Reproduction de : Thèse de doctorat : Médecine.Biologie cellulaire : Reims : 2007. / Bibliographie f.115-134.

De nombreux obstacles freinent le développement d'un vaccin efficace contre le VIH. Pour franchir ces barrières, le recours aux adjuvants est une option prometteuse. Dans ce contexte, l'objectif de ce doctorat est l'évaluation de combinaisons de ligands de PRR et de particules biodégradables pour la vaccination muqueuse. La première partie de l'étude vise à analyser la valeur ajoutée de molécules hybrides composée de deux ligands de PRR comparée à la co-administration des deux agonistes. Des molécules stimulant TLR7 et TLR2 puis TLR7 et NOD2 ont été évaluées. Nous avons démontré l'intérêt de l'association de ligands de PRR au sein d'une même molécule, pour l'induction de réponses immunitaires systémiques et muqueuses. Des études récentes ont montré l'intérêt d'agonistes de STING comme adjuvant vaccinaux. Nous avons étudié l'induction de réponses immunitaires par les agonistes de STING, administrés par voie parentérale ou muqueuse. Nous avons démontré le fort potentiel de ligands de STING pour l'induction de réponses cellulaires et muqueuses. Lors de ces études, nous avons démontré que l'intérêt de la vectorisation d'agonistes de PRR dépend de la molécule. En effet, bien que la vectorisation d'une molécule hybride TLR7/TLR2 n'ait pas d'impact sur la réponse immunitaire induite, la vectorisation d'agonistes de STING potentialise leur effet immunostimulant. Pour finir, nous avons montré que la voie d'administration a un impact sur la réponse immunitaire induite. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, une étude de biodistribution des formulations de NP de PLA après administration par voie systémique ou muqueuse a été réalisée / There are many barriers to the development an effective HIV vaccine. The use of adjuvants is a promising option to overcome these obstacles. In this context, the objective of this PhD is the evaluation of combinations of PRR ligands and biodegradable particles for mucosal vaccination.The first part of this study aimed at assessing the added value of hybrid molecules composed of two PRR ligands compared to the co-administration of the two agonists. TLR7 and TLR2 stimulating molecules followed by TLR7 and NOD2 were evaluated. We demonstrated the interest of the association of PRR ligands within the same molecule for the induction of systemic and mucosal immune responses.Recent studies showed the interest of STING agonists as a vaccine adjuvant. We investigated the induction of immune responses by STING agonists administered parenterally or mucosally. We confirmed the strong potential of STING ligands for the induction of cellular and mucosal responses.In these studies, we demonstrated that the interest of vectorization of PRR agonists depends on the molecule. Indeed, although the encapsulation of a TLR7/TLR2 hybrid molecule has no impact on the induced immune response, the vectorization of STING agonists potentiates their immunostimulatory effect.Finally, we showed that the route of administration has an impact on the immune response induced. In order to better understand the mechanisms involved, a biodistribution study of PLA NP formulations after systemic or mucosal administration was performed

L’asthme est en progression et 5 à 10 % des asthmatiques sont réfractaires aux traitements. L’administration d’agonistes spécifiques du récepteur 1 de la sphingosine-1-phosphate (S1PR1) dans le poumon inhibe l’inflammation pulmonaire allergique dans un modèle murin d’asthme. Cependant, les mécanismes et les cellules cibles sont inconnus. Puisque les altérations des cellules épithéliales (CE) bronchiques contribuent à la pathogenèse de l’asthme, l’activation de S1PR1 a été évaluée dans l’atténuation des dysfonctions que présentent les CE bronchiques d’un modèle d’asthme de rats et humaines. La surexpression de S1PR1 par les CE bronchiques de rats asthmatiques et humaines semble bénéfique dans la réduction des dysfonctions épithéliales puisque l’activation spécifique par CYM-5442 augmente l’étanchéité paracellulaire et réduit la libération d’une chimiokine, CCL2 (MCP-1), dans un contexte inflammatoire. Donc, il semble que la protéine S1PR1 soit impliquée dans le maintien de l’homéostasie pulmonaire. Cette voie métabolique pourrait être approfondie afin de contrôler l’asthme réfractaire. / Asthma is in progression and 5 to 10 % of asthmatics are refractory to current interventions. In the lung, activation of sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1PR1) by specific agonists inhibits allergic airway inflammation in a murine model of asthma. However, cellular mechanisms and targeted cells are unknown. Since dysfunctions of bronchial epithelial cells (BEC) are central in asthma pathogenesis, activation of S1PR1 was evaluated in the reversal of BEC dysfunctions in a model of asthma and in human cells. Upregulation of S1PR1 in BEC of rats with experimental asthma and in human cells reversed epithelial cell dysfunctions. Indeed activation of S1PR1 by the specific agonist CYM-5442 decreases paracellular permeability and reduces the release of chemokine, under proinflammatory conditions. Therefore, S1PR1 seems to be involved in maintaining pulmonary homeostasis. This metabolic pathway could be of interest for controlling refractory asthma.

Le mémoire suivant présente deux projets de recherche dans deux domaines spécifiques sans lien entre les deux. Le premier projet portait sur la comparaison entre la muqueuse nasale et le polype chez un même sujet en relation avec la présence ou la sévérité de l'asthme. Nous avons observé que la muqueuse nasale semble plus différenciée que le polype chez des sujets présentant une polypose nasale, qu'ils soient asthmatiques ou non. De plus, le processus de remodelage serait également plus important dans le polype nasal comparé à la muqueuse nasale. Le deuxième projet consistait à comparer la fonction respiratoire et la présence de cellules inflammatoires dans l'expectoration induite chez les sujets asthmatiques jeunes et âgés. Chez le sujet âgé, nous avons démontré un phénotype asthmatique différent comparé au sujet jeune. Ce phénotype est caractérisé par une obstruction bronchique sévère et une importante neutrophilic Notre étude nous indique que l'approche et le traitement devraient être différents dans les personnes âgées comparées à l'asthmatique plus jeune.

Plusieurs études ont démontré des altérations de la muqueuse intestinale en contexte d’altérations métaboliques reliées à l’obésité chez des modèles animaux, et, plus récemment, des sujets humains. Toutefois, l’acquisition d’échantillons, effectuée par biopsies, est limitée par son caractère invasif. L’emploi de biomarqueurs sanguins de la fonctionnalité et de l’intégrité de l’intestin grêle permettrait d’augmenter le nombre de participants humains, mais également d’inclure des participants en santé ne présentant pas de pathologies intestinales. L’objectif de cette étude est d’évaluer le potentiel de la citrulline et de la protéine de liaison aux acides gras spécifique à l’intestin (I-FABP) à percevoir les changements fonctionnels et morphologiques de la muqueuse intestinale de participants présentant un large éventail d’adiposité et de sensibilité à l’insuline. Nous avons démontré que les taux plasmatiques de citrulline, marqueur de la masse et de la fonctionnalité entérocytaire, étaient diminués en présence d’obésité, de résistance à l’insuline (RI) et de diabète de type 2. L’I-FABP, marqueur de l’apoptose entérocytaire est, quant à elle, augmentée chez les diabétiques de type 2 (DT2), principalement ceux dont le diabète n’était pas contrôlé. Le ratio I-FABP/citrulline, marqueur du renouvellement cellulaire, était plus élevé à la fois chez les hommes RI et DT2. Nos résultats démontrent la présence de changements au niveau de la masse et de la fonctionnalité de la muqueuse intestinale en contexte d’altérations métaboliques associées à l’obésité, en particulier celles affectant l’homéostasie du glucose. L’utilisation de biopsies ou encore des méthodes d’imagerie par des études ultérieures serait bénéfique à la validation des changements morphologiques observés. Une meilleure connaissance de l’intestin grêle est essentielle afin de mieux comprendre son impact sur les maladies métaboliques ainsi que ses interactions avec le microbiote. / Several studies have shown small intestinal adaptations in obesity-related metabolic alterations in both animal and human models. However, access to sample is impeded by the invasive procedure it requires. Using plasma biomarkers to assess small intestinal integrity and functionality could improve the sample size of studies, and also to include healthy subjects without enteropathies. Our goal is to evaluate citrulline and intestinalspecific fatty-acid binding protein (I-FABP) ability to assess functional and morphological changes in the small mucosa of men with a wide range of adiposity and insulin sensitivity. In our study, citrulline, a marker of enterocyte mass and function, was lower in subjects with obesity, insulin resistance and type 2 diabetes. I-FABP, an apoptosis marker, was higher in type 2 diabetic (T2D) men, especially those with uncontrolled T2D. I-FABP/citrulline ratio, a marker of enterocyte turnover, was higher in both T2D and insulin resistant (IR) men. In conclusion, alterations in small intestinal mucosa mass and integrity were observed in obesity-related metabolic alterations, especially those related to glucose homeostasis. To assess morphological changes, biopsies or imagery should be included in future studies. A better understanding of the small intestine is crucial to understand its impacts on metabolic alteration and its interactions with the microbiota

La cicatrisation complète de la muqueuse, définie comme l'absence de lésions visibles par endoscopie, est considérée comme un objectif thérapeutique dans la prévention des complications associées aux Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI).Dans ce contexte, le rôle de l’apport protéique alimentaire et les besoins protéiques nécessaires à la cicatrisation ont été peu étudiés. L’objectif de cette thèse était d’évaluer l’effet du niveau d’apport protéique alimentaire sur la réparation épithéliale après un épisode inflammatoire intestinal dans un modèle murin de colite chimio-induite. Dans un premier temps, l’analyse de la progression de certains modulateurs impliqués dans le processus cicatriciel a mis en évidence que la réparation colique s’initiait et se consolidait avant que l’inflammation ne soit résolue et cela, dans un contexte où la composition du microbiote adhérent à la muqueuse était altérée de manière persistante. Les effets de trois régimes alimentaires ayant un niveau d'apport protéique différent (moyen, modérément élevé et élevé) ont ensuite été évalués sur la réparation de la muqueuse colique, ce qui a permis de montrer qu’au-delà d’un certain seuil, le niveau d’apport protéique aggravait et perpétuait l’inflammation colique. En revanche, un apport modérément élevé en protéines était bénéfique par rapport à un apport moyen, de par ses effets sur la perméabilité colique, l'hyper-prolifération cryptique, l’expression de plusieurs gènes codant pour des facteurs de réparation et sur la modulation de la composition du microbiote adhérent. Enfin, ces travaux ont montré que l’inflammation et le niveau d’apport en protéines affectaient le métabolisme protéique dans des organes non-cibles de l’inflammation colique en association avec une endotoxémie persistante.Ce travail a ainsi permis de mieux comprendre les événements locaux et périphériques impliqués dans la cicatrisation de la muqueuse colique et leur modulation par un apport majoré en protéines suite à un épisode inflammatoire aigu. / Advanced mucosal healing, defined by endoscopy as the absence of visible lesions, is considered as a therapeutic goal in the prevention of complications associated with IBD.In this context, the role of dietary protein intake and the protein requirements for mucosal healing have been poorly studied. The aim of this thesis was to evaluate the effect of dietary protein intake level on epithelial repair after an acute intestinal inflammatory episode in a murine model of colitis. Firstly, the progression analysis of several modulators involved in the repairing process showed that colonic repair can be initiated and consolidated in the context of inflamed mucosa, associated with persistent alterations of the colonic luminal environment. The effect of three diets with different levels of protein intake (average, moderately high and high) on colon mucosa repair were evaluated in the same model. This study showed that, beyond a threshold, the level of protein intake aggravated and perpetuated colitis. However, a moderately high protein intake was beneficial due to its effect on colonic permeability, cryptic hyper-proliferation, expression of multiple genes encoding repair factors, and composition modulation of the mucosal-adherent microbiota. Finally, both inflammation and dietary protein intake levels altered protein metabolism of other organs at the periphery of the inflammation in association with persistent endotoxemia.This work deepened the understanding of the events involved in the epithelial repair process and their modulation by an increase in the dietary protein intake after an acute episode of colitis.

L'impact de la nutrition sur l'immunité intestinale de la truite arc-en-ciel est encore mal connu. C'est pourquoi cette thèse avait pour objectifs de mieux caractériser son système immunitaire intestinal et d'évaluer les possibilités de modulation de la réponse immune intestinale par l'ajout de nucléotides libres dans son alimentation. Nos résultats indiquent que les phagocytes intestinaux présentent une activité de phagocytose plus faible que ceux du rein antérieur. La cytotoxicité naturelle mesurée au niveau intestinal est deux fois plus élevée que celle du rein antérieur et cette observation est corrélée à une augmentation du transcrit codant NKEF (Natural Killer Enhancement Factor). Nous avons également montré que les lymphocytes intestinaux ne répondent pas à une stimulation mitogénique in vitro et que ceci n'est pas due à l'apoptose des cellules. Une forte expression des transcrits codant CD8a et CD3 a été détectée dans les leucocytes intestinaux, ce qui suggère une importante proportion de lymphocytes T exprimant la forme homodimérique aa de CD8 dans ce tissu. Enfin, nous avons montré que l'ajout de nucléotides libres à l'alimentation de truites saines stimule la prolifération spontanée ainsi que la phagocytose des leucocytes intestinaux in vitro. Par contre, aucune modulation de la cytotoxicité naturelle ou de l'expression des transcrits codant les marqueurs spécifiques des lymphocytes T et B et les cytokines inflammatoires n'a été observée. Il serait à présent intéressant de renouveler ces essais en utilisant des poissons infectés afin de pouvoir observer l'effet des nucléotides sur la réponse inflammatoire et sur la réponse spécifique / The impact of nutrition on rainbow trout intestinal immunity, a farmed fish with high economic value, remains unclear. Consequently, the objectives of this thesis were to better characterize the intestinal immune system of that fish and to determine if it is possible to modulate its intestinal immune response by dietary free nucleotides. Our results show that intestinal phagocytes are less activated by yeast cells but when they are activated they can ingest as many yeast cells as their head kidney (HK) counterparts. We noted that the natural cytotoxic activity of intestinal leukocytes is twice higher than the one of HK leukocytes. This natural cytotoxic activity is correlated with an increase of transcripts encoding the natural killer enhancement factor (NKEF). Intestinal leukocytes did not respond to an in vitro mitogenic stimulation. This lack of response is not due to apoptosis. We also observed a high expression of CD8a and CD3 transcripts in gut leukocytes, suggesting that the intestine could contain a high proportion of T cells expressing the aa homodimeric form of CD8. Finally, we observed that dietary free nucleotides stimulate the spontaneous proliferation and the phagocytic activity of intestinal leucocytes in vitro. However, they did not modulate natural cytotoxicity activity nor did they affect the amounts of transcripts encoding specific markers of T and B lymphocytes and inflammatory cytokines. In the future, it will be interesting to repeat these experiments using infected fish in order to study the effect of nucleotides on the inflammatory and specific immune responses

Mon projet de thèse a consisté en l'identification et la caractérisation moléculaire et immunologique de patients présentant une susceptibilité accrue aux infections fongiques par Candida sp. dans le syndrome Mendélien de candidose cutanéo-muqueuse chronique (CCMC).La CCMC est caractérisée par des infections persistantes ou récurrentes de la peau, des ongles et des muqueuses par les champignons Candida, principalement C. albicans. Elle est fréquemment associée à d'autres infections opportunistes dans certaines immunodéficiences primaires ou acquises, ou bien elle peut être associée à un tableau auto-immun. La CCMC peut finalement être isolée (CCMCi) sans autre tableau clinique sévère: la plupart des cas rapportés sont sporadiques, mais il existe également des cas familiaux avec une hérédité mendélienne autosomique principalement dominante (AD) ou plus rarement récessive (AR).Basés sur les données de la littérature, qui démontrent un rôle majeur de l'immunité dépendante des IL-17s dans la résistance aux infections mucocutanées vis-à-vis de C. albicans et nos résultats récents, qui démontrent un défaut de cette immunité dans certaines immunodéficiences primaires associées à une CCMC [les syndromes AD-HIES et AR APS-1, ainsi que chez les patients déficients en CARD9, nous avons émis l'hypothèse que parmi les patients atteints de CCMCi, certains pourraient présenter un défaut génétique affectant spécifiquement l'immunité IL-17-dépendante. Au début de ma thèse, j'ai participé à l'identification des deux premières étiologies génétiques de la CCMCi : le défaut autosomique récessif (AR) complet en IL-17RA et autosomique dominant (AD) en IL-17F. Plus récemment, j'ai identifié la troisième et la plus fréquente étiologie génétique de la CCMC par l'identification de mutations gain de fonction dans le gène STAT1 suite à une approche explorant l'ensemble du génome (séquençage de l'ensemble des exons). Ces mutations engendrent une " hyper-réponse " aux interférons de type I et II et à l'IL-27 qui inhibent la différentiation des lymphocytes T sécréteurs d'IL-17, impliqués dans l'immunité mucocutanée vis-à-vis de C. albicans chez l'homme.En conclusion, nous avons identifié, en 2011, des trois premières étiologies génétiques de la CCMCi, avec les défauts AR en IL-17RA, AD en IL-17F et des mutations gain-de-fonction de STAT1, toutes associées à un défaut de l'immunité dépendante de l'IL-17. Des mutations gain-de-fonction de STAT1 représentent à ce jour la cause génétique la plus fréquente de la CCMCi avec au total 94 patients rapportés dans la littérature depuis 2011. Nous avons ainsi démontré que la CCMCi est une immunodéficience primaire, associée à un défaut de l'immunité réalisée par les IL-17s. Ces travaux ont des implications majeures dans le domaine immunologique avec la description et la caractérisation des mécanismes biologiques impliqués dans l'immunité protectrice spécifique de C. albicans et une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques associés à une susceptibilité accrue aux infections fongiques, dans des conditions naturelles d'infection ; et dans le domaine médical, avec la possibilité de diagnostics moléculaires, un conseil génétique en cas de diagnostic positif, une meilleure prise en charge des patients.

La colonisation nasale à Staphylococcus aureus est un important facteur de risque d’infection par cette bactérie chez l’homme. Le rôle de la colonisation extra-nasale dans la physiopathologie des infections liées à la souche de colonisation est incertain. Contrairement aux porteurs intermittents et aux non porteurs, les porteurs persistants ont un risque accru d’infection à S. aureus notamment chez les patients dialysés. Nous avons développé et proposé une nouvelle stratégie applicable aux soins courants pour prédire rapidement le statut de portage nasal persistant de S. aureus dans l’optique de faire bénéficier les porteurs les plus à risque d’infection à S. aureus de mesures de prévention ciblées. Nous avons montré, à travers l’étude des réservoirs pharyngé et digestif, qu’il existe une grande diversité génétique des souches de S. aureus isolées des muqueuses. Enfin, différentes hypothèses ont été investiguées pour déterminer les facteurs microbiologiques associés à la persistance du portage nasal de S. aureus. Ces résultats préliminaires suggèrent que les souches isolées de colonisation nasale persistante et intermittente ont des caractéristiques très similaires / Staphylococcus aureus nasal carriage is a major risk factor of infection with this bacterium in humans. The role of S. aureus extra-nasal carriage in endogenous infections remain elusive. By contrast to intermittent carriers and noncarriers, persistent carriers have a higher risk of S. aureus infection, especially in dialysis patients. We have developed and validated an algorithm to predict the nasal carriage state in clinical practice for proposing decolonization to carriers having the highest risk of S. aureus infection. We found a high diversity between S. aureus strains colonizing the nose, the throat and the rectum, suggesting that extra-nasal carriage could be an additional risk factor of S. aureus infection. Finally, we studied several bacterial determinants of persistent nasal carriage. Our preliminary results suggest that S. aureus isolated in persistent and intermittent carriers harboured similar features

Résumé : Les régimes hyperprotéiques sont couramment consommés mais les conséquences au niveau du gros intestin sont peu connues. L’objectif de la thèse était d’étudier les effets des régimes hyperprotéiques et des métabolites bactériens dérivés des acides aminés sur la muqueuse du gros intestinUne série d’expérimentations animales et in vitro a permis de montrer que deux métabolites bactériens dérivés des acides aminés (le sulfure d’hydrogène et le p-cresol) sont toxiques pour l’épithélium lorsqu’ils sont présents en concentration élevée. Les résultats obtenus lors d’une étude clinique montrent que la quantité et la qualité des protéines alimentaires n’ont pas d’effets marqués sur la composition du microbiote fécal mais modifient les concentrations fécales et urinaires en métabolites bactériens.Ces modifications de l’environnement luminal du gros intestin n’étaient pas associées à une augmentation de la cytotoxicité des eaux fécales in vitro. Néanmoins, dans la muqueuse rectale, l’augmentation de l’apport en protéines a régulé l’expression de gènes impliqués dans le maintien de l’homéostasie et ces effets étaient distincts en fonction de la source de protéines utilisée. Toutefois, le niveau d’apport en protéines n’avait pas d’effet sur les paramètres inflammatoires et histologiques dans la muqueuse. Ces résultats ont été complétés par une étude chez le rat montrant qu’un régime hyperprotéique modifie le transcriptome dans les colonocytes mais n’a pas d’effets délétères en termes d’intégrité de l’ADN, de renouvellement de l’épithélium et de fonction barrière. / Abstract: High-protein diets are frequently consumed but the consequences for the large intestine are not well described. The objective of this thesis was to evaluate the effects of high-protein diets and of amino-acid derived bacterial metabolites on the large intestine mucosa. Animal and in vitro studies showed that two amino acid derived bacterial metabolites (hydrogen sulfide and p-cresol) are toxic for the epithelium when present at high concentration. The results obtained in a clinical trial indicate that quantity and quality of dietary protein do not have major effects on the fecal microbiota composition but modify the fecal and urinary concentration of bacterial metabolites.These changes in luminal environment were not associated with an increase in fecal water cytotoxicity in vitro. Nevertheless, in the rectal mucosa, the increase in protein intake regulated the expression of genes implicated in homeostatic processes and these effects were modulated by the source of protein. However, the level of protein intake had no effect on immune and histological parameters in the mucosa. These results were completed with a study in rats showing a clear transcriptome profile in colonocytes induced by a high-protein diet but that was not associated with detrimental effects in terms of DNA integrity, epithelial renewal and barrier function.