Knowledge of the key genes that affect the development of plants and their interaction with external agents is a very important aspect, both from a basic point of view and applied. Screening of mutagenized populations allows the identification of plants mutants and, from them, genes responsible for a particular character. Compared with other methodological alternatives (chemical or physical mutagens), insertional mutagenesis with T-DNA provides an additional advantage, the gene is tagged by an insert. Its identification is easier because it is possible to clone the mutated gene from the known T-DNA sequence. In order to identify genes that control early developmental traits, the screening of the progenies of 762 tomato T-DNA lines was carried out by using plant tissue culture techniques. The use of this methodology presents some advantages respect to in vivo scrutiny: less need of time and space, greater homogeneity in the environmental conditions, facility to detect alterations in the root system and possibility of detecting affected mutants in their morphogenetic capacity. We have identified 23 different mutant phenotypes that have been distributed by their most significant phenotype in altered mutants in root development, shoot development, cell death and morphogenetic response. The phenotypic and genetic characterization of all the mutants was made and it was possible to determine if there was cosegregation between the mutant phenotype and a T-DNA insert in five of the mutant lines identified. Finally, it has been possible to identify the genes responsible for the phenotype in two of the detected mutants. / El conocimiento de los genes clave que afectan al desarrollo de las plantas y su interacción con agentes externos es un aspecto muy importante, tanto desde un punto de vista básico como aplicado. El escrutinio de poblaciones de plantas mutagenizadas permite la identificación de mutantes y, a partir de ellos, los genes responsables de un carácter concreto. Comparada con otras alternativas metodológicas (mutágenos químicos o físicos) la mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional, ya que si el gen queda etiquetado por un inserto su identificación es más sencilla ya que se puede conocer de qué gen se trata a partir de la secuencia conocida del T-DNA. Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo temprano se ha llevado a cabo el escrutinio de las progenies de 762 líneas T-DNA de tomate mediante la utilización del cultivo in vitro. El empleo de esta metodología presenta ciertas ventajas respecto al escrutinio in vivo: menor necesidad de tiempo y espacio, mayor homogeneidad en las condiciones ambientales, facilidad para detectar alteraciones en el sistema radicular y posibilidad de detectar mutantes afectados en su capacidad morfogenética. Se han identificado 23 fenotipos mutantes diferentes que se han distribuido por su fenotipo más significativo en mutantes alterados en el desarrollo radicular, desarrollo de parte aérea, muerte celular y respuesta morfogenética. Se realizó la caracterización fenotípica y genética de todos los mutantes y se lo logró determinar si existía cosegregación entre el fenotipo mutante y un inserto T-DNA en cinco de las líneas mutantes identificadas. Por último se ha logrado identificar los genes responsables del fenotipo aado en dos de los mutantes detectados. / El coneixement dels gens clau que afecten el desenrotllament de les plantes i la seua interacció amb agents externs és un aspecte molt important, tant des d'un punt de vista bàsic com aplicat. L'escrutini de poblacions de plantes mutagenitzades permet la identificació de mutants i, a partir d'ells, els gens responsables d'un caràcter concret. Comparada amb altres alternatives metodològiques (mutágenos químics o físics) la mutagènesi insercional amb T-DNA aporta un avantatge adicional, ja que si el gen queda etiquetat per un inserit la seua identificació és més senzilla ja que es pot conéixer de quin gen es tracta a partir de la seqüència coneguda del T-DNA. A fi d'identificar gens que controlen caràcters del desenrotllament primerenc s'ha dut a terme l'escrutini de les progènies de 762 línies T-DNA de tomaca per mitjà de la utilització del cultiu in vitro. L'us d'esta metodologia presenta certs avantatges respecte a l'escrutini in vivo: menor necessitat de temps i espai, major homogeneïtat en les condicions ambientals, facilitat per a detectar alteracions en el sistema radicular i possibilitat de detectar mutants afectats en la seua capacitat morfogenética. S'han identificat 23 fenotips mutants diferents que s'han distribuït pel seu fenotip més significatiu en mutants alterats en el desenrotllament radicular, desenrotllament de part aèria, mort cel¿lular i resposta morfogenética. Es va realitzar la caracterització fenotípica i genètica de tots els mutants i se va determinar que existia cosegregación entre el fenotip mutant i un inserit T-DNA en cinc de les línies mutants identificades. Finalment s'ha aconseguit identificar els gens responsables del fenotip en dos dels mutants detectats. / Sánchez López, J. (2017). Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum) para la identificación de mutantes de inserción alterados en la morfogénesis y el desarrollo vegetal [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/78617

Los telómeros son complejos nucleoproteicos localizados en los extremos de los cromosomas eucarióticos. Están involucrados en la preservación de la integridad de los mismos, protegiéndolos de la degradación por nucleasas y de la recombinación y fusión con otros cromosomas. Por lo tanto, el mantenimiento de la función telomérica resulta fundamental para la estabilidad genómica y la viabilidad celular. Dado que una cantidad importante de mutágenos químicos son utilizados como agentes antitumorales, el estudio del daño inducido a nivel genético por estos compuestos reviste gran interés. El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral consistió en obtener nuevos conocimientos para lograr una mejor comprensión de los efectos de los mutágenos químicos sobre los telómeros de los cromosomas eucarióticos y estudiar la inestabilidad telomérica en un modelo murino de inducción tumoral. De este modo, se pretende establecer si los mutágenos químicos inducen inestabilidad telomérica retardada o persistente y si el desarrollo tumoral se relaciona o asocia con alteraciones específicas en el patrón de expresión de los genes ligados al mantenimiento telomérico. Para tal fin, en primer término se abordó el estudio de la inestabilidad telomérica (IT). Este comprende el análisis del daño cromosómico a nivel telomérico, los eventuales cambios en la longitud telomérica y en la actividad de la enzima telomerasa en la progenie de las células de rata ADIPO-P2, que fueron expuestas inicialmente a los mutágenos químicos bleomicina (BLM), estreptonigrina (EN) y estreptozotocina (EZ). Si bien se conocen parcialmente los efectos inmediatos o a corto plazo de algunos mutágenos químicos sobre los telómeros, se desconoce qué es lo que ocurre a largo plazo con los telómeros de las células que sobreviven al tratamiento con un mutágeno dado y si los mutágenos químicos inducen inestabilidad telomérica retardada tal como ocurre con las radiaciones ionizantes. El análisis de las aberraciones cromosómicas se llevó a cabo aplicando la técnica de PNA-FISH con sonda telomérica. Asimismo, se estudió la actividad de la enzima telomerasa, utilizando un kit comercial específico y la longitud telomérica se determinó mediante la técnica de Flow-FISH por citometría de flujo. Nuestros resultados demuestran que los mutágenos químicos BLM, EN y EZ pueden inducir inestabilidad telomérica hasta al menos 15 días después del tratamiento con los mismos. Asimismo, se evidenció que los llamados cromosomas incompletos (CI), a pesar de carecer de un extremo cromosómico, pueden ser transmitidos a la progenie de las células que fueron originalmente expuestas a dichos mutágenos. Además, se 5 determinó que las células expuestas a los mutágenos químicos mencionados son cromosómicamente inestables desde la primera división mitótica luego del tratamiento. Por otro lado, se observó que en las células ADIPO-P2 expuestas a los mutágenos, BLM, EN y EZ, la actividad de la enzima telomerasa depende de la presencia de telómeros cortos y no se correlaciona directamente con la inestabilidad telomérica registrada citogenéticamente. De esta manera, los resultados de la presente investigación permitieron obtener un mejor conocimiento de los efectos de los mutágenos químicos antitumorales sobre el genoma a largo plazo y por lo tanto, contribuirán a una mejor comprensión de su modo de acción sobre las células, lo cual resulta de fundamental importancia al momento de evaluar la eficacia y uso terapéutico de dichos compuestos. En segundo término, para determinar si el desarrollo tumoral in vivo se relaciona con alteraciones en el perfil de expresión de genes teloméricos (complejo shelterina), se estudió la actividad transcripcional de los genes responsables del mantenimiento telomérico. Para ello, se empleó la técnica de PCR en tiempo real en un modelo murino de inducción tumoral. Nuestros datos indican una disminución significativa de la actividad transcripcional en 2 de los 6 genes integrantes del complejo telomérico en mamíferos (trf1 y rap1). Esta alteración en la expresión de los mismos, podría considerarse como un posible marcador de inestabilidad genómica en melanoma murino. De este modo, mediante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, se lograron aportes significativos en relación a la inestabilidad telomérica existente a largo plazo a nivel telomérico, en células de mamífero (rata) expuestas in vitro a antibióticos antitumorales y la inestabilidad telomérica presente en un modelo in vivo de inducción tumoral (melanoma murino).

para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención: Fruticultura

El objetivo de esta Tesis Doctoral fue realizar la caracterización química y tóxica así como analizar la mutagenicidad y antimutagenicidad del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon (EAB). B. articulata, conocida como “Carqueja”, es una hierba silvestre utilizada muy frecuentemente en la medicina folclórica popular en Argentina y Sudamérica. La infusión de carqueja es ampliamente consumida para el tratamiento de afecciones gastrointestinales por su capacidad antiespasmódica y colagoga, entre otras. Mediante caracterización química por cromatografía líquida de fase inversa (RF-HPLC) se determinaron los compuestos fenólicos presentes en el EAB. Asimismo, se analizó la actividad antioxidante del EAB, por determinación de la concentración eficiente cincuenta (CE50) mediante la técnica de DPPH* (2, 2-fenil1-picril hidracilo) y se determinaron los porcentajes de inhibición del EAB frente al radical DPPH*. El análisis químico del EAB reveló que el polifenol mayoritario fue el ácido clorogénico. El contenido de ácido clorogénico en el EAB fué 2,05±0,11 mg/ml y su actividad antioxidante presentó un valor de CE50 de 101,86 µg/ml. Los estudios de toxicidad, mutagenicidad y capacidad antimutagénica se realizaron mediante el Ensayo de Ames empleando las cepas testigo Salmonella typhimurium TA98 (mutante de corrimiento de marco de lectura) y TA100 (mutante de sustitución de bases). Los ensayos de toxicidad se llevaron a cabo por determinación de las unidades formadoras de colonias co-incubando el EAB con las cepas testigo para evaluar concentraciones no tóxicas. Los ensayos de mutagenicidad y antimutagenicidad se realizaron con diferentes concentraciones del EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) las cuales se incubaron con diferentes concentraciones de mutágenos diagnóstico: 2-nitrofluoreno (2-NF), azida sódica (AZS), y 2-aminofluoreno (2-AF). Se implementó el método clásico de incorporación en placa y su modificación de pre-incubación. Para la evaluación de la antimutagenicidad se tomaron como parámetros los porcentajes de inhibición (%I) ejercidos por el EAB frente a la mutagenicidad inducida por los mutágenos diagnóstico (correspondiente al 100% de mutagenicidad). Los resultados encontrados indicaron al aplicar el Ensayo de Ames, que el EAB no resultó tóxico ni mutagénico en las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa) y en las condiciones de diseño experimental propuestos. El EAB presentó en el Ensayo de Ames aplicado un %I de 100% frente al mutágeno 2-AF al implementar el método de pre-incubación y con la cepa TA100, independiente de las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa). Los valores máximos de inhibición del EAB ejercidos en la cepa TA98 frente al 2-NF se obtuvieron con 10,0 mg/placa de EAB y el Ensayo de Ames, con el método de pre-incubación, siendo el %I de 91,0%. Frente a la AZS, la máxima inhibición se obtuvo, en el Ensayo de Ames, con el método de pre-incubación con un rango de %I de 40,0-41,0% para 1,0 y 10,0 mg/placa, respectivamente. Asimismo, se evaluó la capacidad antioxidante, tóxica, mutagénica y antimutagénica del ácido clorogénico utilizando la misma metodología implementada para el EAB (DPPH* y el Ensayo de Ames). Los resultados mostraron que la capacidad antioxidante del ácido clorogénico resultó ser mayor que la del EAB con una CE50= 0,269 µg/ml. El ácido clorogénico mostró ser no tóxico y no mutagénico en el Ensayo de Ames, en las concentraciones ensayadas (0,05 y 0,50 mg/placa). Los estudios de antimutagenicidad del ácido clorogénico mostraron que los %I máximos frente a 2-AF se obtuvieron con la cepa TA98 (%I de 75,5) y con la cepa TA100 (%I de 84,0), ensayando 0,50 mg/placa de ácido clorogénico mediante el método de pre-incubación. En base a estos resultados, se concluyó que el EAB y el ácido clorogénico poseen capacidad antioxidante y antimutagénica en los sistemas y condiciones experimentales aplicadas. La comparación de la capacidad antimutagénica entre el EAB y el ácido clorogénico indicó que fue necesaria una concentración cinco veces mayor de ácido clorogénico contenido en la muestra de EAB para alcanzar una actividad antimutagénica similar a la observada en el EAB. Se concluyó que la capacidad antimutagénica del EAB ocurría a través de un mecanismo antioxidante, influenciado por la presencia del ácido clorogénico y otros compuestos presentes en el mismo. En base a los datos obtenidos y la bibliografía existente se propone que los efectos antimutagénicos ejercidos por el EAB frente a los mutágenos ensayados respondería a un mecanismo llamado “desmutágeno”, donde la inhibición ejercida por el extracto posiblemente ocurra previamente a que los agentes mutagénicos produzcan un daño total o parcial sobre el ADN. Futuros estudios sobre los mecanismos moleculares implicados en el efecto antimutagénico ejercido por el EAB frente a diferentes mutágenos resultan necesarios y merecen ser estudiados en profundidad para dilucidar el posible mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral a partir de observaciones realizadas en cepas bacterianas aplicando el Ensayo de Ames.

D.L. A 455-2007

Antón Martínez, MT. (2012). La caracterización del mutante insercional Arlequín revela que el gen etiquetado tiene un papel clave en el desarrollo reproductivo de tomate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/16979

[EN] The knowledge of the key genes which crucially affect the development and stress tolerance of plants is a very important task and indispensable for both, the basic and the applied research. The screening of populations of mutagenized plants permits the identification of mutants and, starting with their analysis, the identification of the genes responsible for a certain trait. Compared to alternative methods (e.g. chemical or physical mutagens) the insertional mutagenesis using T-DNA offers the additional advantage of labeling the altered gene with a piece of known sequence that will facilitate its identification and cloning. On the other hand, the tomato is one of the world¿s economically most important vegetables which over the last few years also gained the status of a model organism for certain traits. In order to identify the relevant genes involved in the response of plants to abiotic stresses and processes related to the vegetative and reproductive development, our laboratory performs in collaboration with Dr. Lozano¿s (University of Almería) and Dr- Bolarín¿s (CEBAS-Murcia) groups a project of insertional mutagenesis in tomato and related wild species, among them Solanum pennellii. The present PhD-thesis is embedded in this context and aims to create a collection of transgenic plants of S. pennellii, design new methods helpful for evaluating the tolerance to salt stress, the identification of traits related to water or salt stress and screen several lines of S. lycopersicum which were pre-selected for showing different aberrations that could be related to the tolerance to abiotic stresses. By tackling these tasks it was possible to obtain the following results. After obtaining more than two thousand diploid transgenic lines of S. pennellii, 887 of them were screened with the different systems developed for detecting mutant plants. Two of the methods designed were based on in vitro culture and one for the short-term evaluation in vivo. With the latter one a total of 68 tomato lines were screened and among them a mutant with alterations in its development which could be interesting for its relation to abiotic stress tolerance identified. In the collection of S. pennellii several plants showing phenotypes with different alterations were detected. Three of them received an advanced examination and it was possible to identify and clone the affected gene in one case. The detected mutants as much as the developed technologies are of great value for deepening the understanding of the processes related to abiotic stress tolerance in a crop with the outstanding importance of the tomato. / [ES] El conocimiento de los genes clave que afectan al desarrollo de las plantas y su tolerancia a estreses abióticos es un aspecto muy importante, tanto desde un punto de vista básico como aplicado. El escrutinio de poblaciones de plantas mutagenizadas permite la identificación de mutantes y, a partir de ellos, conocer los genes responsables de un carácter concreto. Cuando se compara con otras alternativas metodológicas (mutágenos químicos o físicos) la mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional, ya que si el gen queda etiquetado por un fragmento de ADN de secuencia conocida su identificación y clonación es más sencilla. Por otro lado, el tomate es una de las especies con mayor importancia económica a nivel mundial que, en los últimos tiempos, se ha considerado también como especie modelo para el estudio de determinados caracteres. Para lograr la identificación de genes clave en la respuesta de las plantas a los estreses de tipo abiótico y en procesos del desarrollo tanto vegetativo como reproductivo, en nuestro laboratorio se está abordando, en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y de la Dra. Bolarín (CEBAS - Murcia), un proyecto de mutagénesis insercional con tomate y especies silvestres relacionadas, entre ellas Solanum pennellii. La tesis doctoral presente se enmarca en este contexto y tiene como objetivos la creación de una colección de plantas transgénicas de S. pennellii, el diseño de nuevos métodos aptos para evaluar la tolerancia al estrés salino, la identificación de caracteres relacionados con el estrés hídrico o salino y el escrutinio de algunas líneas de S. lycopersicum pre-seleccionadas por mostrar diferentes alteraciones que puedan estar relacionadas con la tolerancia a estreses de tipo abiótico. Tras abordar estos objetivos se han obtenido los siguientes resultados. Tras obtener más de dos mil líneas transgénicas diploides de Solanum pennellii se han evaluado 887 líneas con los diferentes sistemas de identificación de mutantes diseñados. Dos de los métodos de evaluación diseñados se basaron en el cultivo in vitro y uno en un sistema de cultivo in vivo a corto plazo. Además, con esta última metodología se evaluaron 68 líneas de tomate entre las que se identificó un mutante de desarrollo de elevado interés por su relación con la tolerancia a estreses abióticos. Entre las líneas de Solanum pennellii analizadas se han identificado fenotipos con distintas alteraciones. En tres de estas líneas se llevó a cabo una evaluación más avanzada llegando a identificar y clonar el gen afectado en una de ellas. Tanto los mutantes identificados como las metodologías desarrolladas son de gran valor para seguir profundizando en los procesos relacionados con la tolerancia a estreses abióticos en una especie tan importante como el tomate. / [CA] El coneixement dels gens clau que afecten al desenvolupament de les plantes i la seua tolerància a estressos abiòtics és un aspecte molt important, des d'un punt de vista bàsic com a aplicat. L'escrutini de poblacions mutagenitzades de plantes permet la identificació de mutants i a partir d'ells conèixer els gens d'un caràcter concret. Quan es compara amb altres alternatives metodològiques (mutàgens físics o químics) la mutagènesi amb T-DNA aporta un avantatge addicional, ja que al tindre el gen un fragment etiquetat pel T-DNA de seqüència coneguda la seua identificació i clonació és més senzilla. D'altra banda, la tomaca és una de las espècies de major importància econòmica a nivell mundial que, en els últims temps, s'ha considerat també una espècie model per a l'estudi de determinats caràcters. Per a aconseguir la identificació de gens clau en la resposta de les plantes a estressos abiòtics i processos de desenvolupament tant vegetatiu com reproductiu, en el nostre laboratori s'està abordant amb col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universitat d'Almeria) i la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia), un projecte de mutagènesi insercional amb tomaca i espècies silvestres relacionades, entre elles Solanum pennellii. La tesi doctoral s'emmarca en aquest context i té com a objectius la creació d'una col·lecció de plantes transgèniques de Solanum pennellii, el disseny de nous mètodes aptes per a avaluar la tolerància a l'estrès salí, la identificació de caràcters relacionats amb l'estrès hídric i salí, l'escrutini d'algunes línies de S. lycopersicum pre-seleccionades per mostrar diferents alteracions que puguen estar relacionades amb la tolerància a estressos de tipus abiòtic. En abordar estos objectius s'han obtingut els següents resultats. Després d'obtindre més de dos mil línies transgèniques diploides de Solanum pennellii s'han avaluat 821 línies amb els diferents sistemes d'identificació de mutants dissenyats. Dos dels mètodes d'avaluació dissenyats es basaren en el cultiu in vitro i un en un sistema de cultiu in vivo a curt termini. A més, amb aquesta última metodologia s'avaluaren 68 línies de tomaca entre les quals s'identificà un mutant de desenvolupament d'elevat interès per la seua relació amb la tolerància a estressos abiòtics. Entre les línies de Solanum pennellii analitzades s'han identificat fenotipus amb diferents alteracions. En tres d'estes línies es va dura a terme una avaluació més avançada arribant a identificar el gen afectat en una de les línies. Tant els mutants identificats com les metodologies desenvolupades són de gran valor per a seguir aprofundint en els processos relacionats amb la tolerància a estressos abiòtics en una espècie tan important como la tomaca. / Schleicher, P. (2017). Mutagenesis insercional en tomate y Solanum pennellii: Identificación de mutantes en inserción alterados en el desarrollo y la tolerancia a la salinidad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/81860

Uno de los aspectos fundamentales para mejorar un carácter es el conocimiento de los genes que lo controlan. Para llegar a averiguar cuáles son esos genes una de las alternativas es buscar mutantes en esos caracteres y, a partir de ellos, identificar cuáles son los que han variado respecto del material de partida. En comparación con otras alternativas metodológicas el empleo de la mutagénesis insercional presenta una evidente ventaja ya que si el gen alterado en un mutante queda etiquetado molecularmente se facilita enormemente su posterior identificación. Para identificar genes relacionados con la tolerancia al estrés hídrico y salino en tomate, se ha llevado a cabo el escrutinio de una parte de la colección de líneas T-DNA de tomate y Solanum galapagense. Además de caracterizar fenotípica y genéticamente las líneas identificadas, se ha profundizado en el conocimiento de mutantes que previamente habían sido detectados en nuestro grupo por su relación con estos caracteres. Se han identificado y caracterizado dos nuevos mutantes con alteraciones en su tolerancia al estrés hídrico. Se ha mejorado la caracterización de tres mutantes relacionados con la tolerancia a la salinidad que habían sido identificados previamente. Se han identificado y caracterizado 19 mutantes afectados en caracteres del desarrollo que podrían estar relacionados con la tolerancia a estos tipos de estrés abiótico. Por último, tras la identificación del gen responsable del mutante dor, que tenía alterada su capacidad de enraizamiento y organogénesis adventicia, se ha iniciado su análisis funcional mediante la obtención y análisis de las correspondientes líneas RNAi. / One of the fundamental aspects to improve a character is the knowledge of the genes that control it. One of the alternatives to find out which are those genes is to look for mutants in those characters and to identify which ones have changed with respect to the wild type. In comparison with other methodological alternatives, the use of insertional mutagenesis presents an obvious advantage since if the mutated gene is molecularly labeled, its subsequent identification is greatly facilitated. In order to identify genes related to tolerance to drought and salt stress in tomato, after developing the necessary methodologies, a part of the tomato TDNA and Solanum galapagense lines of our collection has been scrutinized. In addition to phenotypically and genetically characterizing the identified lines, we have improved the knowledge of mutants previously detected in our group by their relationship with these characters. Two new mutants have been identified and characterized with alterations in their tolerance to drought. The characterization of three mutants previously identified in our group and related to salinity tolerance has been improved. We have identified and characterized 19 affected mutants in developmental characters that could be related to tolerance to abiotic stresses. Finally, after the identification of the gene responsible for dor, a mutant with changes in its capacity for rooting and adventitious organogenesis, its functional analysis was started by obtaining and analyzing the corresponding RNAi lines. / Un dels aspectes fonamentals per millorar un caràcter és el coneixement dels gens que el controlen. Per arribar a esbrinar quins són aquests gens una de les alternatives és buscar mutants en aquests caràcters i, a partir d'ells, identificar quins són els que han variat respecte del material de partida. En comparació amb altres alternatives metodològiques l'ús de la mutagènesi insercional presenta un evident avantatge ja que si el gen alterat en un mutant queda etiquetat molecularment es facilita enormement la seva posterior identificació. Per poder identificar gens relacionats amb la tolerància a l'estrès hídric i salí en tomaca, després de la posada a punt de les metodologies necessàries, s'ha dut a terme l'escrutini d'una part de la col·lecció de línies T-DNA de tomaca i Solanum galapagense. A més de caracteritzar fenotípicament i genèticament les línies identificades, s'ha aprofundit en el coneixement de mutants prèviament detectats en el nostre grup per la seva relació amb aquests caràcters. S'han identificat i caracteritzat dos nous mutants amb alteracions en la seva tolerància a l'estrès hídric. S'ha millorat la caracterització de tres mutants identificats prèviament en el nostre grup i relacionats amb la tolerància a la salinitat. S'han identificat i caracteritzat 19 mutants afectats en caràcters del desenvolupament que podrien estar relacionats amb la tolerància als estressos abiòtics. Finalment, després de la identificació del gen responsable del mutant dor que tenia alterada la seva capacitat d'arrelament i organogènesi adventícia, s'ha iniciat la seva anàlisi funcional mitjançant l'obtenció i anàlisi de les corresponents línies RNAi. / Jáquez Gutiérrez, M. (2018). Caracterización de mutantes insercionales y somaclonales de tomate y Solanum galapagense alterados en la tolerancia a estrés abiótico y caracteres del desarrollo relacionados [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/106364

La tasa de cuajado es un factor determinante en la producción de un cultivar. Este proceso, regulado en gran medida por señales hormonales, representa la primera etapa del desarrollo de un fruto y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. A pesar de su importancia agronómica, los mecanismos moleculares que regulan el proceso del cuajado del fruto son aún desconocidos. La identificación y caracterización de mutantes afectados en la tasa de cuajado es una de las mejores estrategias para lograr este propósito. En este trabajo de investigación hemos abordado la caracterización de tres mutantes insercionales de tomate afectados en la tasa de cuajado de fruto. Dos de estos mutantes, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 y Lfs2448), identificados en el contexto de esta Tesis Doctoral, exhiben menor tasa de cuajado de fruto y presentan un patrón de herencia autosómica dominante. La caracterización de ambas mutaciones ha permitido descubrir que están asociadas a un fenómeno de letalidad del gameto masculino. La mutación Lfs2084 promueve la degeneración de los granos de polen que portan el inserto, pero también afecta al desarrollo reproductivo del ovario, lo que reduce de forma dramática la tasa de cuajado de fruto. El análisis del contenido endógeno de hormonas de este mutante parece indicar una alteración de la ruta del 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesis de fitohormonas, pigmentos fotosintéticos y moléculas de defensa. Los menores contenidos de GA1 en Lfs2084, la giberelina activa más importante en el inicio del desarrollo del fruto de tomate, podrían estar asociados con una mayor actividad del enzima catabólico SlGA2ox2. Estos resultados, junto con los cambios en los perfiles de expresión de SlARF7 y TAG1, son coherentes con el fenotipo de menor tasa de cuajado observado en el mutante. La mutación Lfs2448 también promueve la degeneración de los granos de polen portadores del inserto, reduciendo en gran medida la cantidad de tubos polínicos que progresan a lo largo del estilo durante el proceso de polinización. Su caracterización molecular ha indicado que el fenotipo de Lfs2448 podría estar ocasionado por la alteración de la función de uno o dos genes que codifican proteínas CYP450 y que se expresan mayoritariamente en botones florales y frutos de 1 cm. Los resultados sugieren que la mutación desempeña un relevante papel en el desarrollo reproductivo de tomate, afectando al proceso de polinización y al cuajado de fruto. Además, la caracterización del mutante Arlequín (Alq) ha revelado alteraciones en su programa de desarrollo vegetativo y reproductivo. Respecto al desarrollo vegetativo, Alq promueve un patrón de crecimiento más vigoroso que el que exhiben las líneas hermanas que carecen de la mutación, así como cambios en la configuración espacial del desarrollo radicular. Con relación al desarrollo reproductivo, Alq conduce a un mayor cuajado de fruto como consecuencia de eventos de división celular en el pericarpio del ovario previos al proceso de polinización. Un aspecto esencial desde un punto de vista agronómico es que la mayor tasa de cuajado permite que Alq mantenga la producción de fruto en condiciones de moderada salinidad. / Fruit setting rate is one of the most determining factors in the yield of a cultivar. This process, largely regulated by hormonal signals, is the first stage of fruit development and depends on the successful completion of pollination and fertilization. Despite their agronomic importance, the molecular mechanisms regulating the fruit setting process are still unknown. The identification and characterization of mutations affecting fruit set rate is one of the best strategies to achieve this purpose. In this research work the characterization of three tomato insertional mutants altered in the fruit set rate has been addressed. Two of these mutants, Lower fruit setting 2084 y 2448 (Lfs2084 and Lfs2448), identified in the context of this Doctoral Thesis, exhibit decreased fruit set rate and present an autosomal dominant inheritance pattern. The characterization of both mutations allowed us to discover that they are associated with a phenomenon of lethality of the male gametes carrying the T-DNA insert. The Lfs2084 mutation not only promotes degeneration of pollen grains bearing the T-DNA, but also affects the reproductive development of the ovary, dramatically reducing the fruit set rate. Analysis of the endogenous hormone content of this mutant suggests an alteration of the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway, responsible for the synthesis of phytohormones, photosynthetic pigments and plant defence molecules. The lower GA1 content in Lfs2084 mutant, the main active form to induce fruit development, may be associated with increased activity of the SlGA2ox2 catabolic enzyme. These results, together with the changes in the expression profiles of both SlARF7 and TAG1 genes, are consistent with the phenotype of lower fruit set rate. The Lfs2448 mutation also promotes degeneration of the pollen grains carrying the T-DNA, largely reducing the number of pollen tubes that progress along the style during the pollination process. Its molecular characterization indicated that the Lfs2448 mutant phenotype could be caused by the functional alteration of one or two genes that encode CYP450 proteins mostly expressed in floral buds and young fruits. Results suggest that the tagged gene plays an important role in tomato reproductive development, affecting both normal pollination and fruit set process. Furthermore, the characterization of the Arlequín (Alq) mutant revealed alterations in its vegetative and reproductive developmental program. As regards vegetative development, Alq mutation promotes a more vigorous growth pattern, as well as changes in the spatial configuration of root system. Regarding reproductive development, Alq mutation leads to increased fruit set as a consequence of cell division events in the ovary pericarp prior to the pollination process. Finally, it should be noted that, thanks to its higher fruit set rate, the Arlequin mutant is capable of maintaining fruit production in moderate salinity conditions, which is of great importance from an agronomic point of view. / La taxa de quallat és un factor determinant en la producció d`un cultivar. Aquest procés, regulat en gran mesura per senyals hormonals, representa la primera etapa del desenvolupament d¿un fruit i depén de l¿èxit de la pol·linització i de la fecundació. A pesar de la seua importància agronòmica, els mecanismes moleculars que regulen el procés de quallat són encara desconeguts. La identificació i caracterització de mutants afectats en la taxa de quallat és una de les millors estratègies per aconseguir aquest propòsit. En aquest treball d¿investigació hem abordat la caracterització de tres mutants insercionals de tomaca afectats en la taxa de quallat de fruit. Dos d¿aquests mutants, Lower fruit setting 2084 i 2448 (Lfs2084 i Lfs2448), identificats en el context d¿aquesta Tesi Doctoral, exhibixen una menor taxa de quallat de fruit i presenten un patró d¿herència autosòmica dominant. La caracterització d¿ambdós mutacions ha permés descobrir que es troben associades a un fenomen de letalitat del gàmeta masculí. La mutació Lfs2084 promou la degeneració dels grans de pol·len que porten l¿insert, però també afecta el desenvolupament reproductiu de l¿ovari, la qual cosa reduïx de forma dramàtica la taxa de quallat de fruit. L¿anàl·lisi del contingut endogen d¿hormones d¿aquest mutant pareix indicar una alteració de la ruta 2C-metil-Deritrol 4-fosfato (MEP), responsable de la síntesi de fitohormones, pigments fotosintètics i molècules de defensa. Els menors continguts de GA1 en Lfs2084, la gibberel·lina activa més important a l'inici del desenvolupament del fruit de tomaca, podrien estar associats amb una major activitat de l¿enzim catabòlic SlGA2ox2. Aquests resultats, juntament amb els canvis en els perfils d¿expressió de SlARF7 i TAG1, són coherents amb el fenotip de menor taxa de quallat observat en el mutant. La mutació Lfs2448 també promou la degeneració dels grans de pol·len portadors de l¿insert, reduint en gran mesura la quantitat de tubs pol·línics que progressen al llarg de l¿estil durant el procés de pol·linització. La seua caracterització molecular ha indicat que el fenotip de Lfs2448 podria estar ocasionat per una alteració de la funció d¿un o dos gens que codifiquen proteïnes CYP450 i que s'expressen majoritàriament en botons florals i fruits d¿un centímetre. Els resultats suggerixen que la mutació té una funció important en el desenvolupament reproductiu de la tomaca, afectant el procés normal de pol·linització i el quallat de fruit. A més, la caracterització del mutant Arlequín (Alq) ha revelat alteracions en el seu programa de desenvolupament vegetatiu i reproductiu. Pel que fa al desenvolupament vegetatiu, Alq promou un patró d¿expressió més vigorós que el que exhibixen les línies germanes que no porten la mutació, així com canvis en la configuració espacial del desenvolupament radicular. Quant al desenvolupament reproductiu, Alq conduïx a un major quallat de fruit com a conseqüència d¿events de divisió cel·lulars en el pericarp de l¿ovari previs al procés de pol·linització. Un aspecte essencial des d¿un punt de vista agronòmic és que la major taxa de quallat pemet que Alq mantinga la producció de fruit en condicions de moderada salinitat. / Ribelles Alfonso, C. (2018). IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MUTANTES DE TOMATE RELACIONADOS CON EL CUAJADO DEPENDIENTE E INDEPENDIENTE DE POLINIZACIÓN [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/111833

[EN] In order to identify the genes controlling developmental traits and abiotic stress tolerance in tomtato, our laboratory is performing an insertion mutagenesis program, in collaboration with the groups of Dr. Rafael Lozano (Almería University) and Dr. Mª Carmen Bolarín (CEBAS-Murcia). This PhD thesis is part of our insertion mutagenesis program and aims to keep deepening in the genetic dissection of relevant traits from an agronomic perspective using the generation and characterization of tomato T-DNA lines. With the goal of increasing the collection of tomato T-DNA lines previously generated in our group, we generated 974 new T-DNA lines. This collection of tomato T-DNA lines was evaluated in the greenhouse in order to detect dominant or semi-dominant mutants altered in vegetative and/or reproductive traits. In particular we paid special attention to mutants with changes in fruit set, since the altered genes in those mutants could play a role in the yield of tomato cultivars. The transition from ovary to a developing fruit (i.e. fruit set), occurs once the flower has reached the anthesis stage, and depends on the pollination and fecundation. However, the fruit development can also happen independently of pollination through a process named parthenocarpy. It is known that the growth regulators, mainly auxins and gibberellins, are involved in both kinds of fruit set processes. Even so, the genetic mechanisms that trigger the transition from ovary to fruit remain largely unknown. Accordingly, tomato mutants can be a valuable tool to shed light on the molecular and genetic basis that promote pollination-dependent or independent fruit set processes. Given the enormous interest raised by parthenocarpy, the work carried out in the context of this PhD thesis has been mainly focused on several seedless fruits mutants. The characterization of those mutants revealed alterations in vegetative plant development (e.g. leaf architecture) and/or reproductive development (e.g. fruit morphology) have been observed, suggesting that changes in endogenous levels of growth regulators (e.g. auxins and gibberellins) are closely related to the parthenocarpic fruit development. According to the histological analysis, most of the mutants showed cytological androsterility, and part of them also displayed deficiencies during the pollen sacs formation, a trait also related to parthenocarpic fruit development. Furthermore, it has been observed an increased fruit set rate in some parthenocarpic mutants leading to a higher fruit production per plant. Some mutants displayed a tight correlation between the alteration in floral whorls or fruit tissues and the expression of the GUS reporter gene included in the T-DNA, suggesting that the gen responsible of the mutant phenotype could be tagged by a T-DNA insert. Finally, the phenotypic, genetic and molecular characterization of the back-cross progeny of the Tom24 mutant suggests that this phenotype could be a consequence of a T-DNA insert which is not transmitted to the offspring due to a lethal effect in both types of gametes (male and female). / [ES] Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo y tolerancia a estrés abiótico, estamos abordando un programa de mutagénesis insercional en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Esta Tesis Doctoral se enmarca en el contexto de este programa de mutagénesis insercional y tiene como objetivo central seguir profundizando en la disección genética de caracteres relevantes desde un punto de vista agronómico a través de la generación y caracterización de líneas T-DNA de tomate. Con el objetivo de ampliar la colección que previamente se ha generado en nuestro grupo, se han obtenido 974 líneas T-DNA de tomate y se ha llevado a cabo la evaluación de estas líneas a fin de detectar mutantes dominantes o semidominantes afectados en caracteres vegetativos y/o reproductivos. En particular, la identificación de mutantes con cambios en el cuajado y desarrollo del fruto tiene una enorme relevancia a nivel agronómico dado que los genes alterados en estos mutantes intervienen sobre caracteres que contribuyen a la producción de un cultivar. El proceso de cuajado, es decir, la transición desde el ovario a un fruto en desarrollo, ocurre una vez la flor alcanza el estadio de antesis, y depende del éxito de la polinización y de la fecundación. No obstante, el desarrollo del fruto puede ser independiente de la polinización a través de un proceso denominado partenocarpia. En ambos procesos de cuajado, dependiente e independiente de polinización, están implicadas señales hormonales, especialmente auxinas y giberelinas (GAs). Aún así, la base genética de los mecanismos que desencadenan la transición del ovario a fruto es en gran medida desconocida. En este sentido, la disponibilidad de mutantes de tomate puede ser una herramienta muy valiosa para avanzar en el conocimiento de las bases moleculares y genéticas que promueven el cuajado del fruto dependiente e independiente de polinización. Habida cuenta del interés que suscita la partenocarpia, el trabajo realizado en el contexto de esta Tesis Doctoral se ha centrado en una serie de mutantes que desarrollan frutos sin semillas. La caracterización de estos mutantes ha permitido observar alteraciones en el desarrollo vegetativo (e.g. arquitectura foliar) y/o reproductivo (e.g. morfología del fruto) que sugieren cambios en los niveles endógenos de hormonas (e.g. auxinas y giberelinas) estrechamente vinculadas al desarrollo partenocápico del fruto. El análisis histológico ha indicado que la mayor parte de los mutantes exhiben androesterilidad citológica, y algunos también muestran alteraciones en la formación de los sacos polínicos o el desarrollo de la antera, un carácter que también está vinculado al desarrollo partenocápico del fruto. Por otro lado, se ha comprobado que la mayor tasa de cuajado de algunos mutantes partenocárpicos promueve una mayor producción por planta. En algunos mutantes se ha observado una estrecha relación entre la expresión del delator y la mutación, es decir, la actividad GUS se detecta en los órganos afectados, lo que sugiere que el gen responsable del fenotipo mutante se encuentra etiquetado por un T-DNA. Por último, la caracterización fenotípica, genética y molecular de plantas de la progenie de retrocruce del mutante Tom24 sugiere que el fenotipo se debe a un inserto de T-DNA que no se transmite a la descendencia debido a que provoca letalidad en ambos tipos de gametos (masculinos y femeninos). / [CA] Pel tal d'identificar els gens que controlen caràcters del desenvolupament i tolerància a estrès abiòtic, estem abordant un programa de mutagènesi insercional en col·laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Aquesta Tesi Doctoral s'emmarca en el context d'aquest programa de mutagènesi insercional y té l'objectiu central seguir profunditzant en la dissecció genètica de caràcters rellevants des d'un punt de vista agronòmic a través de la generació y caracterització de línies T-DNA de tomaca. Amb l'objectiu d'ampliar la col·lecció que prèviament s'ha generada en el nostre grup, s'han obtingut 974 línies T-DNA de tomaca y s'ha dut a terme l'avaluació d'aquestes línies amb la finalitat de detectar mutants dominants o semidominants afectats en caràcters vegetatius i/o reproductius. En particular, la identificació de mutants amb canvis en el quallat i desenvolupament del fruit té una enorme rellevància a nivell agronòmic atès que els gens alterats en aquests mutants intervenen sobre caràcters que contribueixen a la producció de un cultivar. El procés del quallat, és a dir, la transició des de l'ovari a un fruit en desenvolupament, passa una vegada la flor arriba a l'estadi d'antesi, y depèn de l'èxit de la pol·linització i de la fecundació. No obstant, el desenvolupament del fruit pot ser independent de la pol·linització a través d'un procés denominat partenocàrpia. En ambos processos de quallat, dependent o independent de pol·linització, estan implicats senyals hormonals, especialment auxines i gibberel·lines (GAs). Tot i així, la base genètica dels mecanismes que desencadenen la transició de l'ovari al fruit és en gran mesura desconeguda. En aquest sentit, la disponibilitat de mutants de tomaca pot ser una eina molt valuosa per a avançar en el coneixement de les bases moleculars y genètiques que promouen el quallat del fruit depenent o independent de pol·linització. Tenint en compte de l'interès que suscita la partenocàrpia, el treball realitzat en el context d'aquesta Tesi Doctoral s'ha centrat en una sèrie de mutants que desenvolupen fruits sense llavors. La caracterització d'aquests mutants ha permès observar alteracions en el desenvolupament vegetatiu (e.g. arquitectura foliar) i/o reproductiu (e.g. morfologia del fruit) que suggereixen canvis en els nivells endògens d'hormones (e.g. auxines i gibberel·lines) estretament vinculades al desenvolupament partenocàrpic del fruit. L'anàlisi histològic ha indicat que la major part del mutants exhibeixen androesterilitat citològica, i alguns també mostren alteracions en la formació del sacs pol·linics o el desenvolupament de l'antera, un caràcter que també està vinculat amb es desenvolupament partenocàrpic del fruit. D'altra banda, s'ha comprovat que la major taxa de quallat d'alguns mutants partenocàrpics promou una major producció per planta. En alguns mutants s'ha observat una estreta relació entre l'expressió del delator i la mutació, és a dir, l'activitat GUS es detecta en els òrgans afectats. Això suggereix que el gen responsable del fenotip mutant està etiquetat per un T-DNA. Per últim, la caracterització fenotípica, genètica i molecular de plantes de la progènie de retro-encreuament del mutant Tom24 suggereix que el fenotip és causa de un insert T-DNA que no es transmet a la descendència pel fet que provoca letalitat en ambos tipus de gàmetes (masculins y femenins). / Goergen, G. (2016). Generación de líneas T-DNA de tomate (Solanum lycopersicum L.), identificación de mutantes de inserción afectados en caracteres del desarrollo y caracterización de mutantes de fruto partenocárpico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62360