O cubiuzeiro (Solanum sessiliflorum Dunal) é uma planta nativa da Amazônia, utilizada na medicina popular no tratamento de queimaduras e no controle da glicemia e colesterolemia. Análises fitoquímicas da polpa dos frutos do cubiuzeiro, conhecidos como maná-cubiu, revelaram que este apresenta em sua constituição carotenoides, compostos fenólicos e vitaminas. Devido aos poucos estudos sobre a atividade biológica do fruto e à presença de compostos com propriedades antioxidantes, os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos da polpa do maná-cubiu sobre a estabilidade genômica, parâmetros de estresse oxidativo, expressão de genes pró-inflamatórios (iNos e COX-2) em ratos Wistar e determinar a presença de elementos químicos na polpa liofilizada por ICP-MS. Os animais receberam, por gavagem, a polpa liofilizada do maná-cubiu (125, 250, 375 ou 500 mg/kg p.c.) durante 14 dias. No último dia de tratamento foi administrada intraperitonealmente salina ou doxorrubicina (DXR, 16 mg/kg p.c.), usada como agente indutor de danos, e após 24 horas os animais foram eutanasiados. O sangue periférico e a medula óssea foram usados no teste do micronúcleo. No ensaio do cometa foram analisados fígado, coração e sangue periférico. Fígado e coração foram utilizados nas análises das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e glutationa reduzida (GSH) e na avaliação da expressão de RNAm dos genes COX-2 e iNos. Os resultados mostraram que a polpa do maná-cubiu não foi mutagênica nem citotóxica à medula óssea e ao sangue periférico dos animais. Nas doses 250 e 375 mg/kg p.c., a polpa do maná-cubiu reduziu o número de células micronucleadas induzidas pela DXR no sangue periférico, enquanto que na medula óssea somente a dose de 375 mg/kg p.c. foi antimutagênica. A polpa do maná-cubiu não foi genotóxica no fígado, coração e sangue periférico, e os animais tratados com a associação da polpa do maná-cubiu e DXR apresentaram uma redução de danos ao DNA. Nas doses de 250, 375 e 500 mg/kg p.c., a polpa do maná-cubiu foi capaz de reduzir a peroxidação lipídica induzida pela DXR em células hepáticas, mas não alterou as concentrações de GSH no fígado e no coração. Os dados obtidos da reação em cadeia da polimerase em tempo real referentes ao gene COX-2 mostraram que a polpa do maná-cubiu não modulou a transcrição deste gene. Ainda, a polpa liofilizada do maná-cubiu apresentou em sua composição a presença de elementos-traço como zinco, manganês, selênio, cobre e crômio, mas não em quantidades significativas. Os compostos bioativos presentes na polpa do maná-cubiu, como carotenoides e compostos fenólicos, podem estar relacionados com os efeitos protetores em certos tecidos e doses de maná-cubiu observados neste estudo. / Cubiuzeiro (Solanum sessiliflorum Dunal) is a native plant from Amazonian Forest, used in folk medicine to treat burns and to control cholesterol and blood glucose levels. Phytochemical analysis of the cubiuzeiro fruit, known as maná-cubiu, revealed that its composition exhibits carotenoids, phenolic compounds and vitamins. Due to the few studies that have assessed the biological activity and the presence of compounds with antioxidant properties in this fruit, the objectives of this study were to evaluate the effects of maná-cubiu pulp on genomic stability, oxidative stress parameters and expression of pro-inflammatory genes (iNos and COX-2) in Wistar rats and to determine the presence of chemical elements in the lyophilized pulp by ICP-MS. The animals received lyophilized maná-cubiu pulp (125, 250, 375 or 500 mg/kg b.w.) by gavage for 14 days. On the last day of treatment, saline or doxorubicin (DXR, 16 mg/kg b.w.), used as a genotoxic agent, were administered intraperitoneally, and after 24 hours the animals were euthanized. Peripheral blood and bone marrow were used in the micronucleus test. In the comet assay, liver, heart and peripheral blood cells were analyzed. Liver and heart tissues were used to analyze the thiobarbituric acid reactive substances and reduced glutathione (GSH) and to evaluate the mRNA expression of COX-2 and iNos genes. The results showed that maná-cubiu pulp was not mutagenic or cytotoxic in bone marrow and peripheral blood of the animals. At 250 and 375 mg/kg b.w. doses, the maná-cubiu pulp reduced the number of micronucleated cells induced by DXR in peripheral blood, while only the 375 mg/kg b.w. dose was antimutagenic in bone marrow cells. The maná-cubiu pulp was not genotoxic on liver, heart and peripheral blood cells, and the animals treated with maná-cubiu and DXR exhibited lower levels of DNA damage. At 250, 375 and 500 mg/kg b.w. doses, maná-cubiu pulp was able to reduce lipidic peroxidation induced by DXR on liver cells, however did not change the GSH levels on heart and liver cells. The data obtained by real time polymerase chain reaction (RT-qPCR) from COX-2 gene showed that maná-cubiu pulp did not alter the expression of this gene. Also, the maná-cubiu pulp presented trace elements as zinc, manganese, selenium, copper and chromium, but not in significant amounts. Bioactive compounds in the maná-cubiu pulp as carotenoids and phenolic compounds may be associated with the protective effect in certain tissues and doses of maná-cubiu shown in this study.

A poluição atmosférica vem recebendo crescente atenção como problema de saúde pública, pois representa uma fonte de agentes que podem promover o stress oxidativo e danos ao DNA, levando a efeitos cancerígenos e mutagênicos. As vias aéreas superiores, incluindo a cavidade oral são as áreas mais expostas do sistema respiratório, a material particulado e gases, e podem ser facilmente acessadas para monitorar a exposição humana a estes agentes. Nosso objetivo foi analisar o impacto da poluição do ar sobre a incidência de mutagénese em habitantes de nossa cidade. Para o estudo da mutagênese, utilizamos o teste de micronucleous (Mn), em células do epitélio da mucosa oral. Uma média de 4 a 6 amostras foram coletadas de cada voluntário, que concordou em participar do estudo, em São Paulo (SP) (n = 39) e, em Peruibe (PER), uma pequena cidade à beira-mar (n = 24), utilizados como um grupo controle. Os níveis de material particulado (PM10) foram medidos pelo método gravimétrico, e o ozônio e NO2 foram medidos pelos amostradores passivos, bem como pelas medições realizadas pela CETESB no mesmo local da coleta. Os resultados expostos em relação à concentração de MN / células, mostraram uma diferença estatisticamente significativa comparando SP (0042 ± 0032) e Per (0023 ± 0019), p = 0,009. Um aumento de MN / células foi observado em fumantes comparados aos não fumantes em SP (0055 ± 0012 e 0.040 ± 0005), p< 0,001 e em Per (0,0268 ± 0,00167 and 0,0181 ± 0,00128), p<0,001. Nosso estudo confirma os efeitos da poluição do ar na promoção de mutagênese e sugere possível sinergismo entre poluição e tabagismo / Air pollution is receiving crescent attention as a public health problem, as it represents a source of agents that may promote oxidative stress and DNA damage, leading to mutagenic and carcinogenic effects. The upper airways, including the oral cavity are the most exposed areas of the respiratory system to airborne particles and gases, and can be easily accessed to monitor human exposure to these agents. Our aim was to analyze the impact of air pollution on the incidence of mutagenesis in habitants of our city. To address mutagenicity, we used the micronucleous (mn) assay in desquamated cells of the oral mucosa. An average of 4 to 6 samples were collected from each subject that agreed to participate in the study in Sao Paulo (SP) (n=39) and in Peruibe (Per), a small city by the sea, (n=24) used as a control group. The levels of particulate (PM10) were measured by gravimetric methodology, ozone and NO2 were measured by passive monitors as well as by governmental monitoring stations in each location. The results exposed as mn/cells showed a statistically significant difference comparing SP (0,042 ± 0,032) and Per (0,023 ± 0,019), p= 0,009. An increase in mn/cells was observed in smokers compared to non smokers in SP (0,055 ± 0,012 and 0,040 ± 0,005), p<0,001 and in Peruíbe (0, 0268 ± 0,00167 and 0,0181 ± 0,00128), p<0,001. Our study confirms the hazardous effects of air pollution promoting mutagenesis and suggests that its effects may be synergic to smoking habit. We hope that our work may influence habits and public politics in order to improve public health in this issue

O cigarro é considerado pela Organização Mundial de Saúde como o maior agente de poluição ambiental doméstica atualmente. Muitos estudos têm analisado os efeitos do tabagismo passivo em seres humanos, mas pouco tem sido estudado em animais domésticos, assim como crianças, são os mais afetados pelo tabagismo passivo. O presente estudo busca correlacionar o exposição ao fumo passivo com a incidência de mutagênese através do teste da presença de micronúcleos nas células epiteliais da mucosa oral de cães expostos. Paralelamente, foi estudada a possível correlação desde dado com o nível de dependência à nicotina do proprietário, avaliada pelo teste de Fagerstrom. Para a avaliação da mutagênese, esfregaços da mucosa oral foram colhidos de 48 cães, 23 fumantes passivos e 25 não expostos. O número de micronúcleos por celula foi avaliado em todas as amostras. Os dados mostram que a incidência de micronúcleos foi estatisticamente maior nos animais fumantes passivos comparado com o controle (p < 0,001). Além disso, nos animais dos proprietários com escore 8 (dependência de nicotina muito alta) no Teste de Fagerstrom, a quantidade de micronúcleos foi significativamente maior do que nos animais de proprietários com escore 6 (alta dependência). Da mesma forma, nos cães de proprietários com escore 6 a incidência de micronúcleos foi estatisticamente maior que nos cães de proprietários com escore 3. Concluiu-se que existe uma associação entre a dependência da nicotina do proprietário e a frequência de alterações citogenéticas no cão exposto ao fumo passivo. Além das implicações para a saúde do animal, as observações do presente estudo podem contribuir para um estímulo à cessação do tabagismo em proprietários de animais domésticos / Cigarette smoking is considered by WHO as the major domestic air pollution agent. Many studies have addressed passive smoking and human beings but little has been studied about domestic animals. Domestic animals as well as children are dramatically affected by passive smoking. The present work tries to correlate passive smoking and micronucleus incidence in oral mucosa smears of pet dogs. In addition we studied a possible correlation between micronucleus incidence and owner´s nicotine dependence. With this purpose, owners were submitted to Fagerström questionnaire to address nicotine dependence. In the same way, oral mucosa smears were collected from 48 animals, 23 passive smokers and 25 not exposed to passive smoking. Micronucleus counts were performed in all samples at light microscopy. We observed a statistically significant difference (p < 0,001) between the two groups with an increased incidence of micronucleus formation in the passive smokers group compared to controls. Moreover, in the animals whose owners were at score 8 (very high nicotine dependence) on the Fagerstrom Test, the number of micronuclei was significantly higher than in animals with owners of score 6 (high dependency). Likewise, in dogs whose owners had a score 6 the incidence of micronuclei was statistically higher than in dogs whose owners had a score 3. It was concluded that there is an association between nicotine dependence of owners and frequency of cytogenetic alterations in dogs exposed to secondhand smoke. Besides ambient health impacts, the observations of the present study may contribute in helping dog owners quit smoking

A coenzima Q transporta elétrons das NADH e succinato desidrogenase para o complexo bc1 da cadeia respiratória mitocondrial. Há dez produtos gênicos conhecidos em seu metabolismo; este trabalho foca o último a ser descrito: COQ10. Considerando a presença de coenzima Q no interior de células contendo este gene inativo, verificamos a atividade respiratória da coenzima Q em mutantes coq10. Através de inibidores do ciclo da coenzima Q no interior do complexo III da cadeia respiratória mitocondrial (antimicina A e mixotiazol) na linhagem coq10, notou-se sua resposta a antimicina A, mas não a mixotiazol, sugerindo a existência de semiquinonas, que também foram confirmadas em testes de ressonância paramagnética eletrônica. O possível transporte e distribuição da coenzima Q por Coq10p foi estudado através de mutações sítio-dirigidas em posições críticas de um túnel de ligação existente em sua estrutura modelar, bem como por análise de super-expressão da proteína. Este trabalho confirma o papel central de Coq10p no metabolismo respiratório. / Coenzyme Q transports electrons from NADH and succinate dehydrogenase to the bc1 complex of the mitochondrial respiratory chain. Ten gene products are involved in coenzyme Q metabolism. This work focuses on the last gene to be described: COQ10. Considering the presence of coenzyme Q in the interior of cells containing this gene inactive, we analyzed the respiratory activity of coenzyme Q in coq10 mutants. By using Q cycle inhibitors, in the interior of the complex III of mitochondrial respiratory chain (antimycin A and mixotiazol), in coq10 lineage, it was noted the response to antimycin A, but not mixotiazol, suggesting the existence of semiquinones, which were also confirmed in tests of electron paramagnetic resonance. The possible transmission and distribution of coenzyme Q by Coq10p was studied by site-directed mutagenesis at critical positions of a tunnel present in the molecular model structure, as well as analysis of over-expression of the protein. This study confirms the central role of Coq10p in respiratory metabolism.

A glutamina e o glutamato são aminoácidos importantes no metabolismo bacteriano. A captação desses aminoácidos ocorre por meio de transportadores ativos do tipo ABC. No presente estudo avaliamos os sistemas de captação de glutamina/glutamato em Streptococcus mutans. Análises in silico revelaram a presença de dois operons que codificam sistemas de transporte de glutamina/glutamato: o operon gln, composto pelos genes e um segundo operon putativo composto pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. Por meio de mutagênese sítio-específica foi possível obter a deleção do operon constituído pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c. O mutante (linhagem KG1) obtido apresentou redução na captação de glutamato e glutamina. O mesmo ocorreu em relação ao mutante deficiente no operon gln. O mutante KG1 apresentou maior capacidade de adesão a superfícies abióticas. Os resultados obtidos revelaram que tanto o operon gln como o operon definido pelos genes smu.1177c, smu.1178c e smu.1179c estão envolvidos na captação de glutamina e glutamato pelo S. mutans. / Glutamine and glutamate are important amino acids for bacteria metabolism. Their uptake occurs via active transporter systems of the ABC family. On the present study we evaluate the glutamine/glutamate transport systems of Streptococcus mutans. In silico analysis revealed the presence of two polycistronic operons related to transport of glutamine/glutamate: the gln operon and a putative operon composed by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c genes. A mutant deleted on the smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c was successfully obtained by site-direct mutagenesis (KG1 strain), which demonstrated an impairment on glutamine and glutamate uptake, as shown by the mutant deleted on the gln operon. The KG1 strain demonstrated a gain on the abiotic surface adhesion The results revealed that both, gln operon and the operon consisted by smu.1177c, smu.1178c and smu.1179c, are involved to the internalization of glutamine and glutamate on S. mutans.

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline Soardi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T03:55:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Petroli_ReginaldoJose_D.pdf: 6228632 bytes, checksum: e6e99d402e3d99ccab57c84290065e84 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O receptor de andrógenos (AR) é um fator de transcrição pertencente à superfamília de receptores nucleares e é ativado por fosforilação e dimerização sob a ligação ao hormônio. Várias funções são atribuídas a este receptor, sendo a principal delas o desenvolvimento e manutenção das características sexuais masculinas, atua na regulação da expressão gênica e diferenciação celular em tecidos alvos. O presente trabalho teve por objetivo principal a análise do efeito das mutações p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val., p.Cis806Fen+p.Gln798Glu, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen e p.Pro904Arg sobre a função do AR. As mutações acima citadas, localizadas no domínio de ligação ao hormônio, foram identificadas por sequenciamento direto do gene do AR de pacientes 46,XY com diferentes graus da Síndrome da Insensibilidade Androgênica (AIS). Mutações nesse domínio geralmente rompem a ligação aos andrógenos naturais, porém há algumas que não afetam essa ligação, mas interferem na interação entre os domínios amino e carboxi-terminal (N/C terminal), importante para a estabilização receptor-ligante. Assim, ambas funções foram investigadas. Para se avaliar a capacidade de transativação das proteínas AR mutantes, foi realizada a técnica de mutagênese sítio dirigida no cDNA completo, seguida de transfecção e expressão em células e mamíferos e, análise de transativação induzida por concentrações crescentes de 5?-diidrotestosterona (DHT) utilizando-se um gene repórter. A análise das interações N/C-terminal para cada AR mutante foi realizada pela técnica de duplo-híbrido em células de mamíferos. A mutação p.Pro695Ser apresentou atividades de transativação de 85% e 82% nos ensaios transativação com o cDNA completo e no duplo-híbrido, respectivamente, em valores de DHT fisiológicos (cerca de 1 nM). As atividades atingiram valores normais em concentrações elevadas de DHT indicando um baixo efeito sobre a atividade gonadal. No entanto, em concentrações de DHT inferiores a atividade de transativação decai para menos de 50% nos dois experimentos, podendo afetar as funções do AR em tecidos não gonadais. Esta mutação foi considerada "branda" e corresponde perfeitamente ao fenótipo masculino do paciente que se apresentava com ginecomastia, mas com fertilidade preservada. Com 1 nM de hormônio, as mutações p.Ser759Tre, p.Leu830Fen, p.Ile898Fen apresentaram atividade de transativação superior a 20%, havendo um aumento de resposta com concentrações crescentes. No entanto, o comportamento de cada uma no experimento de interação N/C diferiu sendo que a p.Ile898Fen não apresentou atividade em nenhuma concentração de ligante; as p.Ser759Tre e p.Leu830Fen responderam positivamente ao aumento da concentração de DHT atingindo 50% e 250% da atividade trancricional do receptor selvagem, respectivamente. Esses resultados indicam um fenótipo parcial de AIS (PAIS) para os portadores das mutações p.Ser759Tre e p.Leu830Fen. Nesses casos verificou-se uma boa correlação dos achados funcionais com os fenótipos dos pacientes que apresentavam graus variados de PAIS. Já para a mutação p.Ile898Fen o fenótipo esperado baseando-se nos resultados funcionais seria o de AIS na forma completa (CAIS), porém os pacientes portadores desta mutação apresentavam graus variados de ambiguidade genital compatíveis com o fenótipo PAIS. Isto indica que outros fatores devem estar influenciando a manifestação fenotípica nesse caso. A mutação p.Leu768Val apresentou atividade transcricional nula em 1 nM de DHT nos dois experimentos, um perfil típico do fenótipo CAIS apresentado pelo portador desta mutação. As mutações p.Gln798Glu e p.Cis806Fen estudadas separadamente apresentaram respostas à indução de DHT semelhantes às de mutações "brandas" e PAIS, respectivamente. No entanto, quando estudadas em conjunto, a atividade de transativação com 1 nM foi inferior a 10%, aumentando com o aumento da concentração de ligante, comportamento compatível com mutações mais graves resultando no fenótipo CAIS observado nesse caso. Por último, a mutação p.Pro904Arg, embora tenha reduzido a atividade trancricional para cerca de 20% da selvagem no experimento com o cDNA completo, no experimento com duplo híbrido a atividade foi nula indicando uma ação mais grave compatível com a forma CAIS observada. A análise funcional do AR aqui realizada pode elucidar alguns mecanismos moleculares associados a cada mutação, bem como pode fornecer subsídios para a resposta ao tratamento com DHT em cada caso em particular / Abstract: The androgen receptor (AR) is a transcription factor that belongs to the superfamily of nuclear receptors activated by phosphorylation and dimerization by hormone binding. Several functions are attributed for AR, like male sex development, regulation of gene expression and cell differentiation in target tissues. The aim of this study was to analyze the effect of mutations p.Pro695Ser, p.Ser759Tre, p.Leu768Val, p.Cys806Phe+ p.Gln798Glu, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe and p.Pro904Arg upon AR transactivation activity. All mutations studied here are located in the hormone-binding domain and were identified in patients with different degrees of androgen insensitivity syndrome (AIS) by AR gene sequencing. Mutations in this domain can result in the impairment of androgen ligation, but there are cases that it does not affect the binding but interfere with the interaction between the amino and carboxi-terminal domains (N/C terminal), important step for receptor-binding stabilization. Thus, both functions have been studied in this work. To evaluate the ability of AR transactivation of mutant proteins, the site-directed mutagenesis assay was performed on full-length cDNA, followed by transfection and expression in mammalian cells. The analysis of transactivation of a reporter gene with different dihydrotestosterone (DHT) concentrations was performed. The analysis of N/C-terminal interactions for each mutant AR was performed by two- hybrid mammalian assay. The mutation p.Pro695Ser reveled transactivation activities of 85% and 82% in transactivation assays with the full-length cDNA and two hybrid assay, respectively, at DHT physiological values (approximately 1 nM). The activities reached normal values at high DHT concentrations, indicating a low effect on gonadal activity. However, in low DHT concentrations, the transactivation activity decays to less than 50% in both experiments, which may affect AR functions in non-gonadal tissues. This mutation was considered "mild" and corresponds perfectly to the male phenotype of the patient who presented with gynecomastia, but with preserved fertility. With 1 nM hormone, the p.Ser759Tre, p.Leu830Phe, p.Ile898Phe mutations showed transactivation activity higher than 20%, the response increased with higher DHT concentrations. However, in N/C interaction assays, those mutations showed different results. The p.Ile898Phe revealed a complete disruption in N/C interaction at all hormone concentrations; the p.Ser759Tre and p.Leu830Phe showed positive response with the increasing in DHT concentrations and reached 50% and 250% of the transcriptional activity of wild type, respectively. Such results indicate a partial AIS phenotype (PAIS) as functional effect for p.Ser759Tre and p.Leu830Phe. In these cases there was a positive correlation with the phenotypes of patients that presented different degrees of PAIS. For the p.Ile898Phe, the expected phenotype based on functional analysis would be the complete form of AIS (CAIS), but the patients with this mutation had variable degrees of genital ambiguity consistent to PAIS. This indicates that other factors must influence the phenotypic manifestation. The p.Leu768Val revealed a complete disruption at 1 nM DHT in both experiments, typical of CAIS. The p.Gln798Glu and p.Cys806Phe mutations studied separately revealed responses to the induction of DHT similar to Mild and Partial phenotypes, respectively. However, when analyzed together, the transactivation activity of 1 nM was lower than 10%, increasing in high ligand concentration, which is consistent to CAIS phenotype. Finally, p.Pro904Arg, although showed residual transcriptional activity around 20% of the wild type in the experiment with the full-length cDNA, it abolished the transcriptional activity when N/C terminal interaction was tested indicating a CAIS phenotype, as observed in the patient. Functional analysis of the AR performed here could elucidate some molecular mechanisms associated with each mutation, and may provide a basis for response to treatment with DHT in each particular case / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

As aminoacil-tRNA sintetases catalisam fielmente a ligação do aminoácido ao seu tRNA cognato. A triptofanil-tRNA sintetase (TrpRS) catalisa a ligação de triptofano e alguns análogos de triptofano ao tRNATrp. 1-metiltriptofano (1MW) e 1-metil-7-azatriptofano (1M7NW) não são reconhecidos pela TrpRS, mas possuem características espectroscópicas convenientes para estudos de fluorescência em complexos multiprotéicos. O objetivo deste trabalho é modificar o sítio ativo da TrpRS de E.coli, visando promover a catálise da ligação de 1MW e 1M7NW ao tRNATrp in vivo e permitir a incorporação destes em proteínas recombinantes. Com base numa análise da estrutura da TrpRS:Trp-AMP de B. Stearothermophilus, foram produzidos quatro mutantes de TrpRS de E. coli, com substituição do Asp 135 por Ala (D135A), Cys (D135C), Ser (D135S) e Thr (D135T). Estas proteínas foram superexpressas nas condições utilizadas para a incorporação de análogos de Trp. Através de ensaio de fluorescência do 1MW, pôde-se observar uma pequena incorporação deste nas TrpRS mutantes. Construiu-se um novo vetor de expressão no qual os TrpRS mutantes seriam expressos de forma constitutiva e uma segunda proteína, troponina C F29W, seria expressa de forma induzível. No entanto, não se observou incorporação do 1MW nestas proteínas. Ensaios de atividade in vitro, de formação de triptofano-hidroxamato e de intercâmbio de pirofosfato da TrpRS e mutantes indicaram uma baixa atividade dos mutantes utilizando triptofano como substrato. Os mutantes D135C e D135S apresentaram um considerável aumento (aproximadamente 24 vezes) na especificidade para 1MW em comparação ao Trp. A anotação do genoma da Xanthomonas indicou que a TrpRS deste organismo possui 88 aminoácidos extras na região C-terminal, o que é incomum para procariotos (somente observado em Xyllela e Pseudomonas). Clonou-se, expressou-se e purificou-se a TrpRS da Xanthomonas, com e sem os 88 aminoácidos extras. Observou-se atividade enzimática em ensaios de formação de triptofano-hidroxamato e intercâmbio de pirofosfato nas quais a TrpRS sem os 88 resíduos C-terminais apresentou uma atividade um pouco menor que a enzima tipo selvagem. / Abstract not available.

Os bancos de dados atualizados constituídos a partir de informações dos prontuários de pacientes HIV+ são importantes fontes para a realização de pesquisas clínicas e epidemiológicas de forma rápida e eficiente. A elevada variabilidade do HIV-1, resultado, entre outros fatores, da ausência de mecanismos eficientes de reparo durante os estágios da replicação viral, contribui para a emergência de cepas resistentes aos antiretrovirais. O objetivo deste trabalho é desenvolver e implementar um banco dados inteligente utilizando a Rede Neural Artificial Paraconsistente (RNAP), assentada na Lógica Paraconsistente Anotada, para auxiliar o mapeamento de informações contidas nos diversos formulários a fim de apoiar o mapeamento das informações provenientes dos diferentes registros médicos produzidos. O banco de dados será usado principalmente para apoiar o processo de decisão sobre a prescrição da terapia antiretroviral. Os resultados obtidos durante a pesquisa mostram que a técnica pode se tornar uma ferramenta promissora. / Updated databases made from information collected from HIV+ patients are important references to quickly and efficiently design clinical and epidemiologic studies. The high levels of variability of the HIV-1 virus, among other factors, the result of the absence of repair mechanisms during replication, strongly contribute to the establishment of resistance to antiretroviral therapy. The main objective of this study is the design and implementation of an inteligent database using the concept of Paraconsistent Artificial Neural Network (PANN) based on the Paraconsistent Annotated Logic, in order to support the mapping of the information coming from the different medical records produced. The database will be used primarily to support the decision process on the antiretroviral therapy prescription. Results obtained during the research show that the technique may become a promising tool.

O projeto visou aumentar a produção de celulases em fungos T. harzianum IPT 821 e T. reesei QM 9414. Esporos foram submetidos à radiação UV-C. Células das colônias mais capacitadas ao crescimento foram sucessivamente cultivadas em meio solidificado, contendo concentrações progressivamente reduzidas fonte de carbono, de modo a resultar pressão ambiental seletiva e crescente. Após esta etapa as linhagens isoladas foram cultivadas em meio composto por bagaço de cana/farelo de trigo na proporção 80/20, 60% de umidade, 30°C por 72h. Uma linhagem, originária da cepa IPT 821, apresentou atividade de 3,7 FP U/gms, 50% superior em relação à parental: 2,6 U/gms (p=0,001; p<0,05). Análises das frações enzimáticas indicaram uma diferença significativa (p=0,001; p<0,05) na atividade de xilanase: 4,7 U/gms (mutante) e 4 U/gms (parental). Ensaios de hidrólise, Avicel como substrato (1% de sólidos; w/v) indicaram um aumento de quase 70% na hidrólise em 48h, da mutante em comparação à parental (8,7% (mutante) e 4,8% (parental), concentração enzimática de 2,5 FP U/gms). / This project aimed to increase cellulase production in fungi T. harzianum IPT 821 and T. reesei QM 9414. Spores were exposed to UV-C radiation. Colonies were plated and those showing best growth were successively cultivated in plates containing increasingly stress conditions reduced concentrations of the carbon source thus creating a progressive selective pressure. After this pre-selection step isolated strains were cultivated in medium comprising sugar cane bagasse and wheat straw, in the proportion of 80/20 respectively, 60% of moisture, 30°C for 72h. One strain, originated from IPT 821 strain, showed a cellulolytic activity of 3,7 U/gdw; 50% superior to the parental strain: 2,6 U/gdw (p=0,001; p<0,05). Analysis of the enzymatic cocktail showed significant difference (p=0,001; for p <0,05) on xylanase activity: 4,7 U/gdw (mutant strain) and 4 U/gdw (parental strain). Hydrolysis assays, using Avicel as substrate (1% w/v) showed an increase on hydrolysis of about 70%, in 48h (8,7% (mutant strain) and 4,8% (parental strain), enzyme load of about 2,5 U/gdw).

O BCG é um bacilo atenuado de Mycobacterium bovis atualmente investigado na expressão de antígenos heterólogos. Genes oriundos de vírus, bactérias e parasitas são clonados em vetores de expressão micobacterianos e a partir deles, são geradas cepas de BCG recombinante, rBCG. Duas cepas micobacterianas, BCG e M. smegmatis, demonstraram a expressão do antígeno SmStoLP-2 e animais imunizados com este BCG não demonstra diferença na proteção contra a infecção por cercárias, apesar da resposta imune diferenciada. A otimização do códon de SmTSP-2 e SmVAL-5 permitiu sua expressão em M. smegmatis recombinante, mas não em BCG. M. smegmatis transformado com uma biblioteca de plasmídeos contendo o promotor L5p mutagenizado à montante de egfp demonstra acentuada diferença na fluorescência. 3 destes plasmídeos definidos como \'\'forte\'\' e \'\'fraco\'\', com base em sua capacidade de produzir GFP foram utilizados para expressar em BCG o antígeno Sm29 em maior e menor nível. / BCG is an attenuated bacillus derived from Mycobacterium bovis currently being investigated to express foreign antigens. Genes from viruses, bacteria and parasites are cloned to mycobacterial vectors and with them, recombinant BCG strains are created. Recombinant BCG and M. smegmatis strains where capable to express SmStoLP-2 and mice immunized with these rBCGs do not show better protection against infection with cercariae, although the distinct immune response observed. The use of codon optimization made possible the expression of SmTSP-2 and SmVAL-5 in M. smegmatis but not BCG. M. smegmatis transformed with a library of plasmids containing the L5p upstream egfp gene show a wide range in fluorescence. 3 of these plasmids strong and weak defined as their ability to produce GFP were used to express in BCG the antigen Sm29 at different levels by each promoter.