Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema biológico que denominamos Dosímetro de DNA, com o objetivo de avaliar a ação genotóxica da radiação UV solar a partir da produção de lesões na molécula de DNA. Para determinar os diferentes tipos de danos, utilizamos enzimas de reparo de DNA e anticorpos específicos. Complementando estas análises, foram ainda realizados ensaios de frequência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA. Através da utilização dessa tecnologia foi possível confirmar a produção de lesões CPDs e 6-4PPs após a irradiação em lâmpadas de UVB e UVA. Outro fator importante foi a maior indução de danos oxidativos que a banda de UVA apresentou em relação à de UVB. Exposições ambientais demonstram claramente que a luz solar possui diferentes perfís de indução de lesões de DNA, que variam de acordo com a localidade da irradiação, e que fenômenos biológicos como inativação de DNA e mutagênese são diretamente dependentes da presença de fotoprodutos na molécula de DNA e não estão associados aos danos oxidativos. Portanto, o sistema Dosímetro de DNA é capaz de fornecer uma ampla compreensão da ação genotóxica da luz solar e informações inovadoras que poderão ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias fotoprotetoras mais eficientes. / To better understand the impact of solar UV radiation upon DNA molecule, we developed a biological system based on the exposure of plasmid DNA to artificial and natural UV sources. The quantification of DNA lesions was performed through the use of specific DNA repair enzymes and antibodies. The biological effects of sunlight, as well as artificial UV-radiation, were evaluated through the determination of the DNA inactivation rate and mutagenesis frequency. Through the application of this technology, we could detect the induction of CPDs and 6-4PPs after exposures to UVB and UVA lamps. Interestingly, the induction of oxidative damages was significantly higher after UVA than UVB radiation. Surprisingly, the profiles of induction of DNA damages observed after sunlight exposures have presented variations especially according to the latitude. In addition, our data clearly indicate that the induction of these biological effects is directly related to the presence of photoproducts in UV-exposed DNA samples, and suggest that oxidative damages are not related to these biological processes. Therefore, a very suitable system was developed capable of providing a wide comprehension of the biological effects of solar-UV radiation upon the DNA molecule.

Os vetores retrovirais representam uma das melhores opções para transferência e terapia gênica, pois fornecem expressão do transgene em longo prazo. Entretanto, a inserção do provírus pode causar mutagênese insercional, induzindo proto-oncogenes. Eventos deste tipo têm sido descritos em protocolos clínicos para o tratamento de SCID-X1, doença granulomatosa crônica e talessemia beta, quando vetores retrovirais (oncorretrovirus) foram utilizados. Atualmente, existem poucos métodos simples e rápidos para revelar e quantificar a expansão clonal. Assim, descrevemos a construção uma biblioteca de vetores contendo uma marcação aleatória, denominada código de barras. O sequenciamento do código de barras permitirá revelar, caracterizar e até quantificar a expansão clonal de uma população de células transduzidas. Esta metodologia ajudará a testar novos arranjos de promotores e genes terapêuticos, para o desenvolvimento de vetores mais seguros contribuindo para a redução da probabilidade de um evento de proliferação clonal desencadeado pela mutagênese insercional. / Retroviral vectors represent one of the best options for gene transfer and therapy, where long-term transgene expression is required. However, insertion of the provirus can cause insertional mutagenesis, which may have adverse consequences, such as induction of proto-oncogenes. Such events have been described in clinical trials for the treatment of SCID-X1, chronic granulomatous disease and beta thalessemia with some retroviral vectors. Currently, there are few simple and quick methods that can reveal and quantify clonal expansion. Thus, we describe the construction of a vector library containing random markers, called \"barcodes\". The sequencing of the barcode could reveal, characterize and quantify the clonal expansion of a transduced cells population. This methodology will be valuable to test new arrangements of promoters and therapeutic genes, allowing the development of safer vectors, helping to reduce the probability of clonal proliferation events triggered by insertional mutagenesis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-05-17Bitstream added on 2014-06-13T18:08:59Z : No. of bitstreams: 1 manzano_bc_me_rcla.pdf: 1854321 bytes, checksum: 9a0ee7b01dd9ad96a34b4a6c821113b3 (MD5) / Os problemas que mais afetam a qualidade da água de rios e lagos estão associados com os descartes realizados nestes ambientes, principalmente, os de esgotos domésticos e industriais tratados de forma inadequada ou não tratados. Esses efluentes podem conter compostos químicos perigosos pela sua potencialidade em induzir efeitos citotóxicos e genotóxicos à biota exposta. Neste sentido, o presente trabalho teve por objetivo verificar o possível potencial citotóxico, genotóxico e mutagênico de químicos presentes nas águas do ribeirão Tatu, Limeira/SP, provenientes de descartes ilegais de pequenas indústrias e esgotos domésticos por meio do teste de aberrações cromossômicas (ACs) e micronúcleo (MN) em Allium cepa e ensaio do cometa em células de mamíferos. Foram realizadas coletas sazonais em cinco diferentes pontos do ribeirão, entre os anos de 2008 e 2009. As análises físicoquímicas das amostras de água mostraram uma grande degradação na qualidade da água do ribeirão, decorrente dos descartes de esgotos domésticos e industriais, de águas pluviais contaminadas e escoamento da agricultura. Os dados referentes ao bioensaio com A. cepa mostram que os períodos de seca são os mais críticos, pois levaram as respostas mais severas de indução de ACs e de MN no organismo teste utilizado. Em relação ao ensaio do cometa com as células HTC, as amostras de água coletadas no período de chuva intensa, apresentaram maior genotoxicidade, principalmente nos pontos mais impactados pelo recebimento dos efluentes, devido, possivelmente, ao carreamento de contaminantes para o leito do rio, promovido pelo escoamento da água das chuvas / The issues that most affect the water quality of rivers and lakes are associated with discharges in these environments, especially those of domestic and industrial sewage inadequately or not treated. These effluents may contain hazardous chemical compounds for their ability to induce cytotoxic and genotoxic effects to the biota exposed. In this sense, the present study aimed to determine the potential cytotoxic, genotoxic and mutagenic of chemicals present in the waters of the ribeirão Tatu, Limeira / SP, from illegal discharges from small industries and domestic sewage through the test of chromosomal aberrations (CAs) and micronucleus (MN) in Allium cepa and comet assay in mammalian cells. Five seasonally collections were performed at five different places of the river in 2008 and 2009. The physical-chemical analysis of water samples showed a large degradation in water quality of the stream, resulting from discharges of municipal and industrial wastewater, storm water and contaminated runoff from agriculture. The data on A. cepa bioassay show that the droughts are the most critical because the answers led to more severe induction of CAs and MN in the test organism used. Concerning the comet assay with HTC cells, water samples collected during the period of strong rain, had higher genotoxicity, especially at points of most impacted by the receipt of effluents, due possibly to the carrying of contaminants to riverbed, sponsored by runoff from rainfall

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 568781 bytes, checksum: e6beb96802418d9a09f3cb5c6661297e (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use P solubilizing microorganisms are an alternative for a sustainable use of P against a backdrop of depletion of high-grade ores. Nevertheless, the chemical characteristics of rock phosphates (RP), particularly the level of toxic elements, can affect the efficiency of microbial solubilization. Fluoride (F-) released from fluorapatites has been shown to significantly inhibit P solubilization by Aspergillus niger, stimulating the search for alternatives to overcome F- toxicity. Thus, the aim of this study was to select A. niger mutants efficient at P solubilization in the presence of F-. Three selected mutants were also characterized as to their P solubilization mechanisms and the solubilization potential of different P sources. Twenty-nine mutants were obtained that presented changes in their phosphate solubilization activity in comparison to the wild type (WT). The mutant FS1-331 showed higher solubilization of Araxá RP, while FS1-555 promoted higher soluble P when grown in media with calcium phosphate supplemented with F- and in those with pure P sources. These mutants also showed higher tolerance to F- than the WT and displayed changes in the production of organic acids. The higher production of oxalic acid by FS1-331 and FS1-555 correlated with their improved capacity of Araxá RP solubilization. A mutant with decreased P solubilization capacity showed lower production of organic acids, corroborating the importance of these compounds for RP solubilization. FS1-331 was more efficient at solubilizing Araxá, Catalão, and Patos de Minas RPs than the WT and FS1-555. The variation in P solubilization capacity of the mutants obtained in this work may help clarify the RP solubilization mechanisms by A. niger. Moreover, the mutants with better performance selected in this work show potential for use in microbial RP solubilization systems with P sources rich in fluoride. / O uso dos micro-organismos solubilizadores de fosfato (P) é uma alternativa para o uso sustentável do P tendo em vista a diminuição das reservas fosfáticas de alta qualidade. As características químicas dos fosfatos de rocha (FR), em especial o nível de elementos tóxicos, podem influenciar a eficiência de solubilização microbiana. O fluoreto (F-) liberado de fluorapatitas inibi significativamente o processo de solubilização por Aspergillus niger FS1. Assim, o objetivo deste estudo foi selecionar mutantes de A. niger eficientes na solubilização de fosfato na presença de F-. Três mutantes selecionados foram também caracterizados quanto aos mecanismos de solubilização de fosfato e ao potencial de solubilização de diferentes fontes de P. Vinte e nove mutantes com alterações na solubilização de fosfato foram obtidos. O mutante FS1-331 demonstrou maior potencial de solubilização de fosfato de Araxá, enquanto que o mutante FS1-555 aumentou o P solubilizado em meio de cultura com fosfato de cálcio suplementado com F- e naqueles com fontes sintéticas de P. Os mutantes avaliados mostraram maior tolerância ao F- do que o tipo selavagem e tiveram a produção de ácidos orgânicos alterada. A maior produção de ácido oxálico pelos mutantes FS1-331 e FS1-555 relacionou-se com o melhor desempenho dessas estiprpes na solubilização de fosfato de Araxá. Um mutante com solubilização de P diminuída (FS1-375) apresentou menor produção de ácidos orgânicos quando comparado ao tipo selvagem, corroborando a importância desses compostos para o processo de solubilização de FRs. O mutante FS1-331 foi o mais eficiente na solubilização dos FRs de Araxá, Catalão e Patos de Minas. A variação na solubilização de P das estirpes fúngicas estudadas pode contribuir para a melhor compreensão do processo de solubilização de fosfatos por A. niger. Além disso, os mutantes mais eficientes obtidos apresentam alto potencial de aplicação em sistemas microbianos de solubilização de fosfatos com fontes de P ricas em fluoreto.

A exposição a tintas, as quais contêm solventes orgânicos e metais, pode levar a danos no DNA e formação de espécies reativas (ER), que podem lesar diversas classes de moléculas. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis danos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos em 33 indivíduos, do sexo masculino, ocupacionalmente expostos a tintas há, no mínimo, 6 meses. Para o grupo controle, foram selecionados 29 indivíduos saudáveis, não expostos a tintas, pareados em idade com o grupo exposto. A fim de verificar a influência do descanso do fim de semana, foram realizadas coletas na segunda-feira pela manhã e na sexta-feira ao final da jornada de trabalho. Os danos oxidativos foram avaliados pelos produtos de reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteínas carboniladas (PC) e atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Foram medidos, ainda, o ácido hipúrico (AH) e o ácido deltaaminolevulínico (ALA), marcadores urinários de exposição ao tolueno e ao chumbo, respectivamente. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio cometa (em sangue periférico) e pelo teste de micronúcleos (MN) (em linfócitos e células da mucosa bucal). Não foi observado aumento significativo nos níveis de TBARS no grupo exposto quando comparado ao grupo controle. Entretanto, verificou-se, neste grupo, um maior índice de danos aos lipídeos nas amostras coletadas na sexta-feira comparado com as amostras coletadas na segunda-feira (p = 0,008; z = -2,637). Ao final da semana (amostras coletadas na sexta-feira), os indivíduos expostos a tintas apresentaram mais danos às proteínas em comparação com o grupo controle (p = 0,032; z = -2,14). Observou-se também, que os trabalhadores expostos a tintas tiveram uma diminuição nas atividades de Sod (p = 0,003; z = 2,935) e Cat (p = 0,025; z = -2,247) nas amostras de segunda-feira, bem como valores mais elevados de AH (p = 0,010; z = - 2,591) e de ALA (p = 0,000; z = -4,487). A exposição a tintas induziu um aumento significativo dos danos ao DNA (principalmente classes um e dois), tanto nas amostras coletadas na segunda (p = 0,000; z = - 5,356) quanto nas de sexta-feira (p = 0,000; z = -6,456). Apesar de não ter sido encontrado um aumento na frequência de MN em linfócitos ou em células da mucosa bucal no grupo exposto, observou-se um aumento de nuclear buds (NBUDs) (segunda-feira, p = 0,004, z = - 2,894), uma diminuição do índice de divisão nuclear (IDN) (sexta-feira, p = 0,000, z = -4,78) nos linfócitos e um aumento na frequência de células com cromatina condensada nas células da mucosa bucal (segunda-feira, p = 0,000, z = -4,503; sexta-feira, p = 0,000, z = -5,203), indicativo de amplificação gênica e indução de mecanismos apoptóticos nestas células. Observou-se uma correlação positiva entre o índice de danos no DNA (ensaio cometa) e o tempo de exposição a tintas (r = 0,376; p = 0,031), assim como entre o tempo diário de exposição a tintas e a frequência de micronúcleos (segunda-feira, r = 0,450; p = 0,018) e de NBUDs (sexta-feira, (r = 0,402; p = 0,038) nos indivíduos expostos. Embora outros estudos sejam necessários, esses resultados mostram que a exposição ocupacional a tintas pode induzir um aumento de danos no DNA, os quais parecem estar sendo reparados durante o descanso do final de semana. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-29T19:53:19Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carina Cassini.pdf: 626115 bytes, checksum: 4477a810de80e2c9702e22c8302fba89 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-29T19:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Carina Cassini.pdf: 626115 bytes, checksum: 4477a810de80e2c9702e22c8302fba89 (MD5) / Organic solvents and metals, widely used in paints, can lead to DNA damages and reactives species (RS) generation. The aim of this study was to evaluate possibles oxidative, genotoxic and mutagenic damages in 33 male workers exposed for at least six months to paint. To constitute the control group 29 healthy individuals were choosen, without paint exposure, which matched in age with exposed group. Two sampling were performed to verify a possible DNA repair during the weekend: in the beginning and at the end of work week. The oxidative damages were evaluated by thiobarbituric acid reaction products (TBARS), carbonylated proteins (CP), superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat) activities. Hippuric acid (HA) and delta-aminolevulinic acid (ALA) were used as toluene and lead markers exposure, respectively. The genotoxicity was evaluated by comet assay (in peripherical blood) and by micronucleus (MN) test (in limphocytes and exfoliated buccal cells). The results showed no significant increase in TBARS levels in exposed group in relation to the control group. However, the lipidic damages was higher in Friday samples comparing to Monday samples (p = 0.008; z = -2.637). The proteins damage was higher in exposed group in comparison to control group exclusively in Friday samples (p = 0.032; z = -2.14). It was also observed that the workers exposed to paints showed lower Sod (p = 0.003; z = 2.935) and Cat (p = 0.025; z = -2.247) activities in Monday samples. The exposed group presented HA levels (p = 0.010; z = - 2.591) and ALA levels (p = 0.000; z = -4.487) higher than the control group. The workers exposed to paints presented a significant increase in DNA damage in both Monday (p = 0.000; z = -5.356) and Friday (p = 0.000; z = -6.456) samples. No increase was observed in MN frequency in limphocytes and buccal cells. However, the individuals exposed to paints showed an increase in nuclear buds (NBUDS) (Monday samples, p = 0.004, z = -2.894), a reduction in nuclear division index (NDI) (Friday samples, p = 0.000, z = -4.78) in lymphocytes and an increase in condensed chromatin frequency in buccal cells (Monday samples, p = 0.000, z = -4.503; Friday samples, p = 0.000, z = -5.203), indicating genic amplification and apoptosis induction. The DNA damage index (comet assay) correlated positively with average working time (r = 0.376; p = 0.031). It was also observed a positive correlation between time daily exposure and MN (Monday samples, r = 0.450; p = 0.018) and NBUDs (Friday samples: r = 0.402; p = 0.038) frequency. These results showed that paint exposure is able to generate DNA damages and these damages are being repaired during the weekend.

A exposição a tintas, as quais contêm solventes orgânicos e metais, pode levar a danos no DNA e formação de espécies reativas (ER), que podem lesar diversas classes de moléculas. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo avaliar possíveis danos oxidativos, genotóxicos e mutagênicos em 33 indivíduos, do sexo masculino, ocupacionalmente expostos a tintas há, no mínimo, 6 meses. Para o grupo controle, foram selecionados 29 indivíduos saudáveis, não expostos a tintas, pareados em idade com o grupo exposto. A fim de verificar a influência do descanso do fim de semana, foram realizadas coletas na segunda-feira pela manhã e na sexta-feira ao final da jornada de trabalho. Os danos oxidativos foram avaliados pelos produtos de reação com o ácido tiobarbitúrico (TBARS), proteínas carboniladas (PC) e atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Foram medidos, ainda, o ácido hipúrico (AH) e o ácido deltaaminolevulínico (ALA), marcadores urinários de exposição ao tolueno e ao chumbo, respectivamente. A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio cometa (em sangue periférico) e pelo teste de micronúcleos (MN) (em linfócitos e células da mucosa bucal). Não foi observado aumento significativo nos níveis de TBARS no grupo exposto quando comparado ao grupo controle. Entretanto, verificou-se, neste grupo, um maior índice de danos aos lipídeos nas amostras coletadas na sexta-feira comparado com as amostras coletadas na segunda-feira (p = 0,008; z = -2,637). Ao final da semana (amostras coletadas na sexta-feira), os indivíduos expostos a tintas apresentaram mais danos às proteínas em comparação com o grupo controle (p = 0,032; z = -2,14). Observou-se também, que os trabalhadores expostos a tintas tiveram uma diminuição nas atividades de Sod (p = 0,003; z = 2,935) e Cat (p = 0,025; z = -2,247) nas amostras de segunda-feira, bem como valores mais elevados de AH (p = 0,010; z = - 2,591) e de ALA (p = 0,000; z = -4,487). A exposição a tintas induziu um aumento significativo dos danos ao DNA (principalmente classes um e dois), tanto nas amostras coletadas na segunda (p = 0,000; z = - 5,356) quanto nas de sexta-feira (p = 0,000; z = -6,456). Apesar de não ter sido encontrado um aumento na frequência de MN em linfócitos ou em células da mucosa bucal no grupo exposto, observou-se um aumento de nuclear buds (NBUDs) (segunda-feira, p = 0,004, z = - 2,894), uma diminuição do índice de divisão nuclear (IDN) (sexta-feira, p = 0,000, z = -4,78) nos linfócitos e um aumento na frequência de células com cromatina condensada nas células da mucosa bucal (segunda-feira, p = 0,000, z = -4,503; sexta-feira, p = 0,000, z = -5,203), indicativo de amplificação gênica e indução de mecanismos apoptóticos nestas células. Observou-se uma correlação positiva entre o índice de danos no DNA (ensaio cometa) e o tempo de exposição a tintas (r = 0,376; p = 0,031), assim como entre o tempo diário de exposição a tintas e a frequência de micronúcleos (segunda-feira, r = 0,450; p = 0,018) e de NBUDs (sexta-feira, (r = 0,402; p = 0,038) nos indivíduos expostos. Embora outros estudos sejam necessários, esses resultados mostram que a exposição ocupacional a tintas pode induzir um aumento de danos no DNA, os quais parecem estar sendo reparados durante o descanso do final de semana. / Organic solvents and metals, widely used in paints, can lead to DNA damages and reactives species (RS) generation. The aim of this study was to evaluate possibles oxidative, genotoxic and mutagenic damages in 33 male workers exposed for at least six months to paint. To constitute the control group 29 healthy individuals were choosen, without paint exposure, which matched in age with exposed group. Two sampling were performed to verify a possible DNA repair during the weekend: in the beginning and at the end of work week. The oxidative damages were evaluated by thiobarbituric acid reaction products (TBARS), carbonylated proteins (CP), superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat) activities. Hippuric acid (HA) and delta-aminolevulinic acid (ALA) were used as toluene and lead markers exposure, respectively. The genotoxicity was evaluated by comet assay (in peripherical blood) and by micronucleus (MN) test (in limphocytes and exfoliated buccal cells). The results showed no significant increase in TBARS levels in exposed group in relation to the control group. However, the lipidic damages was higher in Friday samples comparing to Monday samples (p = 0.008; z = -2.637). The proteins damage was higher in exposed group in comparison to control group exclusively in Friday samples (p = 0.032; z = -2.14). It was also observed that the workers exposed to paints showed lower Sod (p = 0.003; z = 2.935) and Cat (p = 0.025; z = -2.247) activities in Monday samples. The exposed group presented HA levels (p = 0.010; z = - 2.591) and ALA levels (p = 0.000; z = -4.487) higher than the control group. The workers exposed to paints presented a significant increase in DNA damage in both Monday (p = 0.000; z = -5.356) and Friday (p = 0.000; z = -6.456) samples. No increase was observed in MN frequency in limphocytes and buccal cells. However, the individuals exposed to paints showed an increase in nuclear buds (NBUDS) (Monday samples, p = 0.004, z = -2.894), a reduction in nuclear division index (NDI) (Friday samples, p = 0.000, z = -4.78) in lymphocytes and an increase in condensed chromatin frequency in buccal cells (Monday samples, p = 0.000, z = -4.503; Friday samples, p = 0.000, z = -5.203), indicating genic amplification and apoptosis induction. The DNA damage index (comet assay) correlated positively with average working time (r = 0.376; p = 0.031). It was also observed a positive correlation between time daily exposure and MN (Monday samples, r = 0.450; p = 0.018) and NBUDs (Friday samples: r = 0.402; p = 0.038) frequency. These results showed that paint exposure is able to generate DNA damages and these damages are being repaired during the weekend.

Nesse projeto, foi desenvolvido um sistema biológico que denominamos Dosímetro de DNA, com o objetivo de avaliar a ação genotóxica da radiação UV solar a partir da produção de lesões na molécula de DNA. Para determinar os diferentes tipos de danos, utilizamos enzimas de reparo de DNA e anticorpos específicos. Complementando estas análises, foram ainda realizados ensaios de frequência de mutação e da taxa de inativação biológica de DNA. Através da utilização dessa tecnologia foi possível confirmar a produção de lesões CPDs e 6-4PPs após a irradiação em lâmpadas de UVB e UVA. Outro fator importante foi a maior indução de danos oxidativos que a banda de UVA apresentou em relação à de UVB. Exposições ambientais demonstram claramente que a luz solar possui diferentes perfís de indução de lesões de DNA, que variam de acordo com a localidade da irradiação, e que fenômenos biológicos como inativação de DNA e mutagênese são diretamente dependentes da presença de fotoprodutos na molécula de DNA e não estão associados aos danos oxidativos. Portanto, o sistema Dosímetro de DNA é capaz de fornecer uma ampla compreensão da ação genotóxica da luz solar e informações inovadoras que poderão ser utilizadas no desenvolvimento de substâncias fotoprotetoras mais eficientes. / To better understand the impact of solar UV radiation upon DNA molecule, we developed a biological system based on the exposure of plasmid DNA to artificial and natural UV sources. The quantification of DNA lesions was performed through the use of specific DNA repair enzymes and antibodies. The biological effects of sunlight, as well as artificial UV-radiation, were evaluated through the determination of the DNA inactivation rate and mutagenesis frequency. Through the application of this technology, we could detect the induction of CPDs and 6-4PPs after exposures to UVB and UVA lamps. Interestingly, the induction of oxidative damages was significantly higher after UVA than UVB radiation. Surprisingly, the profiles of induction of DNA damages observed after sunlight exposures have presented variations especially according to the latitude. In addition, our data clearly indicate that the induction of these biological effects is directly related to the presence of photoproducts in UV-exposed DNA samples, and suggest that oxidative damages are not related to these biological processes. Therefore, a very suitable system was developed capable of providing a wide comprehension of the biological effects of solar-UV radiation upon the DNA molecule.

O presente trabalho teve por objetivo desenvolver tecnologia in vitro e associá-la à mutagênese, e avaliar plantas V 5 e V6 quanto aos caracteres agronômicos de produção em área de ocorrência da doença fusariose, visando ao melhoramento genético da pimenta-do-reino para obtenção de plantas tolerantes e/ou resistentes à doença fusariose. A aplicação das técnicas in vitro iniciou-se através da obtenção de plantas doadoras de explantes, a partir de estacas em casa-de-vegetação e, de sementes e embriões zigóticos in vitro. O processo de micropropagação foi desenvolvido a partir de gemas de plantas obtidas in vitro através do estabelecimento de condições adequadas de cultivo em meios de cultura apropriados para multiplicação de gemas, enraizamento e obtenção de "plantlets", e de tipo de substrato para aclimatação e formação de mudas. Após a definição deste processo, gemas de plantas de casa-de-vegetação foram submetidas a diferentes tratamentos de assepsia e as sobreviventes micropropagadas. Seleção in vitro foi estabelecida ao cultivar isolados patogênicos do fungo Fusarium solani f. sp. piperis em meio Czapek-Dox e, através da curva de crescimento foi estabelecido o período de 28 dias de cultivo mais adequado para obtenção de filtrado da cultura do fungo. Diferentes concentrações de filtrado e formas de esterilização foram testadas em meio de cultura de multiplicação de gemas e determinou-se a concentração de 55% do filtrado do fungo (v/v) sob a esterilização por duas autoclavagens, adequada para causar 100% de mortalidade de gemas susceptíveis à doença. Simultaneamente, testes de radiossensitividade foram desenvolvidos através da irradiação gama em gemas in vitro e a dose de 20Gy foi escolhida para indução de mutações. As gemas irradiadas que passaram por vários ciclos de multiplicação e sobreviveram ao agente seletivo, filtrado de cultura do fungo, estão sendo clonadas para serem submetidas à seleção artificial com esporos do fungo em casa-de-vegetação, seleção natural em campo de ocorrência da doença e avaliação agronômica. Testes indicaram, a concentração de 2x10 6 esporos/ml em suspensão e a aplicação no solo do fungo adequada para seleção em casa-de-vegetação. As plantas V5 e V6 avaliadas em campo quanto a mortalidade e caracteres de produção apresentaram performance semelhante às plantas da cultivar original quanto à média de comprimento de espiga (8,4 cm), peso (4,42g) e número de frutos (40 frutos) por espiga, peso de 100 frutos (10,67g) e rendimento de pimenta preta (> 30%). Entretanto, melhores resultados para a média de produção de pimenta verde (3.290g) e sobrevivência em área de ocorrência da fusariose. As análises por componentes principais e variáveis canônicas apresentaram divergência genética entre as plantas originadas por estacas que sofreram irradiação gama e aquelas da cultivar original. / The purposes of the present work were to develop in vitro technology, associating it with mutagenesis, and to evaluate the V5 and V6 plants based on agronomical characters of production in Fusarium incidence areas, aiming at the genetic improvement of black pepper to obtain tolerant and/or resistant plants to the disease. The use of in vitro techniques started with the production of explant donor plants from greenhouse-grown cuttings and from seeds and in vitro zygotic embryos. The micropropagation process was developed using young shoots of in vitro plants by establishment of proper growing conditions in culture media for multiplication, rooting and production of plantlets, and by determining a suitable substrate type for acclimatization and growing of plantlets. After the process was defined, young shoots obtained from greenhouse grown plants underwent different aseptic treatments and the surviving plantlets were micropropagated. In vitro selection was carried out by cultivating pathogenic isolates of Fusarium solani f. sp. piperis in Czapek-Dox medium and, by using a growing curve, the most suitable growing period (28 days) for obtaining the fungus culture filtrate was defined. Different filtrate concentrations and sterilization techniques were tested in culture medium for young shoot multiplication. A concentration of 55% (v/v) of fungus filtrate under sterilization by double autoclavation was considered adequate to cause 100% mortality of fusariosis susceptible young shoots. Simultaneously, radiosensitivity tests were carried out through gamma irradiation of in vitro young shoots and dose of 20Gy was selected for mutation induction. Irradiated young shoots which underwent several multiplication cycles and survived the selective agent, fungus culture filtrate, are being cloned in order to be submitted to artificial selection with the fungus spores in greenhouse, to natural selection in a disease incidence area and to agronomical evaluation. These tests indicated that the concentration of 2x10 6 spores/ml in suspension and the application of the fungus on soil were appropriate for greenhouse selection. The V5 and V6 plants evaluated in field conditions for mortality and production characters showed similar performance to the original cultivar plants regarding average height (8.4 cm), weight (4.42g) and number of fruits (40 fruits) per spike, weight of 100 fruits (10.67g) and black pepper yield (>30%). However, better results were observed for average green pepper production (3,290g) and survival rates in a fusariosis incidence area. Analyses of principal components and canonic variables evidenced genetic divergence between plants grown from gamma-irradiated cuttings and the original cultivar ones.

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T20:40:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ota_MeirePriscilla_M.pdf: 2076382 bytes, checksum: 656fb21011c6e51639a88741d801237c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: S. enterica provoca desde enterocolítes até infecções sistêmicas sendo S. enterica I 4,5,12:i:- (flagelar monofásica) responsável por diversos surtos de salmonelose em diversas partes do mundo. Sua incidência tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas e ela é caracterizada pela ausência da variação de fase flagelar, processo no qual dois tipos de flagelinas são expressos. Este trabalho teve como objetivo estudar a estabilidade do operon fljBA, responsável pela variação de fase flagelar, sob diferentes condições de cultivo. Para isso, o gene cat (resistência ao cloranfenicol) foi inserido próximo ao operon fljBA em linhagens de S. enterica Typhimurium uma vez que este sorovar deu origem a S. enterica I 4,5,12:i:- por deleção de fljBA. A estabilidade do operon foi verificada in vitro e in vivo e após tratamento da cultura com mitomicina C, antibiótico indutor de profagos. Este último tratamento foi utilizado em virtude da presença do fago Fels-2 próximo ao operon fljBA, uma vez que dados da literatura sugerem que a deleção do operon foi em decorrência da excisão/recombinação imprecisa de profagos. Os resultados obtidos sugerem que a deleção do operon parece ser um evento raro, dado que em nenhuma condição testada houve a reversão da resistência frente ao cloranfenicol. Essas observações abrem discussões sobre a essencialidade da variação de fase flagelar na patogenicidade de S. enterica. É possível que os clones que deram origem a S. enterica I 4,5,12:i:- apresentem características genotípicas e fenotípicas compensatórias a perda de variação de fase. Ainda neste trabalho a ausência dos genes fljA e fljB foram confirmadas em amostras clínicas de S. enterica I 4,5,12:i:- isoladas no Brasil, mas a análise de isolados provenientes de granjas sugerem a existência de um novo padrão de deleção do operon fljBA, dados estes que precisam ser melhor investigados. Além disso, foi desenvolvida uma reação de PCR-Duplex para detecção de S. enterica I 4,5,12:i:- (Clone Americano) e diferenciação deste de outros sorovares, particularmente Typhimurium. Este PCR se mostrou eficiente na identificação e diferenciação de S. enterica I 4,5,12:i:- (clone Americano) podendo ser utilizado como técnica complementar as técnicas tradicionais de sorotipagem, visto ser um método rápido, preciso e acurado. Os testes sorológicos são laboriosos e devido ao fato do flagelo de fase II nem sempre ser expresso, amostras do sorovar Typhimurium podem ser erroneamente identificadas como S. enterica I 4,5,12:i: / Abstract: S. enterica causes from enterocolitis to systemic infections with S. enterica serovar I 4,5,12:i:- (monophasic flagelar) responsible for multiple salmonellosis outbreaks worldwide. Its incidence increased considerable in recent years and it is characterized by absence of flagellar phase variation, a process in which normally two flagellins are expressed. This work aimed to study the instability of fljBA operon, responsible for flagellar phase variation under different conditions growth. For this goal, cat gene (resistant for chloramphenicol) was inserted next to fljBA operon in S. enterica Typhimurium strains once this serovar originated S. enterica I 4,5,12:i:- by fljBA deletion. Stability of operon was verified "in vitro", "in vivo" and culture treatment with Mitomycin C, prophages antibiotic inductor. This last treatment was used due the presence of Fels-2 prophage next to fljBA operon since previous works suggest that the deletion of operon is a result of imprecise excision/recombination of prophages. Results from this work suggest that the deletion of operon appear to be a rare event, since in none of condition tested were observed reversion of resistance mark to chloramphenicol. This observation leads to discussions about the essentiality of flagellar phase variation in pathogenicity of S. enterica. It is possible that clones whom originated S. enterica I 4,5,12:i:- presented compensatory genotypic and phenotypic features to the loss of phase variation. Absence of fljA and fljB genes was confirmed in clinic samples of S. enterica serovar I 4,5,12:i:- isolated in Brazil, but poultry samples suggest the presence of a new deletion pattern of fljBA operon, data that needs to be better investigated. Furthermore a Duplex-PCR were designed aiming S. enterica I 4,5,12:i:- (American Clone) and differentiation of it along others serovars, specially Typhimurium. This PCR showed efficient to identification and differentiation of S. enterica I 4,5,12:i:- (American Clone) technique that can be used as a complementary assay to traditional serotyping, since it is a fast, precise and accurate test. Serological tests are laborious and due phase flagellar II not always be expressed, samples of serovar Typhimurium can be misidentified as S. enterica I 4,5,12:i:- / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, e é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, pertencente à ordem Spirochaetales. Os seres humanos são hospedeiros acidentais e os surtos de leptospirose ocorrem em grandes centros urbanos após enchentes contaminadas por urina de ratos. Existem poucas informações a respeito de como Leptospira spp lida com situações de estresse induzidas pelo hospedeiro e pelo ambiente. O ferro é um íon essencial para a maioria dos seres vivos. A regulação de genes envolvidos por seu aporte e estoque na célula bacteriana é mediada por proteínas da família de reguladores transcricionais, Fur (ferric uptake regulator). L. interrogans sorovar Copenhageni possui quatro ortólogos para Fur, que foram alvo de estudo deste trabalho. A caracterização destes genes foi realizada através de estudos evolutivos, determinação do seu padrão de expressão em modelo animal e análise de modelagem estrutural. Durante o andamento do mestrado, ensaios paralelos revelaram resultados promissores na análise de expressão de genes relacionados ao sistema SOS, um mecanismo de resposta bacteriano a danos no material genético. Assim sendo, o estudo de caracterização de expressão em modelo animal suscetível e resistente à doença foi ampliado. Ensaios de qRT-PCR de cDNAs provenientes de pulmão, rim e fígado permitiram a identificação de dois genes que foram expressos quase que constitutivamente ao longo de toda a infecção em todos os órgãos e organismos estudados: fur979 e recA. Os demais foram requeridos em dias específicos da infecção. Quanto aos componentes do sistema SOS, observamos padrão de expressão específico para o rim, no quinto dia após a infecção. Para os estudos evolutivos de Fur foi gerada uma árvore filogenética que revelou o agrupamento de duas sequências da família Fur de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni em ramos fechados com sequências muito similares a proteína Fur e Zur de Escherichia coli. Os outros dois ortólogos agruparam com as proteínas correspondentes nas demais espécies de Leptospira. Uma destas sequências apresentou padrão evolutivo específico dentre as espécies patogênicas. A modelagem da estrutura terciária, confirmou o padrão evolutivo obtido em nossa inferência filogenética. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira, order Spirochetales. Human beings are accidental hosts, and leptospirosis outbreaks occur in large urban centers after contact with contaminated waterby rodent urine. There are few informations concerning the mechanisms employed by Leptospira sppto deal with the stress induced by the host and the environment Iron is an essential ion to most of living beings. The regulation of genes involved in its uptake and maintenance in the bacterial cell is mediated by the transcriptional regulator family proteins, Fur (ferric uptake regulators). L. interrogans serovar Copenhageni possesses four orthologues for Fur, which were the focus of this work. The characterization of Leptospira Fur genes was done through evolutive studies, determination of their expression pattern on animal model and structural modeling analysis. In parallel, some experiments presented promising results for the expression analysis of genes related to the SOS system, a bacterial response mechanism to DNA damage. Therefore, the gene expression characterization on susceptible and resistant animal model was amplified. qRT-PCR experiments of cDNA from lung, kidney and liver allowed the identification of two genes expressed almost constitutively during the infection in all organs and organisms : fur979 and recA. The others were required in specific days of the infection. Curiously, the SOS system components showed specific expression pattern in the fifth day after inoculation, in kidney. For the Fur evolutive studies, a phylogenetic tree was inferred, revealing the clustering of two Fur family sequences from Leptospira interrogans serovar Copenhageni in closed branches with very similar sequences to Fur and Zur proteins from Escherichia coli. The other two orthologues clustered with corresponding proteins in the other Leptospira species. One of these sequences presented a specific evolutive pattern among pathogenic species. The tertiary structure modeling confirmed the evolutive pattern obtained in our phylogenetic inference.