Application of molecular techniques for identification and enumeration of acetic acid bacteria:Los principales objetivos de la tesis son el desarrollo de técnicas de biología molecular rápidas y fiables para caracterizar bacterias acéticas.Las bacterias acéticas son las principales responsables del picado de los vinos y de la producción de vinagre. Sin embargo, existe un desconocimiento importante sobre su comportamiento y evolución. Las técnicas de enumeración y de identificación basadas en características fisico-químicas existentes son lentas y poco fiables mientras que las técnicas moleculares utilizadas son muy lentas y excesivamente caras y no son aplicables en un trabajo de rutina en el laboratorio ni adecuadas para una gran cantidad de muestras. En primer lugar se ha conseguido identificar a nivel de especie, mediante dos técnicas de biología molecular como son la PCR-RFLP del rDNA 16S y PCR-RFLP del rDNA 16S-23S ITS. Se lograron identificar todas las especies de bacterias acéticas existentes hasta el momento mediante la combinación de ambas técnicas. Estas técnicas se han utilizado también en estudios ecológicos.Se han desarrollado dos técnicas para la caracterización a nivel de cepa: ERIC- y REP-PCR. Estas técnicas han permitido la realización de estudios ecológicos en fermentaciones en distintas condiciones, permitiendo profundizar en el conocimiento de su comportamiento y desarrollo en fermentaciones vínicas. Se han desarrollado dos técnicas para la enumeración, real-time PCR y la detección nested-PCR respectivamente de bacterias acéticas. Estas técnicas presentan la ventaja de no tener que cultivar y por lo tanto de detectar la presencia de bacterias viables pero no cultivables, que han sido descritas dentro de las bacterias acéticas.Artículos en revistas internacionales:A González, N Hierro, M Poblet, N Rozès, A Mas, JM Guillamón: Application of molecular methods for the differentiation of acetic acid bacteria in a red wine fermentation Journal of Applied Microbiology, 96, 853-860, 2004A González, N Hierro, M Poblet, A Mas, JM Guillamón: Application of molecular methods to demonstrate species and strain evolution of acetic acid bacteria population during wine production. International Journal of Food Microbiology (en prensa), 2005. A González, JM Guillamón, A Mas, M Poblet: Application of molecular methods for routine identification of acetic acid bacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (enviado).A. González, Núria Hierro, Montserrat Poblet, Albert Mas and José Manuel Guillamón. Enumeration and detection of acetic acid bacteria by real-time PCR and nested-PCR. FEMS Microbial Letters. (enviado).JM Guillamón, Hierro, N., A González, A Mas: New PCR-based methods for yeast identification. Journal of Applied Microbiology, 97, 792-801; 2004.Núria Hierro, Ángel González, Albert Mas, José Manuel Guillamón.(2005) Diversity and evolution of non-Saccharomyces yeast populations during wine fermentations: Efecto of grape ripeness and cold maceration. FEMS yeast research. (enviado).Artículos en revistas nacionales:A Mas, A González, N Hierro, M Poblet, N Rozès, JM Guillamón: Bacterias acéticas durante la fermentación vínica: Interacciones con otros microorganismos. Tecnología del vino, 11: 27-30, 2003.A Mas, N Hierro, JM Guillamón, A González, M Poblet, N Rozès: Nuevas técnicas de identificación, detección y cuantificación de levaduras de importancia en Enología. Tecnología del vino, 15, 65-70, 2004. Y. Quintero, A González, M Poblet, JM Guillamón, A Mas: Importancia de las bacterias acéticas en el vino. Enorigen, 1, 6-12, 2004Congresos y capítulos:A. González, M. Poblet, N. Rozés, JM. Guillamón, A. Mas. Desarrollo de técnicas moleculares de análisis de bacterias acéticas. Valencia, España. Gienol, 2001.A. González, N. Hierro, M. Poblet, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. Development of molécular techniques for the análisis of acetic acid bacteria. París, Francia. Xth international congress of Bacteriology and applied microbiology. 2002.J.M. Guillamón, A. González, M. Poblet, A. Mas. Development of molecular techniques for the analysis of acetic acid bacteria in winemaking. En: Yeast-Bacteria Interactions. Lallemand Tecnical Meetings, 10. Lallemand, S.A., 45-49, 2002.N. Hierro, A. González, N. Rozès, A. Mas, J.M. Guillamón: Nuevos métodos de identificación de levaduras basados en PCR. VII Jornadas Grupos de Investigación Enológica. Logroño.195-197, 2003Gonzalez, A.; Hierro, N.; Chiva, R.; Poblet, M.; Rozès, N.; Mas, A.; Guillamón, JM.: Dinámica poblacional de las bacterias acéticas en fermentaciones de vino tinto. VII Jornadas Grupos de Investigación Enológica. Logroño. 204 - 206. 2003.A. González, N. Hierro, M. Poblet, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. Population dynamics of acetic acid bacteria during red wine fermentations. 1st FEMS congress of European microbiologists. Lubiana, Eslovenia, 2003.N. Hierro, A. González, A. Mas, JM Guillamón. New PCR-based methods for yeast identification. Ponencia. Budapest, Hungría. ISSY 2003J.M. Guillamón, A. González, N. Hierro, N. Rozès, A. Mas, M. Poblet: Técnicas de identificación de bacterias acéticas. En: Primeras Jornadas de I+D+i en la Elaboración de Vinagres de vino. URV-CeRTA. 9-16, 2003.A. González, N. Hierro, M. Poblet, A. Mas, N. Rozès, J.M. Guillamón Bacterias acéticas durante la fermentación vínica. En: Primeras Jornadas de I+D+i en la Elaboración de Vinagres de vino. URV-CeRTA. 25-30, 2003.JM Guillamón, A González, M Poblet, A Mas: I microorganismi dell'Aceto Balsamico. Modena. 2004A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Quantification of acetic acid bacteria in wine and vinegar samples using rt-PCR. Badajoz, España. BioMicroWorld 2005.J.M. Guillamón, A. González, M. Poblet, A. Mas: Molecualr techniques of identification and quantification of acetic acid bacteria. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.A. Mas, A. González, J.M. Guillamón, M. Poblet: Acetic acid bacteria population dynamics during wine fermentation. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.F. Barja, A. González, M. Mesa, M. Macías, D. Cantero. Molecular and morphological characterization of acetic acid bacteria from industrial fermenters of wine vinegar production. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Quantitative-PCR for rapid detection of acetic acid bacteria. Vinegars and Acetic Acid Bacteria International Symposium. Reggio Emilia, 2005.N. Hierro, A. González, N. Rozés, A. Mas, JM. Guillamón. PCR-cuantitativa para la detección y cuantificación de levaduras vínicas. Palencia, España. Gienol, 2005.A. González, N. Hierro, M. Poblet, JM. Guillamón, A. Mas. Evolución de la población de las cepas de bacterias acéticas durante la fermentación alcohólica. Palencia, España. Gienol, 2005.Application of molecular techniques for identification and enumeration of acetic acid bacteria:The main objectives of the present thesis is the development of fast and reliable molecular techniques for the identification and characterization of acetic acid bacteria.Acetic acid bacteria are the main responsible of the acetification of the wines and of the Viniegra production. However, there is an important lack of knowledge about their behaviour and evolution through the different processes they are involved. The techniques of enumeration and identification based on their chemo-taxonomic properties are tedious and not reliable meanwhile molecular techniques already used are slow, tedious, very expensive and not useful for routine analysis of big amounts of samples in the laboratory.We have been able to identify at species level, with two molecular techniques such as PCR-RFLP del rDNA 16S and PCR-RFLP del rDNA 16S-23S ITS. We were able to identify all the described acetic acid bacteria species with the combination of the two techniques. Those, have also been used in ecological studies in wine.We have developed two techniques for the characterization of aceic acid bacteria at strain level: ERIC- and REP-PCR. Those techniques have allowed us the development of ecological studies in wine fermentations in different condition, allowing us to improve our knowledge about these bacteria behaviour and development through the wine fermentations.We have developed two techniques for the enumeration, real-time PCR and for the detection, nested-PCR respectively of acetic acid bacteria. Those techniques allow us not to plate the samples before the analysis, therefore they allow the detection of the viable but non-culturable cells, already describes inside the acetic acid bacteria.

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A utilização de técnicas moleculares têm facilitado o estudo de comunidades bacterianas complexas no ambiente. O presente trabalho teve como objetivo utilizar a técnica DGGE para avaliação dos efeitos do aumento da temperatura, causado pela queima de um canavial, na estrutura da comunidade bacteriana de solo, com ênfase ao grupo dos actinomicetos. Foram coletadas amostras de solo em diferentes profundidades, antes e depois da queima, e dados físico-químicos e climáticos associados. O DNA da comunidade bacteriana foi amplificado utilizando conjunto de primers específicos para o Domínio Bacteria e para o grupo de actinomicetos, e os produtos de amplificação analisados por DGGE. Resultados obtidos para as populações de actinomicetos não foram conclusivos. Apesar da variação dos parâmetros físico-químicos do solo provocadas pela queima, os padrões de bandas obtidos com os primers para o Domínio Bacteria, apresentaram-se uniformes. Sendo assim, nas condições de estudo deste trabalho, os resultados obtidos não revelaram alterações na estrutura da comunidade bacteriana do solo de canavial depois da queima. / The utilization of molecular techniques has facilitated the study of complex bacterial communities in the environment. The present study aimed at using DGGE technique to evaluate the effect of temperature variation, caused by sugar-cane plantation burn, in the soil bacterial community structure emphasizing the actinomycete group. Soil samples from different depths, were collected before and after the bum, as well as physical-chemical and climatic associated data. The bacterial community DNA was amplified using a specific primer set and the amplification products analyzed by DGGE. The results obtained for the actinomycete populations were not conclusive. Despite the variation of the soil parameters caused by the burn, the band patterns obtained used in this study were uniform. Therefore, under the conditions used in this study, the results obtained did not show any alteration in the structure of soil bacterial community associated with sugar-cane plantation after the burn.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Plantas apresentando folhas com deformações do tipo bolhas, menor quantidade de vagens de tamanho reduzido e contendo menor número de sementes, vagens que não completaram a maturação e coloração verde da parte aérea no final do ciclo foram observadas em campos de produção. As plantas foram analisadas visando à detecção de fitoplasmas e a sua identificação molecular. Para isto, o DNA total das plantas amostradas foi submetido ao teste de duplo PCR conduzido com primers específicos para a região do 16S rDNA de fitoplasmas. As amplificações evidenciaram que fitoplasmas estavam presentes em tecidos de plantas sintomáticas. O duplo PCR realizado com primers grupo-específicos revelou a ocorrência de fitoplasmas afiliados aos grupos 16SrI e 16SrIII. As análises virtuais de RFLP, baseadas no sequenciamento da referida região genômica, permitiram identificar um dos fitoplasmas como pertencente ao subgrupo 16SrI-B. Os valores de coeficientes de similaridade, calculados com base nos padrões de restrição gerados in silico por 17 enzimas, confirmaram a identidade deste fitoplasma. Ainda, mapas de restrição mostraram que o fitoplasma encontrado em plantas de soja apresentava sítios putativos de restrição idênticos a um fitoplasma típico do grupo 16SrI-B. A análise filogenética, envolvendo o fitoplasma alvo deste estudo e fitoplasmas representantes de alguns grupos e subgrupos relatados no Brasil, mostrou que o fitoplasma da soja estava estritamente relacionado com aqueles componentes do grupo 16SrI. O fitoplasma em estudo emergiu do mesmo ramo da árvore filogenética também compartilhado por fitoplasmas do grupo 16SrI, confirmando os resultados dos demais testes moleculares. Os resultados gerados neste trabalho evidenciaram que a soja pode ser considerada como mais um hospedeiro de fitoplasmas pertencentes aos grupos 16SrI e 16SrIII, os quais tem sido relatados em associação com diversas doenças de plantas que ocorrem no Brasil. Este estudo também gera informações que podem contribuir para aumentar os conhecimentos sobre este emergente grupo de agentes causais de doença. / Plants exhibiting leaf deformation type bubbles, low quantities of pods of reduced size containing few seeds, pods not mature, and green color of stem and leaves in the end of crop growth were observed in commercial fields. The plants were tested for the detection of phytoplasmas and their molecular identification. For this, the total DNA of plants sampled was submitted to nested PCR assays conducted with universal primers for amplification of a fragment corresponding to the 16S rDNA of phytoplasmas. The amplifications revealed the presence of phytoplasmas in tissues of symptomatic plants. For identification, nested PCR performed with group-specific primers demonstrated the occurrence of phytoplasmas affiliated to the groups 16SrI and 16SrIII. The virtual RFLP analysis, based on the sequencing of DNA fragments generated from nested PCR with universal primers, allowed the identification of a phytoplasma belonging to the subgroup 16SrI-B. The values of similarity coefficients, calculated on the basis of restriction patterns generated in silico for 17 enzymes, confirmed the identity of this phytoplasma. Furthermore, restriction maps showed that the phytoplasma found in soybean plants had putative restriction sites identical to those phytoplasma of the group 16SI-B. Phylogenetic analysis, involving the phytoplasma identified in the present study and representatives of some groups and subgroups previously reported in Brazil, showed that the soybean phytoplasma was closely related to phytoplasmas belonging to group 16SrI. The studied phytoplasma and phytoplasmas belonging to group 16SrI emerged from the same branch, confirming the results obtained by PCR and RFLP analysis. Also, based on the results, soybean could be considered as a host for phytoplasmas belonging to the group 16SrI and 16SrIII, which has been reported in association with various diseases that occur in Brazil. The present study may contribute to improve the knowledge about this emerging group of causal agents of disease.

Fitoplasmas são procariotos sem parede celular e habitantes de floema, agentes de doenças que causam danos consideráveis em diversas culturas. O maracujazeiro é uma espécie tropical cultivada em diversas regiões brasileiras. As doenças estão entre os fatores que podem causar danos à cultura e o superbrotamento do maracujazeiro tem se revelado como sendo uma das mais importantes. Esta doença, associada com fitoplasma, foi reportada somente no Brasil, onde foi registrada nos estados do Rio de Janeiro e de Pernambuco, no início da década de oitenta. Embora alguns estudos sobre o assunto tenham sido feitos anteriormente, o presente estudo foi conduzido para: demonstrar a presença constante do agente em associação com plantas doentes; revelar a ocorrência do fitoplasma em algumas áreas pertencentes a alguns estados; identificar, classificar e estudar filogeneticamente o fitoplasma; e demonstrar a patogenicidade do fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro. Em 2005-2006, plantas sintomáticas suspeitas de estarem infectadas por fitoplasma foram amostradas em algumas áreas do estado de São Paulo e vários outros estados brasileiros. A detecção e identificação por PCR duplo foi conduzida com os pares de oligonucleotídeos universais para fitoplasmas R16mF2/mR1-R16 F2n/R2 e pelo par específico R16(III) F2/R1, repectivamente. Para as análises de RFLP foram usadas as enzimas de restrição AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Análises filogenéticas foram baseadas nas seqüências de nucleotídeos do 16S rDNA de fitoplasmas pertencentes a grupos e subgrupos distintos. Os ensaios de patogenicidade foram feitos usando-se enxertia de tecido. Amplificações de fragmentos de DNA de 1,2kb usando-se os oligonuclotídeos universais revelaram a presença de fitoplasma nas plantas sintomáticas de todas as regiões amostradas. Amplificações de fragmentos de DNA de 0,8kb pelos oligonucleotídeos específicos indicaram que o fitoplasma detectado era afiliado ao grupo 16SrIII, enquanto as análises de RFLP confirmaram a identificação feita com base no PCR e mostraram que o fitoplasma pode ser classificado como um membro do subgrupo 16SrIII-B. Sequenciamento e análises filogenéticas revelaram que o fitoplasma do superbrotamento do maracujazeiro é um típico representante do grupo 16SRIII, quando comparado com fitoplasmas de outros grupos. A patogenicidade foi demonstrada através da observação de sintomas típicos da doença, seguida da detecção molecular do fitoplasma in plantas sadias enxertadas com ramos de plantas infectadas. Os resultados obtidos no presente estudo permitiram: confirmar a diagnose baseada na sintomatologia; revelar a associação constante entre planta doente e fitoplasma, confirmando investigações anteriores conduzidas com microscopia eletrônica; identificar o fitoplasma como um membro do grupo 16SrIII-B; demonstrar que o fitoplasma é o agente causal do superbrotamento do maracujazeiro; e mostrar a ocorrência atual do patógeno nos estados da Bahia, do Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe e São Paulo. / Phytoplasmas are cell wall-less prokaryotes and phloem-inhabitants associated with diseases that affect several crops. Passion fruit plant is a tropical species cultivated in various Brazilian regions. Diseases are among factors that may cause damage to this crop and the passion fruit witches\' broom has been revealed as very important one. That disease, associated with phytoplasma, was reported only in Brazil, where it was registered in Rio de Janeiro and Pernambuco States in the beginning of eighty decade. Although some studies about that subject have been made previously, the present study was conducted in order to: demonstrate the constant presence of the agent in association with diseased plants; reveal the occurrence of fitoplasma in some areas belonging to some States; identify, classify and study phylogenetically the phytoplasma; and demonstrate the pathogenicity of passion fruit witches\' broom phytoplasma. In 2005-2006, symptomatic plants suspected of phytoplasma infection were sampled in some areas of São Paulo State and various other Brazilian States. The detection and identification by nested PCR were performed with the universal primer pair R16mF2/mR1-16F2n/R2 and specific pair R16(III)F2/R1, respectively. For RFLP analyses were used the restriction enzymes AluI, HhaI, KpnI, HinfI, HpaII, MseI, RsaI e MboI. Phylogenetic analyses were based on the nucleotide sequences of the 16S rDNA from phytoplasmas belonging to distinct groups and subgroups. Pathogenecity assays were made by using grafting of tissue. Amplifications of DNA fragments of 1.2kb by using universal primer pairs revealed the presence of phytoplasma in the symptomatic plants from all sampled regions. Amplifications of DNA fragments of 0,8kb by specific primer pair indicated that the detected phytoplasma is affiliated to the group 16SrIII, while RFLP analyses confirmed the identification based on PCR and showed that phytoplasma may be classify as a member of the subgroup 16SRIII-B. Sequencing and phylogenetic analysis revealed that the passion fruit witches\'broom phytoplasma is a typical representative of group 16SRIII, when compared with phytoplasmas from other groups. Pathogenicity was demonstrated through the observation of typical symptoms of the disease followed by molecular detection of the phytoplasma in healthy plants grafted with shoots from infected plants. The results obtained in the present study allowed: to confirm the diagnosis based on the symptomatology; to reveal the firm association between diseased plant and phytoplasma, confirming previous investigations conduced by electron microscopy; to identify the phytoplasma as a member of the group 16SRIII-B; to demonstrate that phytoplasma is the causal agent of passion fruit witches\' broom; and to show the present occurrence of the pathogen in the States of Bahia, Paraná, Rio de Janeiro, Sergipe, and São Paulo

A utilização de técnicas moleculares têm facilitado o estudo de comunidades bacterianas complexas no ambiente. O presente trabalho teve como objetivo utilizar a técnica DGGE para avaliação dos efeitos do aumento da temperatura, causado pela queima de um canavial, na estrutura da comunidade bacteriana de solo, com ênfase ao grupo dos actinomicetos. Foram coletadas amostras de solo em diferentes profundidades, antes e depois da queima, e dados físico-químicos e climáticos associados. O DNA da comunidade bacteriana foi amplificado utilizando conjunto de primers específicos para o Domínio Bacteria e para o grupo de actinomicetos, e os produtos de amplificação analisados por DGGE. Resultados obtidos para as populações de actinomicetos não foram conclusivos. Apesar da variação dos parâmetros físico-químicos do solo provocadas pela queima, os padrões de bandas obtidos com os primers para o Domínio Bacteria, apresentaram-se uniformes. Sendo assim, nas condições de estudo deste trabalho, os resultados obtidos não revelaram alterações na estrutura da comunidade bacteriana do solo de canavial depois da queima. / The utilization of molecular techniques has facilitated the study of complex bacterial communities in the environment. The present study aimed at using DGGE technique to evaluate the effect of temperature variation, caused by sugar-cane plantation burn, in the soil bacterial community structure emphasizing the actinomycete group. Soil samples from different depths, were collected before and after the bum, as well as physical-chemical and climatic associated data. The bacterial community DNA was amplified using a specific primer set and the amplification products analyzed by DGGE. The results obtained for the actinomycete populations were not conclusive. Despite the variation of the soil parameters caused by the burn, the band patterns obtained used in this study were uniform. Therefore, under the conditions used in this study, the results obtained did not show any alteration in the structure of soil bacterial community associated with sugar-cane plantation after the burn.

Abstract Helicobacter pylori occupies a prominent position among emerging human pathogens, one of the most common causes of chronic bacterial infection in humanity and closely linked to peptic ulcers and gastric cancer. It has been suggested that H.pylori can be acquired by different routes of transmission, including water. The growing demand for water due to increasing world population and the concurrent expansion of the industry necessitates the use of treated wastewater. However, H. pylori resistance to water disinfection treatment constitutes a risk to health. Similarly, H.pylori has resilience to water purification treatments and at high concentrations of free chlorine in distribution systems by biofilm formation. The VBNC state of H.pylori in both matrices is the usual in stress conditions, necessitating the application of molecular techniques for detection and identification. In this thesis we have studied the presence and viability of this important pathogen in both wastewater and drinking water. A total of 60 wastewater samples, including samples of the biological reactor inlet, the outlet of this one and samples after tertiary ultraviolet disinfection treatment, were analyzed for the presence of H.pylori by PCR, q-PCR and FISH and the traditional cultivable technique. The FISH technique proved to be an effective and rapid method for the detection of H. pylori in waste and debugged water (61.2 %), without the need for a preliminary step enrichment of samples. The PCR and q-PCR techniques determined the presence of H. pylori in the samples, with detection rates of both 15 %. It was possible to quantify only in 3 direct samples belonging to the reactor inlet and outlet (1.8x10; 1.5x10 and 6.3x10 GU/mL), the other samples had the Ct above the threshold of reliability (> 35 cycles). Although the culture turned out to be a not fully resolutive method, the method of isolation by 0.65 µm membrane, tuned in this thesis, was effective in reducing the accompanying microbiota and to obtain cultivable H. pylori for the first time from debugged water. Similarly, 63 drinking water samples from 51 public drinking water sources located on the coastal area in Eastern Spain, were analyzed and could be confirmed for the first time the presence of viable cells of the pathogen in drinking water. FISH and q-PCR techniques were effective for detecting H. pylori with detection rates of 46 % and 50.8 % respectively. For detection of viable cells of H. pylori in drinking water DVC-FISH technique it proved to be a more effective tool than the PMA-qPCR, with a detection rate of 38 % viable cells. Quantitation of viable cells was possible by obtaining values between 4x102 and 1.6x103 viable cells of H.pylori/mL. Despite the difficulty of culturing the pathogen H. pylori it was identified in a sample after 24 hours enrichment. Detection of mutations in the 23S, in specific resistance to clarithromycin, indicated that 41.6% of the samples of wastewater and 17.4% of drinking water samples had H.pylori with this potential resistance. The results confirm the ability of H.pylori to survive the water purification treatments in a wastewater treatment plant, it should be considered when evaluating the potential risk in reuse for irrigation. Moreover, H.pylori is found in the distribution systems of drinking water, so its consumption may be a risk to human health, since they are a possible route of transmission of the pathogen. The presence of clarithromycin-resistant H.pylori in the environment, show the need to monitor effective control of the pathogen, since water can pose a risk to the expansion of resistance and consequent therapeutic failures in clinical practice. Given the role of water in the transmission of H.pylori, confirmed in this thesis, the established protocols are proposed, mainly the DVC-FISH method, as they can be validated for an efficient environmental control of H.pylori. / Resumen Helicobacter pylori ocupa una posición destacada entre los patógenos humanos emergentes, siendo una de las causas más comunes de infección crónica bacteriana en la humanidad y estrechamente relacionada con la úlcera péptica y el cáncer gástrico. Se ha sugerido que H.pylori puede ser adquirido por diferentes vías de transmisión, entre ellas el agua. El aprovechamiento de las aguas residuales depuradas y la resistencia de H. pylori a los tratamientos de desinfección del agua constituye un riesgo para la salud. De igual forma, H.pylori presenta capacidad de resistencia a tratamientos de potabilización y a concentraciones elevadas de cloro libre en los sistemas de distribución gracias a la formación de biopelículas. El estado VNC de H.pylori, en ambas matrices, hace necesario la aplicación de técnicas moleculares para su detección e identificación. En esta tesis doctoral se ha estudiado la presencia y viabilidad de este importante patógeno tanto en agua residual como potable. Un total de 60 muestras de agua residual, incluyendo muestras de la entrada del reactor biológico, de la salida de éste y tras el tratamiento de desinfección con UV, se analizaron para detectar la presencia de H. pylori mediante las técnicas moleculares PCR, q-PCR y FISH y cultivo en placa. La técnica FISH resultó ser un método eficaz y rápido para la detección de H. pylori en las aguas residuales y depuradas (61.2 %), sin la necesidad de un paso previo de enriquecimiento de las muestras. Las técnicas PCR y q-PCR determinaron la presencia de H.pylori en las muestras, con porcentajes de detección de ambas del 15 %. Fue posible cuantificar únicamente en 3 muestras directas, pertenecientes a la entrada y salida del reactor (1.8x10; 1.5x10 y 6.3x10 GU/ mL). Aunque el cultivo resultó ser un método poco resolutivo, el método de aislamiento mediante membrana de 0.65 µm, puesto a punto en esta tesis doctoral, resultó eficaz para reducir la microbiota acompañante y poder obtener H.pylori cultivable por primera vez a partir de aguas depuradas. De igual modo, se analizaron 63 muestras de agua potable procedentes de 51 fuentes públicas de agua potable, pudiendo confirmar por primera vez la presencia de células viables del patógeno en aguas de consumo. Las técnicas FISH y q-PCR resultaron eficaces para la detección de H. pylori con unas tasas de detección de 46 % y 50.8 % respectivamente. Para la detección de células viables de H.pylori en agua potable la técnica DVC-FISH resultó ser una herramienta efectiva. Fue posible la cuantificación de células viables obteniendo valores comprendidos entre 4x102 y 1.6x103 células viables de H. pylori /mL. A pesar de la dificultad de cultivar el patógeno, se identificó H. pylori en una muestra tras el enriquecimiento de 24 horas. La detección de mutaciones en el 23S, específicas en la resistencia a la claritromicina, indicó que el 41.6% de las muestras de agua residual y el 17.4 % de las muestras de agua potable presentaban H.pylori con dicho potencial. Los resultados obtenidos confirman la capacidad de H.pylori de sobrevivir a los tratamientos de depuración del agua en una estación de depuración de aguas residuales, lo que debería ser considerado al evaluar el riesgo potencial de su reutilización para el riego. Por otra parte, H.pylori se encuentra en los sistemas de distribución de agua potable, por lo que el consumo de éstas puede representar un riesgo para la salud humana. La presencia de H.pylori resistente a la claritromicina en el ambiente, evidencia la necesidad de monitorizar un control eficaz del patógeno, ya que el agua puede suponer un riesgo para la expansión de las resistencias, y los consiguientes fallos terapéuticos en la práctica clínica. Dado el papel del agua en la transmisión de H. pylori, confirmado en esta tesis doctoral, se proponen los protocolos establecidos, principalmente el método DVC-FISH, como validables para el / Resum Helicobacter pylori ocupa una posició destacada entre els patògens humans emergents, sent una de les causes més comuns d'infecció crònica bacteriana en la humanitat i estretament relacionada amb l'úlcera pèptica i el càncer gàstric. S'ha suggerit que H. pylori pot ser adquirit per diferents vies de transmissió, entre elles l'aigua. L'aprofitament de les aigües residuals depurades i la resistència d'H. pylori als tractaments de desinfecció de l'aigua constitueix un risc per a la salut.De la mateixa manera, H. pylori presenta capacitat de resistència a tractaments de potabilització i a concentracions elevades de clor lliure en els sistemes de distribució gràcies a la formació de biopel¿lícules. L'estat VNC de H. pylori, en ambdues matrius, fa necessari l'aplicació de tècniques moleculars per a la seva detecció i identificació. En aquesta tesi doctoral s'ha estudiat la presència i viabilitat d'aquest important patogen tant en aigua residual com potable. Un total de 60 mostres d'aigua residual, incloent mostres de l'entrada del reactor biològic, de la sortida d'aquest i després del tractament de desinfecció amb UV, es van analitzar per detectar la presència de H. pylori mitjançant les tècniques moleculars PCR, q-PCR i FISH i cultiu en placa. La tècnica FISH va resultar ser un mètode eficaç i ràpid per a la detecció de H. pylori en les aigües residuals i depurades (61.2 %), sense la necessitat d'un pas previ d'enriquiment de les mostres. Les tècniques PCR i q-PCR van determinar la presència de H. pylori en les mostres, amb percentatges de detecció de les dues del 15 %. Va ser possible quantificar únicament en 3 mostres directes, pertanyents a l'entrada i sortida del reactor (1.8x10; 1.5x10 i 6.3x10 GU/mL). Tot i que el cultiu va resultar ser un mètode poc resolutiu, el mètode d'aïllament mitjançant membrana de 0.65 µm, posat a punt en aquesta tesi doctoral, va resultar eficaç per reduir la microbiota acompanyant i poder obtenir H. pylori cultivable per primera vegada a partir d'aigües depurades. De la mateixa manera, es van analitzar 63 mostres d'aigua potable procedents de 51 fonts públiques d'aigua potable, i confirmar per primera vegada la presència de cèl¿lules viables del patogen en aigües de consum. Les tècniques FISH i q-PCR van resultar eficaces per a la detecció de H. pylori amb unes taxes de detecció de 46 % i 50.8 % respectivament. Per a la detecció de cèl¿lules viables de H. pylori en aigua potable la tècnica DVC-FISH va resultar ser una eina efectiva. Va ser possible la quantificació de cèl¿lules viables obtenint valors compresos entre 4x102 i 1.6x103 cèl¿lules viables d'H. pylori /mL. Tot i la dificultat de conrear el patogen, es va identificar H. pylori en una mostra després de l'enriquiment de 24 hores. La detecció de mutacions en el 23S, específiques en la resistència a la claritromicina va indicar que el 41.6 % de les mostres d'aigua residual i el 17.4 % de les mostres d'aigua potable presentaven H. pylori amb aquest potencial. Els resultats obtinguts confirmen la capacitat de H. pylori de sobreviure als tractaments de depuració de l'aigua en una estació de depuració d'aigües residuals, el que hauria de ser considerat en avaluar el risc potencial de la seva reutilització per al reg. D'altra banda, H. pylori es troba en els sistemes de distribució d'aigua potable, per la qual cosa el consum d'aquestes pot representar un risc per a la salut humana. La presència de H. pylori resistent a la claritromicina en l'ambient, evidència la necessitat de monitoritzar un control eficaç del patogen, ja que l'aigua pot suposar un risc per a l'expansió de les resistències, i els consegüents errors terapèutics en la pràctica clínica. Donat el paper de l'aigua en la transmissió d'H.pylori, confirmat en aquesta tesi doctoral, es proposen els protocols establerts, principalment el mètode DVC-FISH, com validables per al control ambient / Santiago Cuéllar, P. (2016). TRANSMISIÓN DE HELICOBACTER PYLORI A TRAVÉS DEL AGUA: ESTUDIO DE LA PRESENCIA DEL PATÓGENO E IDENTIFICACIÓN DE FORMAS VIABLES MEDIANTE TÉCNICAS MOLECULARES [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75086 / TESIS

A interação entre bactérias e plantas resulta na ocorrência de vários processos biológicos no ambiente e pode ser regulada por diferentes fatores. Considerando que um recíproco reconhecimento ocorre entre as espécies de bactérias e plantas, alterações nos fatores bióticos e abióticos interferem diretamente nesta interação levando a modificações na composição das comunidades bacterianas associadas às plantas. No presente trabalho foram avaliados diferentes fatores que estão diretamente relacionados a este assunto. Atualmente, a aplicação de técnicas de microbiologia molecular permite acessar alterações causadas nestas comunidades de maneira independente do cultivo bacteriano. Desta maneira, foi demonstrado que na rizosfera de plantas de tabaco, os diferentes estágios de desenvolvimento são os principais determinantes da composição da comunidade bacteriana em detrimento do genótipo das plantas, sejam estas transgênicas ou convencionais. Utilizando plantas transgênicas e convencionais de eucalipto de diferentes genótipos, foi verificado que diferentes plantas não transgênicas podem apresentar comunidades bacterianas mais distintas do que quando os clones não transgênicos são comparados com os transgênicos. No entanto, efeitos específicos podem ocorrer na interação bactéria-planta, como o observado pela inibição da população de Methylobacterium spp. em plantas transgênicas de eucalipto TR-15. Avaliando o efeito da inoculação de bactérias endofíticas na composição de comunidades bacterianas associadas à plantas de batata de diferentes cultivares, os resultados mostram que a inoculação de Pseudomonas putida altera a comunidade bacteriana de maneira similar a alteração da variedade da planta. Os demais isolados avaliados, classificados como Paenibacillus sp. e M. mesophilicum, causam menores alterações na composição das comunidades bacterianas. Adicionalmente foi demonstrado que a colonização das plantas de batata pelo endófito P. putida resulta em pequena alteração no perfil metabólico da planta hospedeira. Por fim, buscando melhores métodos de isolamento da comunidade bacteriana da rizosfera de batata, os resultados mostraram que a mimetização do ambiente pode resultar em melhor acesso da diversidade bacteriana por meio de isolamento e cultivo das espécies componentes desta comunidade. / The plant-bacteria interactions result in the occurrence of biological process in the environment and might be regulated by different factors. Considering that a reciprocal recognition occur amongst bacteria and plants species, shifts in biotic and abiotic factors interfere directly on these interactions, leading to modifications in the composition of bacterial communities to plants associated. In the present work different factors related to this subject were evaluated. Nowadays, the applications of techniques of molecular microbiology allow assessing the shifts caused on these communities by a culture independent approach. On this way, it was demonstrated that in rhizosphere of tobacco plants, different stages of plants development are main determinants of bacterial community composition rather than the plants genotypes, transgenic or not. Using plants transgenic or not, carrying different genotypes, it was verified that different non-transgenic plants could harbor bacterial communities more distinct than those observed in association with transgenic plants. However, specific effects could be observed like the inhibition of Methylobacterium spp. population in eucalyptus transgenic plants TR-15. Considering the effect of endophytic bacteria inoculation in the composition of bacterial communities associated to different cultivars of potato plants, the results show that inoculation of Pseudomonas putida causes similar shifts in the bacterial community similarly to those observed when different cultivars are considered. Other evaluated strains, classified as Paenibacillus sp. and M. mesophilicum, caused minor alterations in the composition of bacterial communities. In addition, it was demonstrated that plant colonization by endophytic P. putida results in small effects on the metabolic profile of host plant. At least, aiming better methodologies for bacteria isolation from potato rhizosphere, the results show that mimicking the natural environment could result in a better assessment of bacterial diversity by isolation of species present in this community.