o vegetales. / In this Thesis, the possible role of FLA is studied as a reservoir of H. pylori and other pathogenic bacteria in waters and food by means of molecular techniques. Firstly, a coculture assay between the bacterium H. pylori and the amoeba Acanthamoeba castellanii was carried out. It was verified by means of molecular techniques specific for the detection of viable cells, PMA-qPCR and DVC-FISH, that the amoeba is capable of internalizing the bacterium and that the latter remains viable, demonstrating that H. pylori behaves as an ARB bacterium. Afterwards, a total of 120 environmental samples, 100 of water and 20 of vegetables, were analyzed to verify the presence FLA as well as internalized H. pylori into these FLA. In case of water samples, 69 samples of wastewater and 31 samples of drinking water were analyzed. A total of 55 (79,7 %) wastewater and 12 (38,7 %) of drinking water samples turned out to be positive for FLA's presence. By means of PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 28 (50,9 %) and 11 (91,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. By means of DVC-FISH it was demonstrated that the FLA-internalized H. pylori cells were viable in 16 (29,5 %) and 5 (41,7 %) of the wastewater and drinking water samples analyzed, respectively. In addition, viable cultivable forms of H. pylori coming from the inside of FLA were recovered from 10 (18,2 %) of the analyzed wastewater samples. The isolated and identified FLA from wastewater samples belonged to the genus Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae and to the family Vahlkampfiidae. In the case of drinking wáter, the isolated and identified FLA belonged to the genus Acanthamoeba, Echinamoeba and Vermamoeba. In the case of the vegetable samples, specifically lettuces, all of them turned out to be positive for FLA's isolation (100 %). By means of the PMA-qPCR technique, the presence of FLA-internalized H. pylori was demonstrated in 11 (55,0 %) of the samples and, by means of DVC-FISH, it was demonstrated that FLA-internalized H. pylori cells were viable in 5 (25,0 %) of the samples. In this case, viable cultivable forms of the bacterium could not be recovered. Finally, by means of amplicon-based metagenomics, the FLA microbiome of 20 previously analyzed samples in this Thesis (11 wastewater, 3 drinking water and 6 lettuce samples) was analyzed. To do so, a pair of primers were selected and evaluated in silco and in vitro and, once checked its suitability, they were used to perform the samples' sequencing. In the three types of samples, the most abundant bacterial class was the Gammaproteobacteria. For the three types of samples, the most abundant bacterial phylum of the FLA microbiome were Proteobacteria and Bacteroidetes and, in case of the wastewater, it was also the phylum Planctomycetes. H. pylori was detected by means of this technology in the three types of samples. In addition, as part of FLA's microbiome of environmental samples, other bacteria of public health interest were detected, such as Aeromonas, Legionella, Mycobacterium or Pseudomonas. The results obtained in this Thesis demonstrate the presence of pathogenic FLA in the environmental samples, as well as the fact that, in some cases, these they are carriers of pathogenic bacteria. This work also confirms that H. pylori behaves as an ARB bacterium and that it is viable inside the present FLA in wastewater as well as in drinking water and in vegetables. This way, it is postulated that a way of transmission of this bacterium might be through the FLA present in water or vegetables. / En esta Tesi s'estudia el possible paper de les FLA com a reservori de H. pylori i altres bacteris patògens en aigües i aliments per mitjà de tècniques moleculars. En primer lloc es va realitzar un assaig de cocultiu entre el bacteri H. pylori i l'ameba Acanthamoeba castellanii. Es va comprovar per mitjà de tècniques moleculars específiques per a la detecció de cèl¿lules viables, PMA-qPCR i DVC-FISH, que l'ameba és capaç d'internalizar al bacteri i que esta última roman viable, demostrant que H. pylori es comporta com un bacteri ARB. A continuació, es van analitzar un total de 120 mostres ambientals, 100 d'aigua i 20 de vegetals per a comprovar la presència tant de FLA com de H. pylori internalitzat en estes FLA. En el cas de les mostres d'aigua, es van analitzar 69 mostres d'aigua residual i 31 d'aigua potable. Un total de 55 (79,7%) mostres d'aigua residual i 12 (38,7%) d'aigua potable van resultar positives per a la presència de FLA. Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA presents en 28 (50,9%) i 11 (91,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. Per mitjà de DVC-FISH es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA presents en les mostres eren viables en 16 (29,5%) i 5 (41,7%) de les mostres d'aigua residual i potable analitzades, respectivament. A més, es va aconseguir recuperar formes viables cultivables d'H. pylori procedent de l'interior de FLA en 10 (18,2%) de les mostres d'aigua residual analitzades. Les FLA aïllades i identificades en les aigües residuals van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Naegleria, Vanellidae i a la família Vahlkampfiidae. En el cas de l'aigua potable, les FLA aïllades i identificades van pertànyer als gèneres Acanthamoeba, Echinamoeba i Vermamoeba. En el cas de les mostres de vegetals, concretament encisams, totes elles van resultar positives per a l'aïllament de FLA (100%). Per mitjà de la tècnica PMA-qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori internalitzat en les FLA en 11 (55,0%) de les mostres i, per mitjà de DVC-FISH, es va demostrar que les cèl¿lules d'H. pylori internalitzades dins les FLA eren viables en 5 (25,0%) de les mostres. En este cas no es van recuperar formes viables cultivables del bacteri. Finalment, per mitjà de metagenómica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de les FLA presents en 20 de les mostres analitzades en esta Tesi (11 d'aigua residual, 3 d'aigua potable i 6 d'encisams). Per tal de fer això, es van triar els iniciadors, es van avaluar in silico i in vitro i, una vegada comprovada la seua idoneïtat, es van emprar per a la seqüenciació de les mostres. En els tres tipus de mostres, la classe bacteriana més abundant va ser la Gammaproteobacteria. Per als tres tipus de mostres, els filos més abundants dels bacteris del microbioma de les FLA van ser Proteobacteria i Bacteroidetes i, en el cas de l'aigua residual, també ho va ser el filo Planctomycetes. H. pylori es va detectar per mitjà d'esta tècnica en els tres tipus de mostra. A més, com a part del microbioma de FLA de mostres ambientals, es van detectar altres bacteris d'interés per a la salut pública, com ara Aeromonas, Legionella, Mycobaterium o Pseudomonas. Els resultats obtinguts en esta Tesi demostren la presència de FLA patògenes en les mostres ambientals, així com el fet de que, en alguns casos, estes són transportadores de bacteris patògens. Este treball també confirma que H. pylori es comporta com un bacteri ARB i que es troba viable en l'interior de FLA presents, tant en aigües residuals i potables com en vegetals. D'esta manera, es postula que una manera de transmissió d'este bacteri podria ser a través de les FLA presents en aigua o vegetals. / Moreno Mesonero, L. (2018). Estudio del papel de las amebas de vida libre como reservorio de Helicobacter pylori y otras bacterias patógenas en aguas y alimentos mediante técnicas moleculares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111952 / TESIS

[ES] De entre los patógenos emergentes presentes en agua, las bacterias del género Helicobacter son de las más alarmantes, ya que se encuentran directamente relacionadas con el cáncer gástrico y hepatobiliar y su epidemiología aún no está clara. Se ha planteado que H. pylori puede ser adquirida por diferentes vías de transmisión, entre las que se destaca el agua. Se ha demostrado su capacidad de supervivencia frente a los tratamientos comunes de desinfección de aguas. Por todo ello, en esta tesis se ha investigado la presencia de células viables, y por tanto infectivas, de H. pylori en aguas potables y de riego, mediante la mejora y la optimización de técnicas de cultivo y moleculares. Este trabajo se inició con la búsqueda de un medio de cultivo óptimo. Se obtuvieron resultados muy positivos con el medio de cultivo Agar Dent con sulfato de polimixina B, independientemente del origen de la muestra. Seguidamente, se desarrolló un método de pre-tratamiento con Propidium Monoazide y PEMAXTM para la detección y cuantificación de células de H. pylori viables, por PCR. Se confirmó que el PMA a una concentración de 50 µM y un periodo de incubación de 5 minutos sería la metodología óptima de tratamiento antes del análisis mediante qPCR. A continuación, se analizaron 20 muestras de agua residual. Mediante la técnica de cultivo, fue posible la detección de 4 colonias sospechosas de Helicobacter spp. y H. pylori, cuya identificación fue confirmada mediante amplificación y posterior secuenciación. La técnica DVC-FISH indico la presencia de células viables de Helicobacter spp. en 15 (75%) de las muestras. Respecto a la detección de células de H. pylori, mediante DVC-FISH y FISH, estos microorganismos se observaron en 10 (50%) y 11 (55%) de las 20 muestras analizadas, respectivamente. La técnica qPCR determino la presencia de H. pylori en las muestras, con un porcentaje de detección del 60%. Finalmente, mediante metagenómica de secuenciación dirigida, se analizó el microbioma de 16 muestras de aguas residuales. Los filos dominantes de las muestras analizadas fueron Proteobacteria, seguido de Bacteroidetes y Firmicutes. H. pylori se detectó en 6 muestras de aguas residuales. Además, se detectaron otras especies de Helicobacter spp., como H. hepaticus, H. pullorum y H. suis. Igualmente, mediante PCR se identificó el gen cagA en 5 muestras de agua residual y una de agua potable. Respecto el genotipo vacAs1, se observó en 4 muestras de agua residual; el genotipo vacAm1, se identificó en una muestra de agua potable y 2 de agua de riego. En las biopelículas analizadas, 2 fueron positivas para el tipo vacAm1, y otros dos para el gen de resistencia pbp1A. Del mismo modo se analizaron 45 muestras de heces. No se observaron colonias sospechosas en Agar Dent selectivo. Mediante qPCR se evidenció H. pylori en 41 muestras (45,56%). Fue posible cuantificar 10 muestras directas y 18 enriquecidas, con concentraciones entre 3,39*103 y 2,61*103 UG/mL, las restantes presentaban niveles superiores al umbral de fiabilidad (>35 ciclos). Por DVC-FISH se observaron células viables de H. pylori en 26 (57,78%) de las 45 muestras directas. La identificación de mutaciones en el 23S rDNA, de la resistencia a la claritromicina, mostro que el 37,79% de las muestras de heces presentaban células de H. pylori potencialmente resistentes. Mediante secuenciación dirigida y posterior análisis bioinformático se identificó H. pylori en 13 muestras directas y 13 muestras enriquecidas, y otras especies como H. hepaticus y H. pullorum. Por último, se evaluó la capacidad de H. pylori para formar biopelículas y su resistencia frente a los tratamientos comunes de desinfección. Se analizaron 27 biopelículas procedentes del sistema de distribución de agua potable para detectar la presencia de H. pylori mediante qPCR. El porcentaje de detección fue del 23%, siendo posible la cuantificación en 5 muestras, con concentraciones entre 7,32*101 y 1,16*101 unidades genómicas/mL. Los resultados obtenidos en esta Tesis confirman la existencia de células viables de H. pylori y otros Helicobacter spp. en aguas residuales tras su tratamiento, lo que significa un riesgo potencial para la Salud Pública. De igual forma se demuesta su presencia en muestras de heces, proporcionando un punto de partida para el estudio del riesgo que puede suponer para el ser humano la trasmisión fecal-oral de estas especies. Este trabajo también demuestra la capacidad de H. pylori de formar biopelículas y su resistencia frente a tratamientos comunes de desinfección y confirma su existencia en sistemas de distribución de agua potable. / [CAT] D'entre tots els patògens emergents presents en aigua, els bacteris del gènere Helicobacter són dels més alarmants, ja que es troben directament relacionats amb el càncer gàstric i hepatobiliar i la seua epidemiologia encara no és clara. S'ha plantejat que H. pylori es pot transmetre per diferents vies de transmissió, entre les quals destaca l¿aigua. S'ha demostrat la seua capacitat de supervivència enfront dels tractaments comuns de desinfecció d'aigües. Per tant, en aquesta tesi s'ha investigat la presència de cèl·lules viables, i per tant infectives, d' H. pylori en aigües potables i de reg, mitjançant la millora i l'optimització de tècniques de cultiu i moleculars. Aquest treball es va iniciar amb la cerca d'un cultiu òptim. Es van obtenir resultats molt positius amb el mitjà de cultiu Agar Dent amb sulfat de polimixina B, independentment de l'origen de la mostra. Seguidament, es va desenvolupar un mètode de pretractament amb Propidium Monoazide i PEMAXTM per a la detecció i quantificació exclusiva de cèl·lules d' H. pylori viables per PCR. Es va confirmar que el PMA a una concentració de 50 µM i un període d'incubació de 5 minuts seria la metodologia òptima de tractament abans de l'anàlisi mitjançant qPCR. A continuació, es van analitzar 20 mostres d'aigua residual. Mitjançant la tècnica de cultiu, va ser possible la detecció de 4 colònies sospitoses d' Helicobacter spp. i H. pylori, la identificació de la qual va ser confirmada mitjançant amplificació i posterior seqüenciació. La tècnica DVC-FISH va demostrar la presència de cèl·lules viables d' Helicobacter spp. en 15 (75%) de les mostres, sense necessitat d'un pas previ d'enriquiment. Respecte a la detecció de cèl·lules d' H. pylori, mitjançant DVC-FISH i FISH, aquests microorganismes es van observar en 10 (50%) i 11 (55%) de les 20 mostres analitzades, respectivament. La tècnica qPCR determinà la presència d' H. pylori a les mostres amb un percentatge de detecció del 60%. Finalment, mitjançant metagenòmica de seqüenciació dirigida, es va analitzar el microbioma de 16 mostres d'aigües residuals. Els talls dominants de les mostres analitzades van ser Proteobacteria, seguit de Bacteroidetes i Firmicutes. H. pylori es va detectar mitjançant aquesta tècnica en 6 mostres d'aigües residuals. A més, es van detectar altres espècies d' Helicobacter spp., com H. hepaticus, H. pullorum i H. suis. Igualment mediant PCR es va identificar el gen cagA en 5 mostres d'aigua residual i una d'aigua potable. Respecte al genotip vacAs1, es va observar en 4 mostres d'aigua residual; el genotip vacAm1, es va identificar en una mostra d'aigua potable i 2 d'aigua de reg. En les biopel·lícules analitzades, 2 van ser positives per al tipus vacAm1, i altres dos per al gen de resistència pbp1A. De la mateixa manera es van analitzar 45 mostres de femta. No es van observar colònies sospitoses en Agar Dent selectiu. Mitjançant la tècnica qPCR es va demostrar la presència d'H. pylori en 41 mostres (45,56%). Va ser possible quantificar 10 mostres directes i 18 enriquides, amb concentracions d'entre 3,39*103 i 2,61*103 UG/ml, les restants presentaven nivells per damunt del llindar de fiabilitat (>35 cicles). Mitjançant DVC-FISH es van observar cèl·lules viables d' H. pylori en 26 (57,78%) de les 45 mostres directes. La detecció de mutacions en el 23S rDNA, específiques de la resistència a la claritromicina, va indicar que el 37,79% de les mostres de femta presentaven cèl·lules d' H. pylori potencialment resistents. Mitjançant seqüenciació dirigida i posterior anàlisi bioinformàtica es va identificar H. pylori en 13 mostres directes i 13 mostres enriquides, i altres espècies com H. hepaticus i H. pullorum. Finalment, es va avaluar la capacitat d' H. pylori per a formar biopel·lícules i la seua resistència enfront dels tractaments comuns de desinfecció. Es van analitzar 27 biopel·lícules procedents del sistema de distribució d'aigua potable per a detectar la presència d' H. pylori mitjançant qPCR. El percentatge de detecció va ser del 23%, sent possible la quantificació en 5 mostres corresponents a concentracions d’entre 7,32*101 i 1,16*101 unitats genòmiques/ml. Els resultats obtinguts en aquesta Tesi confirmen la presència de cèl·lules viables d' H. pylori i altres Helicobacter spp. en aigües residuals després del seu tractament, la qual cosa suposa un risc potencial per a la Salut Pública. D'igual forma, s'evidencia la seua presència en mostres de femta, proporcionant un punt de partida per a l'estudi del risc que la transmissió fecal-oral d'aquestes espècies pugui suposar per als humans. Aquest treball també demostra la capacitat d' H. pylori de formar biopel·lícules i la seua resistència enfront als tractaments comuns de desinfecció, i confirma la seua presència en sistemes de distribució d'aigua potable. / [EN] Among all the emergent pathogens in water, bacteria of the Helicobacter genus are among the most disturbing, as they are directly related to gastric and hepatobiliary cancer and their epidemiology is still unclear. It has been suggested that H. pylori can be acquired through different transmission routes, among which water stands out. Its ability to survive against common water disinfection treatments has been demonstrated. In addition, H. pylori can form insoluble biofilms, which favors its resistance to the different disinfection and potabilization treatments. Therefore, in this thesis has investigated the presence of viable cells, and therefore potentially infective, of H. pylori in drinking and irrigation waters, through the improvement and optimization of culture and molecular techniques. This work began with the development of an optimal culture medium. Positive results were obtained with the culture medium Agar Dent with polymyxin B sulfate. Subsequently, a pretreatment method with Propidium Monoazide and PEMAXTM was developed for the exclusive detection and quantification of viable H. pylori cells by PCR. It was confirmed that PMA at a concentration of 50 µM and an incubation period of 5 minutes, would be the optimal treatment methodology before analysis by qPCR. A total of 20 wastewater samples, aseptically collected at the outlet of the biological reactor and after disinfection treatment, were then analyzed. Using the culture technique, it was possible to detect 4 suspicious colonies of Helicobacter spp. and H. pylori, whose identification was confirmed by amplification and subsequent sequencing. DVC-FISH technique demonstrated the presence of viable Helicobacter spp. cells in 15 (75%) of the samples. Regarding the detection of H. pylori cells, by DVC-FISH and FISH, these microorganisms were observed in 10 (50%) and 11 (55%) of the 20 samples analyzed, respectively. The qPCR technique determined the presence of H. pylori in the samples with a detection rate of 60%. Finally, using deep-amplicon sequencing, the microbiome of 16 wastewater samples was analyzed. The dominant phylum in the samples analyzed were Proteobacteria, followed by Bacteroidetes and Firmicutes. H. pylori was detected by this technique in 6 wastewater samples. In addition, others Helicobacter spp., such as H. hepaticus, H. pullorum and H. suis were detected. PCR technique was used to identify the cagA gene in 5 wastewater samples and one drinking water sample. Regarding the vacAs1 genotype, it was observed in 4 samples of wastewater; the vacAm1 genotype, was identified in one drinking water sample and 2 irrigation water samples. In the biofilms analyzed, 2 were positive for the vacAm1 type, and two for the resistance gene pbp1A. Likewise, 45 stool samples were analyzed. No suspicious colonies were observed on selective Dent Agar. The qPCR technique demonstrated the presence of H. pylori in 41 samples (45.56%). It was possible to quantify 10 direct samples and 18 enriched samples, with concentrations between 3.39*103 and 2.61*103 GU/mL, the remaining samples had levels above the reliability threshold (>35 cycles). DVC-FISH showed viable H. pylori cells in 26 (57.78%) of the 45 direct samples. Detection of 23S rDNA mutations specific for clarithromycin resistance indicated that 37.79% of stool samples had potentially resistant H. pylori cells. Through Deep-amplicon sequencing and subsequent bioinformatics analysis, H. pylori was identified in 13 direct samples and 13 enriched samples, as well as other species such as H. hepaticus and H. pullorum. Finally, the ability of H. pylori to form biofilms and their resistance to common disinfection treatments was evaluated. Twenty-seven biofilms from the drinking water distribution system were also tested for the presence of H. pylori by qPCR. The detection rate was 23%, being possible the quantification in 5 samples corresponding to concentrations between 7.32*101 and 1.16*101 GU/mL. / Esta Tesis Doctoral ha sido posible gracias a las ayudas de carácter predoctoral: “Ayuda de conselleria para la contratación de personal investigador en formación -Irene Hortelano Martin (determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros helicobacters patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica) (ACIF/2016/150) Generalitat Valenciana (2016-2019). Y a la financiación de los proyectos: “Helicobacter pylori y otros helicobacters patógenos en aguas y alimento: Desarrollo y aplicación de herramientas moleculares dirigidas a la evaluación del riesgo para el consumidor (REF. AGL2014-53875-R)”. Ministerio de Economía y Competitividad, España. “Determinación del riesgo para la salud pública debido a la presencia de H. pylori en agua y alimentos: Detección (AICO/2018/273)”. Generalitat Valenciana (2018-2020). / Hortelano Martín, I. (2021). Determinación del riesgo para el consumidor de la presencia de H. pylori y otros Helicobacter spp. patógenos en aguas de consumo mediante técnicas moleculares y metagenómica [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/178942 / TESIS

[ES] El objetivo de la Tesis fue investigar los mecanismos genéticamente determinados involucrados en la deposición de grasa intramuscular (GIM) usando 2 líneas divergentes de GIM (A y B) en el músculo Longissimus thoracis et Lumborum (LTL) de conejos. Consta de cinco estudios que evalúan el rol del huésped y el microbioma usando análisis metabolómicos y metagenómicos. La respuesta a la selección en la 10ma generación fue 0,49g GIM/100g LTL, equivalente a 3,8 desviaciones estándar (DE). Se obtuvo una respuesta correlacionada positiva en la grasa de la canal y cambios en los ácidos grasos (AG) del LTL, con mayor contenido de saturados (A-B= 5,05g/100g GIM) y monoinsaturados (A-B= 5,04g/100g GIM) en la línea A. No hubo diferencia en la grasa del hígado, pero sí en sus AG, como el menor C15:0 (A-B= -0,04g/100g lípidos) y C17:0 (A-B= -0,09g/100g lípidos) en la línea A, que podría deberse a diferente digestión microbiana. El análisis metabolómico del plasma encontró 393 metabolitos diferenciales con 95% precisión clasificatoria y 383 metabolitos con ajuste linear a GIM con 65% capacidad predictiva, de los cuales 322 coincidían con diferencias entre -6,04 y +1,97 DE. Los lípidos fueron mayores en la línea B (ej. triglicéridos, ácidos biliares secundarios (AB-2º), AG) y la carnitina fue menor, sugiriendo mayor absorción intestinal y menor captación y almacenamiento, posiblemente relacionada con menor ß-oxidación de AG. Entre los aminoácidos, destacaron los de cadena ramificada (BCAA) y aromáticos (AAA) indicando menor degradación intestinal de BCAA en la línea A seguida de mayor catabolismo del huésped, y una compleja interacción huésped-microbioma en el metabolismo de los AAA. El análisis metagenómico del ciego confirmó la relevancia del microbioma en la deposición de GIM, con cambios en composición y funcionalidad. El análisis de la composición definió 2 enterotipos con 51 géneros microbianos y 91% precisión clasificatoria: el enterotipo A enriquecido en Hungateiclostridium, Limosilactobacillus, Legionella, Lysinibacillus, Phorphyromonas, Methanosphaera y Desulfovibrio y el enterotipo B en Escherichia, Fonticella, Candidatus Amulumruptor, Methanobrevicater, Exiguobacterium, Flintibacter y Coprococcus. Un balance composicional se propuso como biomarcador para predecir la predisposición genética a la deposición de GIM, compuesto por 26 géneros microbianos con 93% precisión clasificatoria y 69% capacidad predictiva. El análisis de funcionalidad encontró 240 genes microbianos (GM) diferenciales con 95% precisión clasificatoria y 230 GM con ajuste linear a GIM con 79% capacidad predictiva, de los cuales 122 GM coincidían con diferencias entre -0,75 y +0,73 DE. Mayor biosíntesis de lipopolisacáridos y peptidoglicanos, asociado al desarrollo de masa grasa, biosíntesis de AAA, asociado a trastornos relacionados a la deposición grasa, y conversión de propionato a acetato, relacionado con mayor lipogénesis en el hígado y menor síntesis de C15:0 y C17:0, se encontró en la línea A. Además, se encontró mayor degradación de BCAA en la línea B, asociado con menor síntesis de triglicéridos en el hígado. El análisis metabolómico del ciego encontró 142 metabolitos diferenciales con 99% precisión clasificatoria y diferencias entre -1,03 y +1,19 DE; 156 relacionados con GIM en la línea A con 61% capacidad predictiva; y 107 relacionados con GIM en la línea B con 57% capacidad predictiva. Diferencias en el metabolismo de las purinas podrían sugerir mayor eficiencia energética y en la utilización del nitrógeno en la línea B, y diferencias en AB-2º, AAA y BCAA fueron consistentes con los resultados anteriores. Un balance composicional se propuso como biomarcador compuesto por 2 AB-2º y 2 subproductos de las proteínas, con 88% de precisión clasificatoria, sugiriendo que la interacción entre absorción lipídica y metabolismo de proteínas de la dieta influyen en la GIM. De validarse, podría usarse para predecir la predisposición genética a la deposición de GIM. / [CA] L'objectiu de la Tesi va ser investigar els mecanismes genèticament determinats involucrats en la deposició de greix intramuscular (GIM) usant 2 línies divergents de GIM (A i B) en el múscul Longissimus thoracis et Lumborum (LTL) de conills. Consta de cinc estudis que avaluen el rol de l'hoste i el microbioma usant anàlisi metabolòmicos i metagenòmicos. La resposta a la selecció en la 10ma generació va ser 0,49g GIM/100g LTL, equivalent a 3,8 desviacions estàndard (DE) . Es va obtindre una resposta correlacionada positiva en el greix de la canal i canvis en els àcids grassos (AG) del LTL, amb major contingut de saturats (A-B = 5,05g/100g GIM) i monoinsaturats (A-B = 5,04g/100g GIM) en la línia A. No va haver-hi diferència en el greix del fetge, però sí en els seus AG, com el menor C15:0 (A-B = -0,04g/100g lípids) i C17:0 (A-B = -0,09g/100g lípids) en la línia A, que podria deure's a diferent digestió microbiana. L'anàlisi metabolómico del plasma va trobar 393 metabòlits diferencials amb 95% precisió classificatòria i 383 metabòlits amb ajust linear a GIM amb 65% capacitat predictiva, dels quals 322 coincidien amb diferències entre -6,04 i 1,97 DE. Els lípids van ser majors en la línia B (ex. triglicèrids, àcids biliars secundaris (AB- 2º), AG) i la carnitina va ser menor, suggerint major absorció intestinal i menor captació i emmagatzematge, possiblement relacionada amb menor ß-oxidació d'AG. Entre els aminoàcids, van destacar els de cadena ramificada (BCAA) i aromàtics (AAA) indicant menor degradació intestinal de BCAA en la línia A seguida de major catabolisme de l'hoste, i una complexa interacció hoste-microbioma en el metabolisme dels AAA. L'anàlisi metagenòmico del cec va confirmar la rellevància del microbioma en la deposició de GIM, amb canvis en composició i funcionalitat. L'anàlisi de la composició va definir 2 enterotipos amb 51 gèneres microbians i 91% precisió classificatòria: el enterotipo A enriquit en Hungateiclostridium, Limosilactobacillus, Legionel·la, Lysinibacillus, Phorphyromonas, Methanosphaera i Desulfovibrio i el enterotipo B en Escherichia, Fonticella, Candidatus Amulumruptor, Methanobrevicater, Exiguobacterium, Flintibacter i Coprococcus. Un balanç composicional es va proposar com biomarcador per a predir la predisposició genètica a la deposició de GIM, compost per 26 gèneres microbians amb 93% precisió classificatòria i 69% capacitat predictiva. L'anàlisi de funcionalitat va trobar 240 gens microbians (GM) diferencials amb 95% precisió classificatòria i 230 GM amb ajust linear a GIM amb 79% capacitat predictiva, dels quals 122 GM coincidien amb diferències entre -0,75 i 0,73 DE. Major biosíntesi de lipopolisacàrids i peptidoglicans, associat al desenvolupament de massa grassa, biosíntesi de AAA, associat a trastorns relacionats a la deposició grassa, i conversió de propionat a acetat, relacionat amb major lipogènesis en el fetge i menor síntesi de C15:0 i C17:0, es va trobar en la línia A. A més, es va trobar major degradació de BCAA en la línia B, associat amb menor síntesi de triglicèrids en el fetge. L'anàlisi metabolòmico del cec va trobar 142 metabòlits diferencials amb 99% precisió classificatòria i diferències entre -1,03 i 1,19 DE; 156 relacionats amb GIM en la línia A amb 61% capacitat predictiva; i 107 relacionats amb GIM en la línia B amb 57% capacitat predictiva. Diferències en el metabolisme de les purins podrien suggerir major eficiència energètica i en la utilització del nitrogen en la línia B, i diferències en AB-2º, AAA i BCAA van ser consistents amb els resultats anteriors. Un balanç composicional es va proposar com biomarcador compost per 2 AB-2º i 2 subproductes de les proteïnes, amb 88% de precisió classificatòria, suggerint que la interacció entre absorció lipídica i metabolisme de proteïnes de la dieta influeixen en la GIM. De validar-se, podria usar-se per a predir la predisposició genètica a la deposició de GIM. / [EN] The Thesis aimed to study the genetically determined mechanisms involved in intramuscular fat (IMF) deposition, using two lines divergently selected for IMF in Longissimus thoracis et Lumborum (LTL) muscle of rabbits (H and L lines). It comprises five studies focused on studying the host and microbiome roles using metabolomics and metagenomics approaches. The response to selection in the 10th generation was 0.49g IMF/100g LTL, equivalent to 3.8 standard deviations (SD). Selection led to a positive correlated response in carcass adiposity, and to changes in the fatty acids (FA) of LTL, showing greater saturated (H-L= 5.05g/100g IMF) and monounsaturated FA (H-L= 5.04g/100g IMF) in the H line. No differences were found in liver fat, but they were found in its FA profile, being the most notorious the lower C15:0 (H-L= -0.04g/100g lipids) and C17:0 (H-L= -0.09g/100g lipids) in the H line, which could be due to different microbial digestion. The plasma metabolomics analysis identified 393 differential metabolites with 95% classification accuracy, and 383 metabolites with linear adjustment to IMF and 65% prediction ability, from which 322 overlapped with differences ranging from -6.04 to +1.97 SD. Lipids were greater in the L line (e.g., triglycerides, secondary bile acids, FA) while carnitine was lower, suggesting greater intestinal lipids absorption in the L line, followed by their lower uptake and storage, possibly related to lower FA ß oxidation. Among amino acids, branched-chain (BCAA) and aromatic (AAA) stood out, indicating lower BCAA gut degradation in the H line followed by greater host catabolism, and a complex host-microbiome AAA metabolism. The caecum metagenomics analysis confirmed the microbial relevance in IMF development, identifying changes in its composition and functionality. The microbial composition analysis defined two enterotypes with 51 microbial genera and 91% classification accuracy. The H-enterotype was enriched in Hungateiclostridium, Limosilactobacillus, Legionella, Lysinibacillus, Phorphyromonas, Methanosphaera and Desulfovibrio, and the L-enterotype in Escherichia, Fonticella, Candidatus Amulumruptor, Methanobrevicater, Exiguobacterium, Flintibacter and Coprococcus. A compositional balance was proposed as biomarker to predict the genetic predisposition to IMF deposition, composed of 26 microbial genera, with 93% classification accuracy and 69% prediction ability. The microbial functionality analysis identified 240 differential microbial genes (MG) with 95% classification accuracy, and 230 MG with linear adjustment to IMF and 79% prediction ability, from which 122 overlapped with differences ranging from -0.75 to +0.73 SD and related to numerous metabolisms. In the H line, greater lipopolysaccharides and peptidoglycans biosynthesis, related to fat-mass development, AAA biosynthesis, related to associated disorders of increased fat deposition, and propionate to acetate conversion, related to greater liver lipogenesis and lower C15:0 and C17:0 synthesis, were found. Additionally, greater BCAA degradation was found in the L line, related to lower triglycerides synthesis in the liver. The caecum metabolomics analysis identified 142 differential metabolites with 99% classification accuracy and differences ranging from -1.03 to +1.19 SD; 156 related to IMF in the H line with 61% prediction ability; and 107 related to IMF in the L line with 57% prediction ability. Differences found in purine metabolism could suggest greater energy and nitrogen utilization efficiencies in the L line, while those in secondary bile acids, AAA and BCAA were consistent with the previous results. A compositional balance composed of two secondary bile acids and two proteins by-products with 88% classification accuracy was proposed as biomarker, suggesting that the interaction between lipids absorption and dietary proteins metabolism influences IMF. If validated, it could be used to predict the genetic predisposition to IMF deposition. / Zubiri Gaitán, A. (2024). Intramuscular Fat Deposition in Rabbits: Insights into Host-Microbiome Biological Mechanisms [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202875