Mon travail de thèse a été axé sur l'étude du rôle des lipides musculaires dans la régulation du métabolisme énergétique et la sensibilité à l'insuline. Les lipides sont présents sous deux formes au sein du muscle squelettique : soit sous forme d'adipocytes insérés entre les fibres/faisceaux musculaires, soit sous forme de gouttelettes lipidiques à l'intérieur des fibres musculaires (i.e. triglycérides intramyocellulaires ou IMTG). Ces deux dépôts de lipides, lorsqu'ils sont présents en excès, sont associés à la mise en place de l'insulino-résistance musculaire chez l'homme, via l'accumulation intracellulaire d'espèces lipidiques lipotoxiques altérant la signalisation insulinique pour les IMTG, et par un mécanisme inconnu pour les adipocytes. Dans un premier temps, nous avons isolé et mieux caractérisé, à partir de biopsies musculaires humaines, deux populations de cellules progénitrices. La première population présente un potentiel de différenciation myogénique en culture, il s'agit des cellules satellites (cellules progénitrices musculaires). La deuxième population est composée de cellules capables d'acquérir les propriétés phénotypiques et métaboliques d'adipocytes blancs matures, il s'agit des progéniteurs fibro/adipocytaires (FAPs). Grace à ces modèles d'étude, nous avons mis en évidence que les sécrétions des adipocytes dérivés des FAPs sont capables d'altérer la voie de signalisation et les effets de l'insuline sur des fibres musculaires humaines in vitro. Cet effet paracrine pourrait en partie expliquer la corrélation négative observée entre le contenu en adipocytes intramusculaires et la sensibilité à l'insuline chez l'homme. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de deux protéines, G0/G1 Switch Gene 2 (G0S2) et la périlipine 5 (PLIN5), dans la dynamique des gouttelettes lipidiques ainsi que leur impact sur le métabolisme des lipides et la sensibilité à l'insuline. Nous avons montré in vitro que ces deux protéines jouent un rôle clé dans le contrôle de la lipolyse musculaire (i.e. hydrolyse des IMTG) via l'adipose triglyceride lipase (ATGL, enzyme limitante de la lipolyse musculaire), et que G0S2 et PLIN5 inhibent l'activité de l'ATGL par des mécanismes directs et indirects, respectivement. Par ailleurs, nos données ont montré que l'invalidation de G0S2 et PLIN5 dans le muscle squelettique active la lipolyse, augmente la lipotoxicité et diminue la sensibilité à l'insuline in vivo chez la souris. Nous avons également démontré un rôle important de PLIN5 dans la régulation de l'oxydation des acides gras en ajustant finement leur disponibilité aux besoins énergétiques des cellules. En résumé, ces travaux démontrent d'une part qu'une communication entre adipocytes et fibres au sein du muscle peut entraîner une altération de la sensibilité à l'insuline musculaire chez l'homme, et d'autre part que G0S2 et PLIN5, deux protéines de la gouttelette lipidique, sont au centre du contrôle de l'homéostasie lipidique et du maintien de l'insulino-sensibilité musculaire. Ces données permettent ainsi d'élargir les connaissances existantes sur le lien entre les lipides musculaires et la sensibilité à l'insuline chez l'homme. / My PhD research work was focused on the role of muscle lipids in the regulation of energy metabolism and insulin sensitivity. Lipids can be found under two different forms in skeletal muscle: adipocytes located between muscle fibers/bundles and lipid droplets inside muscle fibers (i.e. intramyocellular triacylglycerols or IMTG). These depots, when present in excess, have both been associated with insulin-resistance in humans, mainly because of intracellular lipotoxic lipid accumulation known to impair insulin signaling for IMTG, and through a yet unknown mechanism for adipocytes. First, we isolated and characterized two distinct populations of progenitor cells from human muscle biopsies. The first population is composed of satellite cells (muscle progenitor cells) and display a myogenic differentiation potential in vitro. The second population is composed of cells that acquire the phenotypic and metabolic properties of functional white adipocytes, called fibro/adipogenic progenitors (FAPs). By using these cell models, we showed that FAPs-derived adipocytes secretions are able to impair insulin signaling and action in human skeletal muscle fibers in vitro. This paracrine effect could explain, at least partly, the inverse relationship observed between intramuscular adipocyte content and insulin sensitivity in humans. Secondly, we studied the role of two proteins, G0/G1 Switch Gene 2 (G0S2) and perilipin 5 (PLIN5), in lipid droplets dynamics as well as their impact on lipid metabolism and insulin sensitivity. We showed in vitro that these two proteins play a key role in the control of muscle lipolysis (i.e. IMTG hydrolysis) via the adipose triglyceride lipase (ATGL, catalyzing the limiting step of muscle lipolysis), and that G0S2 and PLIN5 inhibit ATGL activity through direct and indirect mechanisms, respectively. Furthermore, our data showed that G0S2 and PLIN5 invalidation in vivo in mouse skeletal muscle activates lipolysis, increases lipotoxicity and impairs insulin sensitivity. We have also highlighted an important role for PLIN5 in the regulation of fatty acids oxidation, by finely adjusting their availability to energy demand. Overall, these results clearly show on one hand that a crosstalk between adipocytes and fibers within skeletal muscle can lead to an alteration of insulin sensitivity in humans, and on the other hand that G0S2 and PLIN5, two lipid droplet proteins, play a central role in the control of muscle lipid homeostasis and insulin sensitivity. These data help to develop our current understanding of the link between muscle lipids and insulin sensitivity in humans.

La cascade d’évènements permettant la contraction de la fibre musculaire striée squelettique en réponse à l’activité électrique de sa membrane plasmique est regroupée sous le terme de couplage excitation-contraction (EC). Le couplage EC a lieu au niveau des triades, domaines nanoscopiques au niveau desquels les invaginations transversales de la membrane plasmique (tubules-T) sont en contact étroit avec deux citernes terminales adjacentes de réticulum sarcoplasmique (RS). Plus précisément, lors de l’excitation d’une fibre musculaire, un potentiel d’action se propage dans toute la surface de la membrane plasmique et en profondeur de la cellule via les tubules-T. Cette dépolarisation y est détectée par les protéines membranaires sensibles au potentiel Cav1.1 qui en retour, par couplage mécanique, déclenchent l’ouverture des canaux calciques du RS que sont les récepteurs de la ryanodine de type 1 (RYR1s). Ceci est à l’origine de l’augmentation massive de Ca2+ intracellulaire qui déclenche l’activation des myofilaments et donc la contraction. La compréhension des mécanismes de contrôle et de régulation des canaux RYR1s reste encore aujourd’hui limitée. En particulier, la mesure de l’activité physiologique de ces canaux dans la fibre musculaire intacte est toujours réalisée de manière très indirecte. Par ailleurs le rôle éventuel de variations de potentiel de la membrane du RS pendant l’activité musculaire n’a jamais été révélé. Une connaissance approfondie de ces phénomènes est pourtant essentielle à la compréhension de la fonction musculaire squelettique normale et pathologique. Dans ce contexte, l’objectif général de mon projet de thèse a été de mettre au point et utiliser des biosenseurs fluorescents localisés spécifiquement à la membrane des citernes terminales du RS de fibres musculaires différenciées – par leur fusion à une séquence d’adressage appropriée. Grâce à la combinaison des techniques d’électrophysiologie et d’imagerie de la fluorescence des biosenseurs sur fibres musculaires isolées, nous avons pu étudier l’activité du RS au cours de la fonction musculaire. Plus particulièrement, mon travail de thèse aborde deux problèmes biologiques principaux : le potentiel de membrane du RS et la signalisation calcique du RS au cours du couplage EC. Le premier objectif a visé à caractériser les changements de potentiel de la membrane du RS pendant l’activation du couplage EC. Pour cela, nous avons utilisé des biosenseurs de FRET de la famille Mermaid. Nos résultats montrent qu’il n’y a pas de changement substantiel du potentiel transmembranaire du RS pendant l’activation du couplage EC. Ces données confirment – pour la première fois en condition physiologique – que le flux de Ca2+ à travers les canaux RYR1s est équilibré par des contre-flux ioniques compensatoires qui permettent le maintien du potentiel de membrane du RS. Ceci assure la pérennité du flux de Ca2+ et contribue à l’efficacité du couplage EC. Le deuxième objectif a visé à détecter les variations de concentration en Ca2+ à proximité immédiate des canaux RYR1s. Pour cela, nous avons utilisé le biosenseur fluorescent sensible au Ca2+ GCamP6f. Le biosenseur adressé à la membrane du RS fournit un accès unique à l’activité individuelle de populations distinctes de canaux RYR1s au sein de différentes triades d’une même fibre musculaire. Au-delà de la caractérisation détaillée des propriétés des sondes GCaMP6f dans cette préparation, nos résultats montrent la stupéfiante synchronisation de l’activité de libération de Ca2+ des triades d’une même fibre musculaire au cours du couplage EC. Les résultats ouvrent des perspectives particulièrement intéressantes pour les études de situations pathologiques d’altération de l’activité des canaux RYR1s / Excitation-contraction (EC) coupling in skeletal muscle corresponds to the sequence of events through which muscle fiber contraction is triggered in response to plasma membrane electrical activity. EC coupling takes place at the triads; these are nanoscopic domains in which the transverse invaginations (t-tubules) of the surface membrane are in closed apposition with two adjacent terminal cisternae of the sarcoplasmic reticulum membrane (SR). More precisely, EC coupling starts with action potentials fired at the endplate, propagating throughout the surface membrane and in depth into the muscle fiber through the t-tubules network. When reaching the triadic region, action potentials activate the voltage-sensing protein Cav1.1. In turns, Cav1.1 directly open up the type 1 ryanodine receptor (RYR1) in the immediately adjacent SR membrane, through intermolecular conformational coupling. This triggers RYR1-mediated SR Ca2+ release which produces an increase in cytosolic Ca2+ triggering contraction. Current understanding of the mechanisms involved in the control and regulation of RYR1 channels function is still limited. One reason is related to the fact that detection of RYR1 channel activity in intact muscle fibers is only achieved with indirect methods. Also, whether SR the membrane voltage experiences changes during muscle activity has so far never been experimentally assessed. Yet, deeper knowledge of these processes is essential for our understanding of muscle function in normal and disease conditions. In this context, the general aim of my PhD project was to design and use fluorescent protein biosensors specifically localized at the SR membrane of differentiated muscle fibers, by fusing them to an appropriate targeting sequence. Thanks to a combination of single cell physiology and biophysics techniques based on electrophysiology and biosensor fluorescence detection, we were able to study the SR activity during muscle fiber function. Specifically, my PhD work focused on two major issues: SR membrane voltage and SR calcium signaling during EC coupling. The first aim of my work was to characterize SR membrane voltage changes during muscle fiber activity. For this, we used voltage sensitive FRET-biosensors of the Mermaid family. Results show that the SR trans-membrane voltage experiences no substantial change during EC coupling. This provides the first experimental evidence, in physiological conditions, for the existence of ion counter-fluxes that balance the charge deficit associated with RYR1-mediated SR Ca2+ release. Indeed, this process is essential for maintaining the SR Ca2+ flux upon RYR1 channels opening and thus critically important for EC coupling efficiency. The second objective of my work aimed at detecting the changes in Ca2+ concentration occurring in the immediate vicinity of the RYR1 Ca2+ release channels during muscle fiber activation. For this, we took advantage of one member of the recent generation of genetically encoded Ca2+ biosensor: GCaMP6f. The SR-targeted biosensor provides a unique access to the individual activity of RYR1 channels populations within distinct triads of a same muscle fiber. Beyond allowing a detailed characterization of the biosensor properties in this preparation, results highlight the remarkable uniformity of SR Ca2+ release activation from one triad to another, during EC coupling. These results open up stimulating perspectives for the investigation of disease conditions associated with defective behavior of RYR1 channels.

La triadine est une famille de protéines du muscle squelettique. Quatre isoformes de la triadine ont été clonées: Trisk 95, Trisk 51, Trisk 49 et Trisk 32. Ce sont des protéines transmembranaires du reticulum sarcoplasmique (RS). Trisk 95 et Trisk 51 sont localisées dans la triade où elles sont associées au récepteur de la ryanodine (RyR), un canal calcique. Trisk 49 et Trisk 32 sont localisées dans le RS longitudinal. Il a été montré que Trisk 95 régule les relâchements de Ca2+ du RyR. L'objectif de ce travail de thèse a été d'étudier les fonctions des triadines dans le muscle squelettique grâce à différentes approches et techniques complémentaires. Dans un premier temps, Trisk 95 et de Trisk 51 ont été étudiées par surexpression in vivo dans les muscles de souris. La caractérisation de ces muscles a permis de mettre en évidence l'association du RyR avec la cavéoline, une protéine de la membrane plasmique. Dans un second temps, la fonction de Trisk 32 a été étudiée dans le muscle squelettique. L'étude précise de sa localisation a permis de montrer qu'elle est localisée dans la triade, dans le RS longitudinal, et à proximité des mitochondries. Des expériences de co-immunoprécipitation ont révélé qu'elle est associée avec le RyR et avec le récepteur de l'IP3. De par ses partenaires, Trisk 32 semble jouer un rôle dans la régulation de nombreux mécanismes impliquant le Ca2+. Enfin, le gène de la triadine a été invalidé chez la souris. Cette souris KO triadine présente une faiblesse musculaire et des défauts dans l'ultrastructure de la triade. Ces résultats indiquent qu'en plus de sa fonction de régulation des relâchements de Ca2+ la triadine pourrait avoir un rôle structural.

Au cours de la croissance et de la maturation, le muscle squelettique subit de nombreux changements. Principalement on constate une augmentation considérable de la masse musculaire concomitante à l’augmentation de la capacité de force et plusieurs résultats suggèrent que la maturation affecte la fonction musculaire à la fois au niveau de la commande motrice et du métabolisme énergétique. Pour des raisons éthiques évidentes, la fonction musculaire n’a été que peu étudiée chez l’enfant. Malgré leur caractère strictement non-invasif les techniques de résonance magnétique n’ont été que peu utilisées pour caractériser cette fonction chez l’enfant et les résultats controversés ne permettent pas de dégager un consensus. Dans ce travail la fonction musculaire de l’enfant sain a été étudiée in vivo par Imagerie et Spectroscopie de Résonance Magnétique. Par IRM, nous nous avons mis en évidence que la capacité de force volontaire maximale d’un muscle reste proportionnelle à sa taille de l’enfance à l’âge adulte. Par ailleurs nos résultats obtenus par SRM du P31 ont clairement montré que la capacité oxydative et la production d’ATP mitochondriale était augmentée avant la puberté, illustrant que les enfants sollicitaient plus leur métabolisme aérobie que les adultes pour répondre à la demande énergétique pour une intensité donnée. De plus, nos résultats ont montré que la filière énergétique de la glycolyse anaérobie était pleinement mature dès l’enfance. Enfin, face à la difficulté pour mettre en place des études longitudinales chez l’homme nous avons développé un protocole expérimental permettant le suivi longitudinal de la fonction musculaire au cours du développement chez le rat. / Growth and maturation are accompanied by important changes in skeletal muscle function (e.g. muscle mass and strength dramatically increase). Moreover, some evidences strongly suggest that maturation significantly affects skeletal muscle function both at the neural drive and energetics levels. For ethical reasons, few studies have been performed in children. Despite their non traumatic aspect the MR techniques, it has been barely used in this context. In this work, the skeletal muscle function of healthy children has been characterized in vivo using MRI and 31P-MRS. Our results refuted the hypothesis of a motor drive immaturity in children. We did not report any change in the relationship between muscle volume measured by MRI and maximum isometric strength or in specific strength from childhood to adulthood. The ability of a given muscle volume to produce force seems not to change during growth. Then, we investigated whether development affects muscle energetics using 31P-MRS comparing prepubescent boys and men. Our results showed that, for a similar total energy cost, the aerobic contribution to ATP production was significantly higher in boys and compensated for by a reduced PCr breakdown while glycolysis was similar whatever the age. In addition, the recovery rate of PCr after the standardized exercise was faster in boys illustrating a higher maximal oxidative capacity before puberty. Finally, our understanding of skeletal muscle function in children is still limited by the difficulty to perform longitudinal studies. In that respect, we have initiated an original protocol allowing the longitudinal investigation of the gastrocnemius muscle throughout development in rat.

Escherichia coli O157:H7 est le sérotype le plus souvent incriminé lors de toxi-infection alimentaire par les E. coli entérohémorragiques (EHEC). Il peut être associé, dans les cas les plus graves, à des colites hémorragiques mortelles et au syndrome hémolytique et urémique (SHU), touchant essentiellement les jeunes enfants. Le vecteur alimentaire le plus courant lors de ces contaminations est le boeuf haché. L’étape primaire de la contamination bactérienne se situe lors de l'abattage où les bactéries peuvent être transférées de la peau à la carcasse. Une gaine conjonctive entoure les muscles, sa composition protéique, similaire à la matrice extracellulaire (ECM), pourrait jouer un rôle dans l'adhésion bactérienne. Dans un premier temps, l’étude de l'adhésion et de la colonisation des bactéries aux protéines majeures de l’ECM musculaire, a révélé une forte influence des conditions de croissances sur l’adhésion, l'adhésion étant maximale à 25°C et pH7, en particulier aux collagènes I et III. Chez les EHEC, diverses protéines de surfaces peuvent être potentiellement impliquées dans l’adhésion à l’ECM. Le rôle d'un autotransporteur, l'antigène 43 (Ag43), dans l'autoagrégation, l'adhésion et la formation de biofilm, a été établit chez E. coli O157:H7 EDL933. Par la suite, les interactions entre E. coli O157:H7 et la viande ont été étudiées sur deux muscles modèles de types métabolique et contractile opposés (Soleus oxidatif lent et EDL, glycolytique rapide), caractérisés par microspectroscopie de fluorescence UV couplée au rayonnement synchrotron. Les différents types de fibres musculaires ainsi que l’effet d’une anoxie prolongée simulant la maturation des viandes ont été discriminés par leurs réponses spectrales après une excitation à 275 nm. Un tropisme bactérien plus élevé pour le muscle soleus que pour le muscle EDL a été clairement observé. Bien qu'E. coli O157:H7 adhère de manière similaire aux différents types de fibres musculaires, l'adhésion des bactéries se fait essentiellement au niveau de l'ECM, mettant en évidence le rôle clé de l'ECM et du tissu conjonctif musculaire dans l’adhésion des E. coli O157:H7 à la viande. Ces travaux de recherche sur l’adhésion bactérienne aux muscles squelettiques aux niveaux moléculaires, cellulaires et tissulaires fournissent les premières connaissances sur la physiologie des EHEC lors de la contamination de la viande et constituent un pré-requis indispensable au développement de pratiques et de stratégies innovantes afin de réduire le risque de contamination des viandes. / Escherichia coli O157:H7 is the most prevalent serotype involved in foodborne infection by enterohemorrhagic E. coli (EHEC). It is associated with life-threatening hemorrhagic colitis and the hemolyticuremic syndrome (HUS), which essentially affect young children. The major food vector of EHEC contamination is ground beef. The primary bacterial contamination occurs during the slaughter, essentially at dehiding stage where bacteria can be transferred from hides to carcasses. The connective tissue surrounding the muscle, highly similar to extracellular matrix (ECM) could potentially be a support for bacterial adhesion. When investigating the adhesion and colonization to the main muscle fibrous ECM proteins, the great influence of growth conditions on subsequent bacterial attachment was shown. Maximal adhesion to ECM proteins occurred at 25°C and pH 7, especially to collagens I and III. In EHEC, various surface-exposed protein determinants can be expressed and potentially involved in ECM adhesion. Investigating the autoaggregation, bacterial adhesion and biofilm formation, the involvement of Antigen 43 (Ag43), an autotransporter protein, was demonstrated in E. coli O157:H7 EDL933. Then, the attachment of E. coli O157:H7 to the meat was determined on two different model muscles, with different contractile and metabolic characteristic (Soleus oxidative, slow and EDL glycolytic, fast), previously characterized by UV microspectroscopy coupled to synchrotron radiation fluorescence. The different of muscle fiber types and the effect of a prolonged anoxia simulating maturing meat were discriminated by their spectral responses after excitation at 275 nm. It clearly appeared that bacteria displayed differential tropism as function of the muscle types, higher for the Soleus than the EDL muscles. While E. coli O157:H7 adhered similarly to the different types of muscle fibers, bacterial adherence essentially occurred at the ECM, pinpointing the key role of connective tissue for E. coli O157:H7 adhesion to meat. This first comprehensive investigation of bacterial adhesion to skeletal muscles at molecular, cellular and tissue levels provides new insight in the physiology of the colonization of meat by EHEC and constitutes a prerequisite for the development of innovative practices and strategies to minimize the risk of meat contamination.

Les muscles permettent de générer force et mouvements et ont des fonctions métaboliques importantes. Mon travail a consisté à caractériser le rôle et les mécanismes d’actions des androgènes dans le muscle strié. Nous avons montré que l’ablation du récepteur des androgènes dans les myofibres n’affecte pas la masse musculaire car à la fois les voies anaboliques (IGF1) et cataboliques (myostatine) sont dérégulées. Cependant, l’absence du récepteur dans les myofibres diminue l’hypertrophie musculaire induite par une surcharge mécanique et limite l’atrophie induite par les glucocorticoïdes. Son ablation augmente également l’autophagie, entrainant une déstructuration des sarcomères, conduisant à une diminution de la force musculaire. De plus, sa délétion diminue la vitesse d’absorption du glucose lors d’une surcharge glucidique. Le récepteur des androgènes dans les myofibres régule donc la masse et la force musculaire, ainsi que l’import du glucose. / Muscles generate strength and movement, and have important metabolic functions. The aim of my work was to characterize the role and mechanisms of action of androgen receptor in skeletal muscle. We show that ablation of the androgen receptor in skeletal muscle myofibers does not affect muscle mass as both anabolic (IGF1) and catabolic pathways (myostatin) are deregulated. However, the absence of this receptor in myofibers decreases muscle hypertrophy induced by mechanical overload and limits glucocorticoids-induced muscle atrophy. Its ablation also increases autophagy, leading to sacromeres destructuration, resulting in decreased muscle strength. Moreover, its deletion reduced the rate of glucose absorption during a glucidic overload. Thus, myofibres androgen receptor regulates muscle mass and strength, as well as glucose import.

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d’acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L’un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d’initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l’hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l’administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l’activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l’expression de l’E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère que l’activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d’autres voies de signalisation sont impliquées dans l’hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l’AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l’activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l’utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d’envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L’administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n’engendrait pas d’hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l’augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu’un traitement de 7 jours au 007-AM n’est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l’absence d’hypertrophie musculaire pourrait provenir de l’instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats / Β2-agonists are traditionally used to prevent and reduce asthma symptoms and bronchoconstriction induced by exercise. Nevertheless, when administrated in vivo, at relatively high, far away from therapeutic doses, β2-agonists induce anabolic effects. Numerous actors are involved in biological response of the skeletal muscle, induced by β2-agonists. PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which initiates translation, is one of these actors. In this context, our first study aimed at determined the kinetic of molecular events responsible for skeletal muscle hypertrophy after 1 day (D1), 3 days (D3) and 10 days (D10) of formoterol administration. We have shown that formoterol administration induced skeletal muscle hypertrophy at D3 and D10 associated with a transient activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (D1 and D3), and, with a decrease in E3 ubiquitin ligase MAFbx/atrogin-1 expression (D3). The autophagy-lysosome pathway seems not to be regulated by formoterol administration. Taken together, these results suggest that PI3K/Akt/mTOR activation is temporally associated with the regulation of ubiquitin-proteasome but not the autophagy-lysosome pathway. The transient nature of the regulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway also indicates that other unidentified pathways are probably activated to sustain the increase in skeletal muscle mass. Recently, 007-AM synthetic molecule has been described to stimulate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway through Epac protein activation, suggesting that 007-AM could be an alternative to the use of β2-agonists. The purpose of our second study was to determine whether 007-AM had an anabolic action on skeletal muscle and if 007-AM was stable allowing considering its use in pharmacology. 007-AM administration for 7 days to mice does not lead to muscle hypertrophy. Nonetheless, in vitro on C2C12 cells, 007-AM activated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by increasing phosphorylation of rpS6 and 4E-BP1. Our results showed that contrary to 007, 007-AM was instable in plasma. Altogether, these results suggest that a 7-day 007-AM treatment is not sufficient to induce skeletal muscle hypertrophy. This lack of hypertrophy could be due to 007-AM instability in plasma. However, supplemental studies are needed to confirm these results

Nigella sativa ou cumin noir est une plante et un condiment populaires. Les graines de N. sativa sont très utilisées en médecine traditionnelle des pays nord africains pour le traitement du diabète. Cependant, les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels cette plante exerce son effet euglycémiant restent encore mal compris. Le but de notre étude est d'examiner l’effet de N. sativa sur la sécrétion d’insuline, le transport de glucose et sur les voies de signalisation impliquées dans l’homéostasie et le métabolisme de glucose, en utilisant des essais biologiques sur des cultures cellulaires murines (cellules β pancréatiques βTC, myoblastes C2C12, hépatocytes H4IIE et adipocytes 3T3-L1) et des études in vivo chez le rat normoglycémique et le Meriones shawi (rongeur) diabétique. Chez les cellules β pancréatiques, N. sativa a augmenté leur prolifération ainsi que la sécrétion basale et gluco-stimulée de l’insuline. N. sativa a augmenté aussi la prise de glucose de 50% chez les cellules musculaires alors que chez les cellules graisseuses, la prise de glucose est augmentée jusqu’au 400%. Les expériences d’immunobuvardage de type western ont montré que N. sativa stimule les voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERKs) et aussi celle insulino-indépendante (AMPK) chez les cellules C2C12. Par contre, chez les 3T3-L1, l’augmentation de transport de glucose est plutôt reliée à une activation de la voie de peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ). Chez les hépatocytes, N. sativa augmente la stimulation des protéines intracellulaires Akt et 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Cette activation de l’AMPK est associée à un effet découpleur de la plante au niveau de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Par ailleurs, chez les Meriones shawi diabétiques, N. sativa diminue graduellement la glycémie à jeun ainsi que la réponse glycémique (AUC) à une charge orale en glucose (OGTT) pour atteindre des valeurs semblables aux animaux témoins après quatre semaines de traitement. Une amélioration du profile lipidique est observée autant chez les Meriones shawi diabétiques que chez les rats normaux. Au niveau moléculaire, N. sativa augmente le contenu musculaire en glucose transporter 4 Glut4 et la phosphorylation de l’acetyl-coenzyme A carboxylase ACC dans le muscle soléaire et le foie chez les Mériones shawi diabétiques. Par contre, chez le rat normal, on assiste à une stimulation des voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERK) au niveau hépatique. En conclusion, nous avons confirmé l’action insulinotropique de N. sativa au niveau des cellules β pancréatiques et mis en évidence un effet proliférateur pouvant potentiellement s’avérer utile pour contrecarrer la perte de masse cellulaire observée chez les diabétiques. Notre étude a également mis en évidence pour la première fois que N. sativa exerce son activité antidiabétique par une combinaison d’effets insulino-mimétiques et insulino-sensibilisateurs directs permettant ainsi d’augmenter le transport de glucose des tissus périphériques. Cette action de N. sativa est liée à une stimulation des voies de signalisation intracellulaires insulinodépendantes et -indépendantes (AMPK) chez le muscle squelettique et le foie alors qu’elle passe par la voie des PPARγ au niveau du tissu adipeux. Finalement, l’étude in vivo vient confirmer l’effet antidiabétique de N. sativa. Notre apport novateur se situe au niveau de la démonstration que l’activité antidiabétique de N. sativa chez le Meriones shawi diabétique est la résultante des mêmes activités que celles déterminées au niveau de l’étude in vitro. En effet, N. sativa active la voie de l’AMPK, améliore la sensibilité à l’insuline et augmente l’insulinémie. Notre étude montre aussi que N. sativa possède une activité antilipidémiante. Ces résultats confirment le bien-fondé de l'utilisation ethnopharmacologique de N. sativa comme traitement du diabète et des perturbations du métabolisme lipidique qui y sont associées. De plus, les actions pléiotropiques de N. sativa en font un traitement alternatif ou complémentaire du diabète très prometteur qui encouragent à présent la tenue d’études cliniques de bonne qualité. / Nigella sativa or black cumin is a medicinal plant and a popular condiment. The seeds of N. sativa are widely used in the traditional medicine of North African countries for the treatment of diabetes. However, the cellular and molecular mechanisms of action through which the plant exerts its hypoglycemic effect remain unclear. The aim of our study is to determine the effect of N. sativa on insulin secretion, glucose transport and signaling pathways involved in the regulation of glucose homeostasis and metabolism. We carried out in vitro murine cell-based bioassays (βTC pancreatic β cells, C2C12 myoblasts, H4IIE hepatocytes and 3T3-L1 adipocytes) and in vivo studies in normoglycemic rats and diabetic Meriones shawi (rodent). In pancreatic β cells, N. sativa increased cell proliferation as well as basal and glucose stimulated insulin secretion. It also enhanced glucose uptake in muscle cells by 50%. Moreover, the increase of glucose uptake in fat cells reached levels up to 400%. The experiments using Western immunoblot analysis showed that N. sativa stimulated insulin-dependent (Akt and ERK) as well as -independent (AMPK) pathways in C2C12 cells. In 3T3-L1 cells, the increase of glucose uptake was attributed to the activation of the peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) pathway. Similarly to C2C12 cells, N. sativa activated Akt and 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) in hepatocytes. This activation of AMPK was associated with an uncoupling effect on mitochondrial oxidative phosphorylation. In diabetic Meriones, N. sativa gradually decreased fasting blood glucose and the glycemic response to an oral glucose load (OGTT) to values similar to normal animals at the end of treatment. Improved lipid profile is observed in both animal models. At the molecular level, N. sativa increased muscle glucose transporter 4 (Glut4) content and acetyl-coenzyme A carboxylase (ACC) phosphorylation in soleus muscle and liver in diabetic Meriones shawi. In normal rats, the plant extract induced a stimulation of insulin signaling pathways (Akt and ERK) in the liver. In conclusion, N. sativa has an insulinotropic effect on pancreatic β cells. Our study has revealed for the first time that N. sativa exerts its antidiabetic activity by a combination of insulino-mimetic and insulin-sensitizing effects, thereby increasing glucose uptake in peripheral tissues. This effect of N. sativa is linked to the stimulation of insulin-dependent and -independent (AMPK) pathway in skeletal muscle and liver, while in adipose tissue, the effect was attributed to the activation of PPARγ. Finally, the in vivo study confirms the antidiabetic and antihyperlipidemic effects of N. sativa. Our original contribution lies in the demonstration that the in vivo antidiabetic action of N. sativa is exerted though the same mechanisms identified by our in vitro studies. These data support the soundness of the ethnobotanical use of this plant for the treatment of diabetes and its associated dyslipidemia. Moreover, the pleiotropic actions of N. sativa make it a very promising alternative or complementary treatment for diabetes, which calls for immediate high quality clinical trials.

Actuellement, des méthodes quantitatives de résonance magnétique nucléaire (RMN) offrent des biomarqueurs qui permettent la réalisation d’études longitudinales pour le suivi de l’évolution des maladies neuromusculaires et des essais thérapeutiques de manière non-invasive. A la différence de la dégénérescence graisseuse, les processus d’inflammation/œdème/nécrose et fibrose sont des signes d’activité des maladies et leurs quantifications constitueraient ainsi de biomarqueurs parfaitement adaptés pour le suivi thérapeutique. Ce travail de thèse a consisté à mettre en place des méthodologies quantitatives plus précises et adaptées à l’étude clinique du muscle pour : (i) détecter et quantifier des sites d’activité de maladies par la cartographie T2 de l’eau ; (ii) identifier les différents processus pathophysiologiques qui sont à l’origine des altérations du T2 ; et (iii) détecter et quantifier la fibrose musculaire. Nous avons implémenté deux méthodes pour la quantification du T2 de l’eau dans le muscle. La première est basée sur une séquence d’écho de spin du type CPMG, où les signaux provenant des protons des lipides et de l’eau sont acquis simultanément et séparés à postériori par un traitement tri-exponentiel qui exploite la différence entre les T2 qui caractérisent les signaux de l’eau et de la graisse. La deuxième technique est basée sur une séquence de « partially spoiled steady state free precession (pSSFP) ». Différemment de la première technique qui nécessite un traitement assez élaboré sur des images acquises à 17 temps d’écho différents, dans la pSSFP la cartographie T2 est extraite à partir de deux séries de données 3D. L’acquisition 3D est compatible avec des techniques de sélection spectrale de l’eau, ce qui évite la contamination par les signaux des lipides. Les deux méthodes ont été validées expérimentalement chez des malades et des sujets sains et ont démontré leur capacité à détecter et quantifier des sites d’activité de maladies. Ces deux travaux font l’objet de deux publications dans des journaux scientifiques internationaux : Azzabou, de Sousa, Araujo, & Carlier, 2014. Journal of Magnetic Resonance Imaging. DOI 10.1002/jmri.24613 (in press); et de Sousa, Vignaud, Araujo, & Carlier . 2012. Magnetic Resonance in Medicine. 67:1379-1390. Malgré le fait de permettre la détection des sites d’activité de maladies, la mesure mono-exponentielle du T2 de l’eau par imagerie reste non-spécifique vis-à-vis des processus physiologiques à l’origine de l’augmentation du T2. Il est connu que la relaxation T2 du muscle squelettique n’est pas mono-exponentielle. Cela est interprété comme une conséquence de la compartimentation anatomique de l’eau tissulaire. Nous avons mis au point une méthode pour l’acquisition localisée de données CPMG. Cette technique permet l’acquisition des données dans des conditions nécessaires pour la réalisation de traitements multi-exponentiels précis. Ce travail nous a permis d’établir un modèle de compartimentation qui explique parfaitement la relaxation T2 dans le muscle. Il a fait l’objet d’un article publié dans le « Biophysical Journal » (Araujo, Fromes & Carlier 2014. New Insights on skeletal muscle tissue compartments revealed by T2 NMR relaxometry. (In press)). Les essais réalisés chez des sujets malades suggèrent un grand potentiel pour l’application de la méthode dans des études cliniques. La formation de la fibrose commence avec une accumulation excessive de tissu conjonctif intramusculaire (TCIM). Nous avons exploité la technique « Ultrashort Time-to-Echo » (UTE) pour essayer de détecter et caractériser le signal du TCIM. Dans une première étude, nous avons caractérisé in vivo une composante à T2 court (~500 µs) dans le muscle, et nous avons trouvé des indices qui suggèrent qu’elle représente le TCIM. Dans une deuxième étude, nous avons mis au point une méthodologie qui a permis d’imager cette composante à T2 court dans le muscle pour la première fois. / Current quantitative nuclear magnetic resonance (NMR) technics offer biomarkers that allow performing non-invasive longitudinal studies for the follow up of therapeutic trials in neuromuscular disorders (NMD). In contrast to fat degeneration, the mechanisms of inflammation/oedema/necrosis and fibrosis are characteristic signs of disease activity, which makes their quantification a promising source of crucial biomarkers for longitudinal studies. This thesis work consisted on the implementation of more precise quantitative NMR methods adapted to the clinical study of skeletal muscle (SKM) for : (i) detection and quantification of sites of disease activity by T2-mapping of muscle water ; (ii) investigation of the different pathophysiological mechanisms underlying T2 alterations ; and (iii) Detection and quantification of muscle fibrosis. We implemented two methods for T2 mapping of muscle water. The first one is based on a multi-spin-echo sequence du type CPMG. In this method the 1H-NMR signals from water and lipids are acquired simultaneously. The acquired data are fitted to a tri-exponential model, in which water and fat signals are separated by exploring the T2 difference between water and fat. This method allows extraction of muscle water T2-value in the presence of fat infiltration. The second method is based on a « partially spoiled steady state free precession » (pSSFP) sequence. In contrast to the first method, which demands a sophisticated post-treatment of images acquired at 17 different echo-times, with the pSSFP a T2-mapping is extracted from two 3D data sets. 3D acquisition is compatible with spectrally selective water excitation, which eliminates signal contribution from lipids. Both methods were validated experimentally on patients and healthy subjects. The results demonstrated their capacity to detect and quantify disease activity sites. This 2 works have been published in two international journals : Azzabou, de Sousa, Araujo, & Carlier, 2014. Journal of Magnetic Resonance Imaging. DOI 10.1002/jmri.24613 (in press); et de Sousa, Vignaud, Araujo, & Carlier . 2012. Magnetic Resonance in Medicine. 67:1379-1390. Although it was shown to reveal disease activity, mono-exponential T2 of muscle water is non-specific to what concerns the mechanisms underlying its alterations. It has been long known that T2 relaxation in SKM tissue is multi-exponential. This is currently accepted to reveal anatomical compartmentation of myowater. We implemented a method for localized spectroscopic CPMG acquisition. CPMG data respect echo-time sampling and signal to noise ration limits for allowing robust multiexponential analysis. This work allowed us to establish a compartmentation model that perfectly explains the multi-exponential T2 relaxation observed in SKM tissue. This work was published in the « Biophysical Journal » (Araujo, Fromes & Carlier 2014. New Insights on skeletal muscle tissue compartments revealed by T2 NMR relaxometry. (In press)). Pilot studies performed in patients show promising results and suggest potential application of the method in clinical studies. Fibrosis starts with an excessive accumulation of intramuscular connective tissue (IMCT). We have explored the « Ultrashort time to echo » (UTE) method with the aim to detect and characterize the signal from IMCT. In a first study we characterized in vivo a short T2 component (~500 µs) in SKM, and we collected evidences suggesting that this component might reflect IMCT. Then we implemented a methodology that allowed imaging this short component in SKM tissue for the first time.

Nigella sativa ou cumin noir est une plante et un condiment populaires. Les graines de N. sativa sont très utilisées en médecine traditionnelle des pays nord africains pour le traitement du diabète. Cependant, les mécanismes d'actions cellulaires et moléculaires via lesquels cette plante exerce son effet euglycémiant restent encore mal compris. Le but de notre étude est d'examiner l’effet de N. sativa sur la sécrétion d’insuline, le transport de glucose et sur les voies de signalisation impliquées dans l’homéostasie et le métabolisme de glucose, en utilisant des essais biologiques sur des cultures cellulaires murines (cellules β pancréatiques βTC, myoblastes C2C12, hépatocytes H4IIE et adipocytes 3T3-L1) et des études in vivo chez le rat normoglycémique et le Meriones shawi (rongeur) diabétique. Chez les cellules β pancréatiques, N. sativa a augmenté leur prolifération ainsi que la sécrétion basale et gluco-stimulée de l’insuline. N. sativa a augmenté aussi la prise de glucose de 50% chez les cellules musculaires alors que chez les cellules graisseuses, la prise de glucose est augmentée jusqu’au 400%. Les expériences d’immunobuvardage de type western ont montré que N. sativa stimule les voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERKs) et aussi celle insulino-indépendante (AMPK) chez les cellules C2C12. Par contre, chez les 3T3-L1, l’augmentation de transport de glucose est plutôt reliée à une activation de la voie de peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ). Chez les hépatocytes, N. sativa augmente la stimulation des protéines intracellulaires Akt et 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK). Cette activation de l’AMPK est associée à un effet découpleur de la plante au niveau de la phosphorylation oxydative mitochondriale. Par ailleurs, chez les Meriones shawi diabétiques, N. sativa diminue graduellement la glycémie à jeun ainsi que la réponse glycémique (AUC) à une charge orale en glucose (OGTT) pour atteindre des valeurs semblables aux animaux témoins après quatre semaines de traitement. Une amélioration du profile lipidique est observée autant chez les Meriones shawi diabétiques que chez les rats normaux. Au niveau moléculaire, N. sativa augmente le contenu musculaire en glucose transporter 4 Glut4 et la phosphorylation de l’acetyl-coenzyme A carboxylase ACC dans le muscle soléaire et le foie chez les Mériones shawi diabétiques. Par contre, chez le rat normal, on assiste à une stimulation des voies de signalisation de l’insuline (Akt et ERK) au niveau hépatique. En conclusion, nous avons confirmé l’action insulinotropique de N. sativa au niveau des cellules β pancréatiques et mis en évidence un effet proliférateur pouvant potentiellement s’avérer utile pour contrecarrer la perte de masse cellulaire observée chez les diabétiques. Notre étude a également mis en évidence pour la première fois que N. sativa exerce son activité antidiabétique par une combinaison d’effets insulino-mimétiques et insulino-sensibilisateurs directs permettant ainsi d’augmenter le transport de glucose des tissus périphériques. Cette action de N. sativa est liée à une stimulation des voies de signalisation intracellulaires insulinodépendantes et -indépendantes (AMPK) chez le muscle squelettique et le foie alors qu’elle passe par la voie des PPARγ au niveau du tissu adipeux. Finalement, l’étude in vivo vient confirmer l’effet antidiabétique de N. sativa. Notre apport novateur se situe au niveau de la démonstration que l’activité antidiabétique de N. sativa chez le Meriones shawi diabétique est la résultante des mêmes activités que celles déterminées au niveau de l’étude in vitro. En effet, N. sativa active la voie de l’AMPK, améliore la sensibilité à l’insuline et augmente l’insulinémie. Notre étude montre aussi que N. sativa possède une activité antilipidémiante. Ces résultats confirment le bien-fondé de l'utilisation ethnopharmacologique de N. sativa comme traitement du diabète et des perturbations du métabolisme lipidique qui y sont associées. De plus, les actions pléiotropiques de N. sativa en font un traitement alternatif ou complémentaire du diabète très prometteur qui encouragent à présent la tenue d’études cliniques de bonne qualité. / Nigella sativa or black cumin is a medicinal plant and a popular condiment. The seeds of N. sativa are widely used in the traditional medicine of North African countries for the treatment of diabetes. However, the cellular and molecular mechanisms of action through which the plant exerts its hypoglycemic effect remain unclear. The aim of our study is to determine the effect of N. sativa on insulin secretion, glucose transport and signaling pathways involved in the regulation of glucose homeostasis and metabolism. We carried out in vitro murine cell-based bioassays (βTC pancreatic β cells, C2C12 myoblasts, H4IIE hepatocytes and 3T3-L1 adipocytes) and in vivo studies in normoglycemic rats and diabetic Meriones shawi (rodent). In pancreatic β cells, N. sativa increased cell proliferation as well as basal and glucose stimulated insulin secretion. It also enhanced glucose uptake in muscle cells by 50%. Moreover, the increase of glucose uptake in fat cells reached levels up to 400%. The experiments using Western immunoblot analysis showed that N. sativa stimulated insulin-dependent (Akt and ERK) as well as -independent (AMPK) pathways in C2C12 cells. In 3T3-L1 cells, the increase of glucose uptake was attributed to the activation of the peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) pathway. Similarly to C2C12 cells, N. sativa activated Akt and 5' adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) in hepatocytes. This activation of AMPK was associated with an uncoupling effect on mitochondrial oxidative phosphorylation. In diabetic Meriones, N. sativa gradually decreased fasting blood glucose and the glycemic response to an oral glucose load (OGTT) to values similar to normal animals at the end of treatment. Improved lipid profile is observed in both animal models. At the molecular level, N. sativa increased muscle glucose transporter 4 (Glut4) content and acetyl-coenzyme A carboxylase (ACC) phosphorylation in soleus muscle and liver in diabetic Meriones shawi. In normal rats, the plant extract induced a stimulation of insulin signaling pathways (Akt and ERK) in the liver. In conclusion, N. sativa has an insulinotropic effect on pancreatic β cells. Our study has revealed for the first time that N. sativa exerts its antidiabetic activity by a combination of insulino-mimetic and insulin-sensitizing effects, thereby increasing glucose uptake in peripheral tissues. This effect of N. sativa is linked to the stimulation of insulin-dependent and -independent (AMPK) pathway in skeletal muscle and liver, while in adipose tissue, the effect was attributed to the activation of PPARγ. Finally, the in vivo study confirms the antidiabetic and antihyperlipidemic effects of N. sativa. Our original contribution lies in the demonstration that the in vivo antidiabetic action of N. sativa is exerted though the same mechanisms identified by our in vitro studies. These data support the soundness of the ethnobotanical use of this plant for the treatment of diabetes and its associated dyslipidemia. Moreover, the pleiotropic actions of N. sativa make it a very promising alternative or complementary treatment for diabetes, which calls for immediate high quality clinical trials.