Submitted by Tatiana Oliveira (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-06-05T18:34:39Z No. of bitstreams: 1 Tatiana Oliveira Fulco.pdf: 6352891 bytes, checksum: 35625276b78761742a718df841963873 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-05T18:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tatiana Oliveira Fulco.pdf: 6352891 bytes, checksum: 35625276b78761742a718df841963873 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Estudos anteriores de nosso grupo demonstraram que o Mycobacterium leprae induz apoptose de monócitos humanos por uma via dependente de proteasoma. No presente trabalho nós demonstramos que o M. leprae induz a produção de TNFa e induz apoptose de monócitos por uma via dependente de NF-?B. A talidomida, utilizada no tratamento do Eritema Nodoso Hansênico, possui atividade anti-TNF por um mecanismo ainda não completamente elucidado. Nós demonstramos que a Talidomida suprime a produção de TNF por uma via dependente de p38 MAPK e NF-?B. O papel da remoção de células apoptóticas também foi avaliado. Apesar de macrófagos ativados pela via alternativa ou Mf2 possuírem maior capacidade de associação com o M. leprae quando comparados a macrófagos ativados pela via clássica ou Mf1, o estímulo com células apoptóticas levou ao aumento na associação do M. leprae em macrófagos Mf1, mas não Mf2. Esse aumento na associação do M. leprae com macrófagos Mf1 estimulados com células apoptóticas está associado ao aumento da expressão gênica de COX-2 e elevados níveis de PGE2, IL-10 e TGF-ß, com redução dos níveis de IL-6 e IL-15. Em conjunto, tais dados sugerem que na presença de células apoptóticas, macrófagos pró-inflamatórios estimulados com o M. leprae, desviam para um fenótipo antiinflamatório o que pode explicar o estabelecimento da infecção em pacientes com a forma tuberculóide da doença / Previous studies o four group revealed that Mycobacterium. leprae induces apoptosis of human monocytes by a proteasome-dependent pathway. In the present work we demonstrated that M. leprae induces TNFa and apoptosis by a NF-?B-dependent pathway. Thalidomide, drug used in treatment of erithema nodosum leprosum, has been described by its anti-TNFa activity although the mechanism is not fully understood. We demonstrated that thalidomide suppress TNFa production by p38 MAPK and NF-?B – dependent pathways. The role of apoptotic cell clearance was also evaluated. Although macrophages activated by alternative pathway or Mf2 have increased phagocytic activity when compared to macrophages activated by classical pathway or Mf1, apoptotic cell uptake increased the association of M. leprae with Mf1 but not Mf2. The increase in M. leprae association with apoptotic cell stimulated Mf1 is associated with the increased COX-2 gene expression and higher levels of PGE2, IL-10 and TGF-ß, with reduced levels of IL-6 and IL-15. Together, these data suggest that in the presence of apoptotic cells, M. leprae stimulated pro-inflammatory macrophages deviates to an anti-inflammatory phenotype that could explain the establishment of M. leprae infection in patients with the tuberculoid form of the disease

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) lucineia_kontos_ioc_dout_2009.pdf: 75178965 bytes, checksum: 32149962187e4997d9d42f8788cd70c8 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença sistêmica infecto-contagiosa crônica causada pelo patógeno intracelular obrigatório Mycobacterium leprae, que afeta principalmente a pele e nervos periféricos dos seres humanos. Apesar dos intensos e bem controlados programas de terapia multidroga, a transmissão desta doença continua ocorrendo e um grande número de indivíduos acometidos permanece em risco de desenvolver dano ao nervo. A lesão neural na hanseníase é decorrente da capacidade do M. leprae infectar os nervos periféricos, alojando-se preferencialmente no interior de células de Schwann (CS). O presente trabalho teve como objetivo geral contribuir para o entendimento da interação M. leprae - CS, e como objetivos específicos: 1) estabelecer e caracterizar fenotipicamente culturas de CS de rato (CSPR) e humanas primárias (CSHP), comparando com a linhagem de CS humana ST88-14; 2) determinar a cinética de associação do M. leprae a estas células; 3) analisar aspectos morfológicos da interação do M. leprae com a CS; e 4) estudar o efeito do M. leprae sobre a expressão da cadeia a-2 da laminina-2, Beta-distroglicana, Desert Hedgehog (Dhh) e gangliosídeo 9-O-acetil GD3 pela CS. Os resultados deste trabalho mostraram que as CS ST88-14, as CSPR e as CSHP apresentam características de CS com fenótipo amielínico. Através de microscopia eletrônica de varredura foi observado que as CS ST88-14 tratadas ou não com o M. leprae formaram monocamada e que 50 por cento destas células apresentaram M. leprae aderidos com 2 horas de tratamento. As bactérias apresentavam-se aderidas, envolvidas ou não por filopódios, e em processo de internalização. O grau de associação do M. leprae às CSPR e CSHP foi semelhante ao observado nas CS ST88-14. Uma baixa porcentagem de CS ST88-14 mostraram expressão constitutiva do gangliosídeo 9-O-Acetil GD3 Quando tratadas com o M. leprae letalmente irradiado estas células apresentaram uma modulação positiva para esta molécula e seu padrão de expressão, inicialmente difuso tornou-se pontual com o curso temporal do tratamento com as bactérias. A análise do efeito do M. leprae sobre a expressão da cadeia a-2 da laminina-2 em CSHP mostra que o bacilo não modula a expressão desta molécula tanto ao nível traducional como transcricional. Já o M. leprae modulou negativamente a expressão de RNAm de ß-distroglicana em CSHP. Entretanto não afetou o nível da protéina nas condições experimentais utilizadas. O M.leprae também modulou negativamente a expressão de RNAm de Dhh nestas células. Como camundongos ôknockoutõ para o gene dhh apresentam microfasciculação no nervo e 20 por cento das biopsias de nervo de pacientes com hanseníase apresentam microfasciculação, investigamos a expressão de Dhh em nervos de hanseníase com e sem microfasciculação. Biopsias com microfasciculação apresentaram uma considerável diminuição na expressão de RNAm de Dhh quando comparados com pacientes que apresentaram nervo sem microfasciculação. Com os resultados obtidos nesse trabalho mostramos que o M. leprae é capaz interagir com a CS in vitro e que moléculas potencialmente relevantes nesta interação são afetadas por esta bactéria, podendo isso desencadear e/ou promover a patogenia observada na hanseníase / Leprosy is an infectious and contagious disease caused by Mycobacterium leprae, an obligate intracellular parasite. The disease affects predominantly the skin and the peripheral nerves in humans. Despite the control programs implemented and the establishment of multidrug treatment (MDT), the transmission of the disease still occurs in high levels. Individuals affected by the disease are at risk of developing severe disabilities and deformities. The nerve damage observed in leprosy is caused by the presence of M. leprae in the nerves, mainly inside Schwann cells (SCs). The present study aimed to investigate the M. leprae-Schwann cell interaction, consisting of the following objectives: i) establishment and phenotypic characterization of cultures from primary rat Schwann cells (PRSC) and primary human Schwann cells (PHSC); ii) analysis of the capacity of M. leprae to associate these cells; iii) morphological analysis of M. leprae interaction with the ST88-14 human SC cell line by electron microscopy; and iv) investigation of the effect of M. leprae on the Schwann cell expression of α2- laminin, -dystroglycan, desert hedgehog (Dhh) and 9-O-acethyl-GD3. The results showed that ST88-14 SC, PRSC, and PHSC display a non-myelinating phenotype. Scanning electron microscopy showed that ST88-14 SC cultures treated or not with M. leprae formed a monolayer and that 50% of these cells displayed M. leprae on their surface after a two-hour treatment with the bacteria. The bacteria were in contact with the cell surface, amid fillipodia or lying on smooth membrane regions; some of them were in the course of being internalized. A similar degree of association of M. leprae to PRSC and to PHSC was observed. A low percentage of the ST8814 SC constitutively expressed the 9-O-acetyl GD3. After treatment with lethally irradiated M. leprae these cells exhibited an upregulation of this ganglioside, with an additional change in the expression pattern, which was initially difuse and became spotty. The results obtained also suggest that M. leprae is unable to modulate the expression of laminin-α2 in PHSC, both at the transcriptional and at the translational level. In contrast, live M. leprae was able to downregulate the levels of -dystroglican mRNA to in PHSC cultures, although protein levels were unaffected. Moreover, M. leprae stimulus induced downregulation of Dhh mRNA in PHSC. As dhh knockout mice present minifascicles in the nerves, and about 20% of leprosy biopsies display microfasciculation, we ascertained the Dhh expression in leprosy nerve biopsies with microfasciculation, comparing it with the ones without this morphological pattern. Nerve biopsies with microfasciculation exhibited significantly lower levels of this factor, speculatively related to the structural disarrangement usually found in the leprosy nerves. The results of this study showed the possible utilization of Schwann cells in vitro models to study M. leprae-Schwann cell interaction. M. leprae was able to affect the expression of relevant SC molecules involved in the interaction with the bacillus, with a potential link of this modulation with the pathogenesis of the leprosy nerve damage.

Made available in DSpace on 2015-10-23T12:45:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 thiago_pinto_ioc_mest_2013.pdf: 2486105 bytes, checksum: 868a236b9a638adc77cfb2312e1f391d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A indução da via de interferon (IFN) do tipo I (IFN-\03B1 e -\03B2) é crucial para uma resposta protetora contra infecções virais. Entretanto, estudos recentes demonstraram que esta classe de IFNs tem a ativação mediada por receptores citoplasmáticos de DNA e regula negativamente a resposta protetora contra a infecção por bactérias intracelulares, com destaque para o Mycobacterium tuberculosis, criando um nicho favorável para a replicação micobacteriana. Um estudo anterior do nosso grupo, utilizando uma abordagem de expressão gênica global por microarranjos, demonstrou que a infecção de células de Schwann com Mycobacterium leprae induz genes ativados por IFN do tipo I, com destaque para o gene OASL, o qual codifica a proteína 2\2019 5\2019 oligoadenilato sintetase like. No presente estudo, esses resultados foram estendidos e validados utilizando o modelo de macrófagos derivados de célulasTHP-1. Nossos dados demonstram que a OASL foi induzida por M. leprae vivo, mas não M. bovis BCG ou M. leprae morto. Adicionalmente, a transfecção de DNA de M. leprae, mas não de RNA, induziu a produção de OASL. Em nosso modelo, a infecção por M. leprae não foi capaz de induzir a produção de IFN-\03B1, assim como o tratamento CpG não induziu OASL, excluindo assim a sinalização de DNA mediada por TLR9 Além disso, mostramos evidências da permeabilização fagossomal mediada pelo fator de virulência micobacteriano ESAT-6, a qual permite acesso do conteúdo do fagossomo ao citoplasma e, consequente, produção de IFN-\03B2. O bloqueio farmacológico de TBK1 foi capaz de inibir a produção de OASL mediada pela infecção com M. leprae, indicando, dessa forma, que a indução de IFN-\03B2 e seus genes a jusante, como o OASL, ocorre através do eixo de sinalização STING/TBK1/IRF3. Interessantemente, o silenciamento gênico de OASL resultou na redução da viabilidade intracelular do M. leprae juntamente com redução da liberação da quimiocina CCL2/MCP-1 induzida por M. leprae. Entretanto, a transfecção de DNA seguida por infecção com M. bovis BCG foi capaz de reverter o fenótipo avirulento dessa bactéria, aumentado sua viabilidade intracelular e induzindo altos níveis de CCL2/MCP-1. Dessa maneira, nossos dados sugerem que a ativação da via de IFN tipo I é, de fato, capaz de inibir a reposta protetora do hospedeiro contra micobactérias, criando um ambiente favorável para a sobrevivência da micobactéria no ambiente intracelular, representando assim um potencial alvo para intervenções farmacológicas e/ou prevenção / The induction of interferon pathway (IFN) type I (IFN - α and - β ) is crucial for a protective response against viral infections. However, emergent research has shown that type I IFNs and cytoplasmic DNA signaling ar e negative regulators of the protective response against infection by in tracellular bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis , and provide a favorable niche for mycobacterial replication. Recently, using an approach of global gene expression by microar r ay, our group showed that Schwann cells infection with Mycobacterium leprae induced genes activated by IFN type I, highlighting the OASL gene, which encodes the 2 '5' oligoadenylate synthetase like protein. In the present work , these results were extended and validated using the THP - 1 - derived macrophages m odel . Our data demonstrate that OASL and type I IFN pathway was upregulated by M. leprae , but not M. bovis BCG or dead M. leprae , in macrophage - like THP - 1 infected cells. In addition, M. leprae DNA transfection but not RNA, was able to induce OASL production . In our model, M. leprae infection was not able to induce IFN - α and OASL was not induced by CpG, therefore excluding a TLR9 dependent pathway. Furthermore, we show evid ence of fagossomal permeabilization mediated by mycobacterial virulence factor ESAT - 6, which enables access of contents of the phagosome to host cytoplasm and subsequent induction of IFN - β. Pharmacological blockag e of TBK1 was able to inhibit M. leprae - ind uced OASL mRNA expression, indicating thereby that the IFN - β induction and its downstream genes, such as OASL occur through the STING/TBK1/IRF3 pathway . Interestingly, OASL targeted silencing directly decreased intracellular M. leprae survival and impaired the CCL2/MCP - 1 secretion. Furthermore, M. leprae DNA transfection followed by infection with M. bovis BCG has reverted the avirulent infection phenotype of this mycobacteria, increasing its intracellular viability and inducing high levels of CCL2/ MCP - 1. Together , these results suggest that OASL plays an important role in the response to mycobacteria and provide a potential pharmacological target for prevention or intervention

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:09:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_silva_ioc_dout_2014.pdf: 1893436 bytes, checksum: a728c60780229234c48d95aea41671ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fagócitos mononucleares são as células-alvo para micobactérias patogênicas que geralmente requerem um ambiente intracelular adequado para sua sobrevivência e replicação. Mycobacterium leprae, o agente etiológico da Hanseníase, é capaz de subverter mecanismos microbicidas de macrófagos e sobreviver e replicar no interior dessas células. Contudo o mecanismo molecular envolvido na modulação da célula hospedeira, não étotalmente compreendido. O presente estudo mostrou o potencial papel exercido pelo IGF-I na patogênese causada pelo M. leprae. Foi demonstrado que o M. leprae induz a expressão do fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-I), em macrófagos RAW 264.7. Curiosamente, apenas quando as células foram tratadas com anticorpo neutralizante para o receptor do tipo I de IGF-I (IGF-1R) o M. leprae foi capaz de regular positivamente a expressão da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) em macrófagos RAW 264.7 ou ativar o promotor de iNOS em células transfectadas com a construção contendo gene repórter da luciferase sob o controle do promotor de iNOS O bloqueio da sinalização de IGF-I reduziu a viabilidade intracelular do M. leprae determinada por qPCR. As células RAW 264.7 pré-tratadas com IGF-I apresentaram uma redução significativa da atividade do promotor iNOS em resposta ao Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium smegmatis e consequentemente um aumento na viabilidade intracelular monitorada através de contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU). Outro fato é que IGF-I foi capaz de atenuar a ativação de macrófagos mediada por IFN-\F067 medida através da expressão de iNOS e da quantificação da fosforilação de Ativador de transcrição e de transdução de sinal (pSTAT1). Além disso, o IGF-I foi capaz de induzir aumento de PGE2 em macrófagos, um eicosanoide previamente implicado na persistência micobacteriana no hospedeiro. Finalmente, a análise imuno-histoquímica de lesões cutâneas de pacientes lepromatosos (LL) revelou uma expressão abundante de IGF-I por macrófagos espumosos altamente infectados Além disso, uma alta expressão da proteína Supressora de sinalização de viii citocinas 3 (SOCS3) e diminuição a ativação STAT1 foi observada em lesões LL, em comparação com lesões tuberculóide BT. Esses resultados sugerem que o IGF-I pode contribuir para a persistência micobacteriana no hospedeiro, modulando negativamente s mecanismos microbicidas do hospedeiro durante a infecção / Mononuclear phagocytes are target ed cells for pathogenic mycobacteria that gener al ly require a favorable intracellular environment in wi c h they survive and replicate. Mycobacterium leprae, the etiologic agent of leprosy , is able to subvert macrophage microbicid al mechanisms and survive and replicate within these cells. However, the molecular mechanism involved in pathogen driven host cell modulation is not fully understood. The present study investigated the potenti al role of insulin - like growth factor - I (IGF - I) i n M. leprae pathogenesis. We showed that M. leprae induces IGF - I expression in RAW 264.7 macrophages in a dose - dependent manner . Notably, only when cells were treated with a neutr al izing antibody to IGF type 1 receptor (IGF - 1R) , M. leprae infection was able to upregulate inducible nitric oxide sintase ( iNOS ) expression in RAW cells or to activate the iNOS promoter in cells transfected with the iNOS - luciferase reporter construct . . The blockage of IGF - I sign al ing al so decreased the intracellular M. le prae viability as measured by qPCR . Mo reover, RAW cells p re - treated with IGF - I showed a significant reduction in iNOS promoter activity in response to Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium smegmatis with subsequent increase in bacteri al intracellular surviv al as accessed by colony - forming unit counts (CFU) . Of note, IGF - I was able to attenuate interferon gamma (IFN -  ) activating effects on macrophages as acessed by iNOS expression and quantification of phosphorylate d Sign al Transducers a nd Activators of Transcription 1 (p - STAT1). Addition al ly, IGF - I was able to induce PGE 2 secretion in murine macrophages, an eicosanoid previously implicated in mycobacteri al persistence in the host. Fin al ly, i mmunohistochemic al an al ysis of skin lesions of lepromatous leprosy (LL) patients reve al ed an abundant expression of IGF - I by highly infected foamy macrophages. Moreover, LL lesions reve al ed higher expression of Suppressor of cytokine sign al ing 3 (SOCS3), as well as decreased levels of p - STAT1 when compared to borderline tuberculoid (BT) lesions. Al together, our data suggest that IGF - I produced by macrophages in response to M. leprae infection constitutes a critic al regulator in subverting the immune response in leprosy

Made available in DSpace on 2016-05-16T13:01:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_lopes_ioc_dout_2015.pdf: 2822157 bytes, checksum: 7ef4250346238fec2cbc79a65607b81c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, com alto poder incapacitante. O tratamento se baseia na combinação de três drogas: dapsona, rifampicina e clofazimina, porém, a ocorrência de reações adversas (ADRs) induzidas principalmente pela dapsona (~70%) é frequentemente observada. Dentre as ADRs destacam-se: a metemoglobinemia, anemia hemolítica, a hepatite e a síndrome da dapsona. A metabolização da dapsona é baseada em reações enzimáticas de acetilação e hidroxilação, catalisadas, pelas enzimas N-acetiltransferase2 (NAT2) e hidroxilases do citocromo P450 (CYPs). Dentre os vários fatores associados à ocorrência de ADRs, o fator genético é primordial. Polimorfismos presentes em genes que codificam para enzimas metabolizadoras de drogas podem representar alto risco para este desfecho. Paralelamente, outro aspecto importante é a alta variabilidade genética ligada à etnia. O Brasil é um país composto por uma população altamente miscigenada com alta diversidade genética. Sendo a hanseníase uma doença endêmica tratada com um esquema padronizado para toda a população, a avaliação destes perfis genéticos é de fundamental relevância para a prevenção de ADRs. Este estudo teve como principal objetivo descrever a variabilidade dos genes NAT2, CYP2E1, CYP3A4 e CYP3A5 em coortes de pacientes de hanseníase provenientes das cinco diferentes macrorregiões do Brasil e realizar um estudo de associação, do tipo caso-controle, entre as variáveis genéticas presentes nesses genes com a ocorrência de reações adversas em pacientes com hanseníase em tratamento com esquemas contendo dapsona Um total de 964 indivíduos foram incluidos no estudo descritivo de NAT2 enquanto para o estudo de associação variou dependendo da região. Vinte e três SNPs de NAT2, foram identificados nas populações estudadas, dos quais sete: 191 G>A; 282 C>T; 341T>C; 481 C>T; 590 G>A; 803 A>G e 857 G>A, são os mais frequentes na população mundial. Os resultados mostraram uma predominância de alelos NAT2 associados com acetilação lenta porém variando de acordo com a região estudada. De forma semelhante, após genotipagem dos genes da família CYP450, foi observado que as frequências alélicas e genotípicas também variaram ao longo de todo território brasileiro. Os resultados mostraram que pacientes hansenianos com perfil de acetilação lenta e de hidroxilação rápida (CYP2E1), avaliados separadamente demonstraram uma associação com a ocorrência de ADRs, porém com Razões de Chance menores (2,4 e 1,9) que na análise combinada (4,08 para CYP2E1). Os perfis de hidroxilação rápida caracterizada pela presença dos alelos CYP3A5*3,CYP3A5*6 e CYP3A4*1B analisados separadamente não apresentaram associação com a ocorrência de ADRs, porém na análise combinada com o perfil de acetilação lenta, observou-se uma forte associação com este desfecho representada pelas ORs (6,4 para CYP3A5*3; 4,83 para CYP3A5*6 e 2,84 para CYP3A4*1B) sugerindo que a combinação entre os perfís fenotípicos de acetilação lenta com hidroxilação rápida representam o algorítimo ideal para uma proposta de teste preditivo a ser utilizado como suporte no tratamento da hanseníase com esquema contendo DDS / Leprosy is a chronic infectious disease with high disabling potential. The treatment is based on the combination of three drugs: dapsone, rifampicin and clofazimine, however, the occurrence of adverse drug reactions (ADRs) mainly induced by dapsone (~70%) is frequently observed with a predominance of methemoglobinemia, hemolytic anemia, hepatitis and dapsone syndrome. The dapsone metabolization is mediated by acetylation and hydroxylation enzymatic reactions catalyzed by the N-acetyltransferase 2 (NAT2) and cytochrome P450 (CYPs). Among the various factors associated with the occurrence of ADRs, the genetic factor is essential. Polymorphisms in genes encoding drug metabolizing enzymes may represent a high risk for this outcome. In paralell, another important aspect is the high genetic variability related to ethnicity. Brazil is composed of a high mixed population with high levels of genetic diversity. Being leprosy is an endemic disease which treatment is a standard regimen for the entire population, the evaluation of these genetic profiles became relevant for prevention of ADRs. The main goals of this study was to describe the genetic variability of NAT2, CYP2E1, CYP3A4 and CYP3A5 in cohorts of leprosy patients from five Brazilian geographical regions and to perform an association study (case-control) between the genetic variants present in these genes and occurrence of ADRs in leprosy patients treated with dapsone-containing schemes. A total of 964 individuals were enrolled to the descriptive study for NAT2 while for the association study the sample size varied according to the region.Twenty-three SNPs in NAT2, were identified in the study populatuion, seven of which 191 G> A; 282 C> T; 341T> C; 481 C> T; 590 G> A; 803 A> G and 857 G>A are the most frequent in the world population. The results showed a predominance of the NAT2 alleles associated with slow acetylation however, varying according to the studied region . Similarly, after genotyping of CYP450 gene family, an allele and genotype frequency variation was also observed over Brazil. The results showed that leprosy patients with slow acetylation and rapid hydroxylation profile (CYP2E1), evaluated separately showed an association with the occurrence of ADRs, but with lower Odds ratios (2.4 and 1.9) then that observed in combined analysis (4.08 CYP2E1). The fast hydroxylation profile characterized by the presence of CYP3A5*3, CYP3A5*6 and CYP3A4*1B, analyzed separately did not showed association with the occurrence of ADRs, however, the combined analysis with NAT2 slow acetylation profile showed a strong acetylation with this outcome represented by the ORs ( 6.4 for CYP3A5*3; 4.83 for CYP3A5*6 and 2.84 for CYP3A4*1B) suggesting that the combination of slow acetylation with fast hydroxylation phenotypes represent the ideal algorithm for a predictive test to be used as a support for leprosy treatment with DDS-containing regimen.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-31. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:29:11Z : No. of bitstreams: 1 000850658.pdf: 2276941 bytes, checksum: 13c29afa33557110baf35e9a370a42d4 (MD5) / O município de Rondonópolis, no Mato Grosso é altamente endêmico para a hanseníase, apesar da existência de serviços qualificados para o diagnóstico e acompanhamento dos casos e a implementação da poliquimioterapia. Para resolver este paradoxo, um estudo completo de epidemiologia molecular foi iniciado. Questionários estruturados, incluindo detalhes clínicos, residencial, demográficas e ocupacionais, amostras biópsias de pele e outros exames laboratoriais para diagnóstico foram coletadas para 260 pacientes diagnosticados no período de 2007-2010. Genótipos de Mycobacterium leprae foram determinados pela a análise por STRs e tipagem de SNP utilizando DNA extraído de biópsias de pele antes de iniciar o tratamento. GoogleMaps foi utilizado para localizar os pacientes. A média de idade dos pacientes variou na faixa dos 11 aos 90 anos e incluiu a 137 homens e 123 mulheres. De acordo com a classificação Ridley & Jopling observamos um predomínio das formas TT (39%) e BT (33%), seguido por BB (19%), BL (5%), LL (3%) e I (1%). A cidade é essencialmente urbana, com 200.000 habitantes e os pacientes estavam distribuídos em 106 bairros. Bairros de alta endemicidade englobando bairros vizinhos puderam ser detectados. Das 260 amostras de DNA de biópsias foram analisadas por meio de 17 loci STRs, 15 loci foram polimórficos (2-23 alelos), enquanto que os loci de 6-3A e 21- 3 foram invariáveis. Quando foram analisados os genótipos do SNP observou-se que 77% (n = 200) foram genótipo 3, 16% (n = 41), o genótipo 4, 1,5% (n = 4), o genótipo 1 e 3, 8% (n = 10 ) genótipo 2. Duas amostras (0,76%) para diferenciar o genótipo 1 do 2 na análise de seqüenciamento foi inconclusivo e em outras três amostras (1,15%) não obtivemos amplificação. Por meio da análise filogenética, observou-se uma estrutura populacional composta por alguns subgrupos. Vários isolados tipados por STRs foram encontrados em cada um dos bairros. Diversidade... / The municipality of Rondonópolis, in Mato Grosso is highly endemic for leprosy despite the existence of qualified services for diagnosis and monitoring of cases and the implementation of multidrug therapy. To address this paradox, a comprehensive molecular epidemiology study was initiated. Structured questionnaires including clinical, residential, demographic, and occupational details and skin samples for diagnosis and laboratory tests were collected for 260 patients diagnosed during the period of 2007-2010. Genotypes of Mycobacterium leprae were determined using STR analysis and SNP typing using DNA extracts from skin biopsies taken before starting treatment. GoogleMaps was used to localize patients. The patients ranging in age from 11 to 90 years included 137 males and 123 females. According to the classification of Ridley & Jopling observed a predominance of forms TT (39%) and BT (33%), followed by BB (19%), BL (5%), LL (3%) and I (1%). The city is primarily urban with 200,000 inhabitants and the patients could be assigned to 106 smaller units (villages). Neighborhoods of high endemicity encompassing adjoining villages could be detected. Of the 260 biopsy DNA samples analyzed across 17 STR loci, 15 loci were polymorphic (2-23 alleles), while the loci 6-3a and 21-3 were not. When we analyzed the genotypes of the SNP we observed that 77% (n = 200) were genotype 3: 16% (n = 41) genotype 4, 1.5% (n = 4) genotype 1 and 3, 8% (n = 10) 2 genotype. Two samples (0.76%) to differentiate genotype 1 and 2 the sequencing analysis was inconclusive and the other three samples (1.15%) did not amplification. Through phylogenetic analysis, we observed a particular population structure composed of some subgroups. Multiple STR strain types are found in each of the neighborhoods. Genetic diversity within and among the neighborhoods does not reveal a distinct population structure. Spatial clustering of patients is likely a consequence of socio-economic ...

Submitted by Mariane Bertolucci Casalenovo null (mary_bc14@hotmail.com) on 2017-09-14T00:20:08Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO FINAL.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-15T13:49:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 casalenovo_mb_me_bot.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-15T13:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 casalenovo_mb_me_bot.pdf: 10749096 bytes, checksum: 4412c078d6e18d64f519d7ac0952d26d (MD5) Previous issue date: 2017-08-03 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A infecção por Mycobacterium leprae (M. leprae) desencadeia alterações no status funcional das células de Schwann (SCs), responsáveis pela produção da bainha de mielina e homeostasia neural. Estudos prévios indicam que lesões nos nervos periféricos modulam a expressão de fatores-chave envolvidos na diferenciação e maturação das SCs. Na hanseníase, alterações funcionais nessas células podem estar envolvidas na patogênese do dano neural. O presente estudo buscou determinar a expressão dos fatores de transcrição KROX-20, SOX-10, JUN e do receptor p75NTR, envolvidos nos processos de diferenciação e maturação de SCs. Os dados foram obtidos a partir de cultura primária de SCs murinas expostas ao M. leprae durante sete e 14 dias, com diferentes multiplicidades de infecção (MOI 100:1, MOI 50:1). Os mesmos fatores foram avaliados in vivo, em nervos ciáticos de camundongos nude (NUFoxn1nu), após seis e nove meses de infecção. Comparando-se grupos experimentais em relação aos controles, nossos resultados em cultura de SCs demonstram redução significativa de KROX-20 e SOX-10, bem como elevação na frequência de células imunomarcadas por p75NTR. Paralelamente, nervos ciáticos de camundongos nude infectados por M. leprae apresentaram queda de KROX-20 e aumento de p75NTR, quando comparados aos animais não infectados. Em conjunto, nossos resultados corroboram achados prévios sobre a interferência de M. leprae na expressão de fatores-chave envolvidos na maturação celular, favorecendo a manutenção de fenótipo não mielinizante nas SCs, com possíveis implicações na reparação de nervos periféricos adultos. / Mycobacterium leprae infection (M. leprae) triggers changes in the functional status of Schwann cells (SCs), which are responsible for the production of myelin sheath and neural homeostasis. Previous studies indicate that peripheral nerve injury modulates the expression of key factors involved in the differentiation and maturation of SCs. In leprosy, functional changes in these cells may be involved in the pathogenesis of neural damage. The present study sought to determine the expression of the transcription factors KROX-20, SOX-10, JUN and the neurotrophic receptor p75NTR, involved in the differentiation and maturation processes of SCs. Data were obtained from primary murine SCs culture exposed to M. leprae for seven and 14 days, with different multiplicities of infection (MOI 100:1, MOI 50:1). The same factors were evaluated in vivo on sciatic nerve of nude mice (NU-Foxn1nu), after six and nine months of infection. By comparing experimental groups versus controls, our SC culture results demonstrate significant reduction of KROX-20 and SOX-10, as well as elevation in the frequency of cells immunolabelled by p75NTR. In parallel, sciatic nerves of nude mice infected with M. leprae showed a decrease in KROX-20 and an increase of p75NTR when compared to uninfected animals. Our results corroborate previous findings on M. leprae interference in the expression of key factors involved in cell maturation, favoring the maintenance of a non-myelinating phenotype in SCs, with possible implications for the repair of adult peripheral nerves.

Os contatos de pacientes com hansenÃase à um grupo de alto risco de desenvolver a doenÃa, logo a precocidade no diagnÃstico à uma importante ferramenta para o controle da enfermidade. NÃs investigamos a presenÃa de DNA de Mycobacterium leprae, atravÃs da ReaÃÃo em Cadeia Polimerase (PCR), na mucosa nasal e anticorpos anti-PGL1 sÃricos, IgG/IgM, e salivares, IgA/IgM, por meio do ensaio imunoenzimÃtico ligado à fase sÃlida (ELISA), em contatos intradomiciliares de pacientes com hansenÃase (n=135) e seus casos Ãndices. O estudo foi realizado em duas cidades endÃmicas para a doenÃa no CearÃ, Crato e MaracanaÃ. Uma boa correlaÃÃo entre os isotipos IgA e IgM salivares e IgG sÃrico foi observada quando comparou-se os contatos intradomiciliares e seus casos Ãndices (p<0,01, p<0,005 e p<0.0001, respectivamente). Entretanto, essa relaÃÃo nÃo foi observada para IgM sÃrico anti-PGL1 (p>0,05). Observou-se alta frequÃncia de IgM sÃrico anti-PGL1 no grupo de contatos negativos para IgG sÃrico anti-PGL1 (71/121, 58,6%). Dentre os contatos positivos para IgG sÃrico anti-PGL1, o nÃvel de anticorpos sÃricos IgM anti-PGL1 positivos tambÃm foi alto (10/14, 71,4%). Em relaÃÃo aos anticorpos salivares, contatos de pacientes com a forma clÃnica PB mostraram boa correlaÃÃo entre IgA e IgM (r = 0.54, p <0.0001); o mesmo foi verificado em contatos de pacientes com a forma clÃnica MB (r = 0.61, p <0.0001). Foi observado que dos contatos positivos para os anticorpos salivares anti-PGL1, 53,3% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos negativos. Por outro lado, dos contatos que foram negativos para os anticorpos salivares, 71,1% obtiveram nÃveis de anticorpos sÃricos positivos. O DNA de Mycobacterium leprae foi encontrado em swabs nasais de 9 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica MB da hansenÃase (10,6%) e em 3 contatos de pacientes portadores da forma clÃnica PB (6.0%). NÃs concluÃmos que anÃlises quantitativas de anticorpos sÃricos e salivares anti-PGL1 em contatos de pacientes com hansenÃase sÃo necessÃrias para montar estratÃgias de levantamento de infecÃÃes subclÃnicas da hansenÃase, a fim de prevenir o desenvolvimento da doenÃa. / Leprosy household contacts are group at high risk of developing the disease. We investigated the presence M. leprae DNA in nasal mucosa and anti-PGL1 serum IgG/IgM and salivary IgA/IgM antibodies from leprosy household contacts (n=135) in two endemic regions, Ceara, Brazil. Good correlation between serum IgM and IgG isotypes was observed both in MB and in PB leprosy household contacts (r = 0.39, p <0.0001). However, their levels were much different (p <0.0001). Among the contacts positive for serum IgM, 74 (87%) were found to be negative for serum IgG. In respect to the salivary antibodies, PB leprosy household contacts showed correlation between IgA and IgM (r = 0.60, p <0.0001); the same was observed in MB leprosy contacts (r = 0.77, p <0.0001). It was observed that in 75.3% of the leprosy household contacts who were positive to serum anti-PGL1, their salivary antibodies were negative. On the other hand, 50% of the leprosy household contact who were negative to serum anti-PGL1 antibodies, their salivary antibodies were positive. M. leprae DNA was found in nasal swab in 9 MB household leprosy contacts (10.6%) and in 3 PB leprosy contacts (6.0%). We concluded that quantitative analysis of serum and salivary anti-PGL1 in leprosy contacts is necessary for mounting strategies to survey subclinical leprosy infections in order to prevent development of the disease.

Yes / We examined six skeletons from mediaeval contexts from two sites in England for the presence of Mycobacterium leprae DNA, each of the skeletons displaying osteological indicators of leprosy. Polymerase chain reactions directed at the species-specific RLEP multicopy sequence produced positive results with three skeletons, these being among those with the clearest osteological signs of leprosy. Following in-solution hybridization capture, sufficient sequence reads were obtained to cover >70% of the M. leprae genomes from these three skeletons, with a mean read depth of 4–10×. Two skeletons from a mediaeval hospital in Chichester, UK, dating to the 14th–17th centuries AD, contained M. leprae strains of subtype 3I, which has previously been reported in mediaeval England. The third skeleton, from a churchyard cemetery at Raunds Furnells, UK, dating to the 10th to mid-12th centuries AD, carried subtype 3K, which has been recorded at 7th–13th century AD sites in Turkey, Hungary and Denmark, but not previously in Britain. We suggest that travellers to the Holy Land might have been responsible for the transmission of subtype 3K from southeast Europe to Britain. / Funded by a studentship awarded by Majlis Amanah Rakyat (MARA) to A.K. and by the University of Bradford and the University of Manchester.

INTRODUÇÃO: A hanseníase é uma doença infectocontagiosa granulomatosa crônica, causada por Mycobacterium leprae e representa ainda um problema de saúde pública no Brasil. Em média 30-40% dos doentes tem risco de desenvolver reações hansênicas, que são considerados estados de exacerbação da resposta imunológica do hospedeiro a antígenos M. leprae. Está bem descrita a importância de células T reguladoras (Tregs) em infecções bacterianas crônicas. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram aumento da proporção de Tregs in situ e em sangue periférico de pacientes multibacilares (mas não em paucibacilares), assim como diminuição da proporção de Tregs na reação tipo 2 (porém não na reação tipo 1), sugerindo a participação deste subtipo celular na imunopatogênese da hanseníase. Entretanto, a baixa frequência de Tregs tem dificultado o estudo da sua capacidade funcional. OBJETIVO: Estabelecer protocolo de expansão de Tregs funcionais em pacientes com hanseníase e, posteriormente, avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas. METODOLOGIA: Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram separadas e cultivadas, com anti-CD3 e anti-CD28, acrescidos de IL-2 e rapamicina, por 21 dias. Para avaliar a capacidade funcional das Tregs expandidas, realizou-se um ensaio de co-cultivo das Tregs expandidas e PBMCs autólogas (marcadas com CFSE). Utilizou-se diferentes proporções de Tregs:PBMCs (1:1, 1:2 e 1:5). A casuística foi composta por 29 indivíduos diagnosticados com hanseníase, divididos em quatro grupos, de acordo com a classificação de Ridley e Jopling. Além disso, coletou-se material de 6 indivíduos saudáveis, com a finalidade de caracterizar o pool celular do protocolo de expansão. Para isso, culturas de expansão de indivíduos saudáveis foram submetidas a dois protocolos distintos de purificação celular (beads magnéticas e cell sorting), além de imunofenotipagem das moléculas CD39, PD-1 e LAG3. RESULTADOS: Tregs dos pacientes multibacilar sem reação, nas proporções 1:2 e 1:5, e no grupo reacional tipo 2, na proporção 1:5, mostraram maior capacidade supressora, quando comparados aos grupos pacubacilar sem reação e reacional tipo 2, respectivamente. No grupo de indivíduos saudáveis não houve diferenças na capacidade supressora das Tregs obtidas por separação por beads magnéticas e Tregs obtidas por cell sorting, e não houve expressão significativa de células PD-1+ e LAG-3+ nas culturas de expansão. CONCLUSÃO: Em todos os indivíduos testados, independente da classificação clínica da hanseníase, o protocolo proposto resultou em uma expansão exponencial de uma linhagem de Tregs com atividade supressora, porém com sugestão preliminar de maior eficiência supressora das Tregs na forma MB (com ou sem reação), corroborando a correlação entre atividade supressora de Tregs e maior carga bacilar. Além disso, o protocolo com beads magnéticas se mostrou tão eficaz quanto o protocolo de purificação por cell sorting. A imunofenotipagem das Tregs expandidas de indivíduos saudáveis indicou que não havia número significativo de células exaustas ao fim de nosso protocolo, assim como não houve crescimento concomitante de células T reguladoras do tipo 1 na cultura de expansão / INTRODUCTION: Leprosy is a chronic granulomatous infectious disease caused by Mycobacterium leprae and a public health problem in Brazil. On average, 30-40% of patients are at risk of developing leprosy reactions, which are considered as states of exacerbation of the host\'s immune response to M. leprae antigens. The importance of regulatory T cells (Tregs) in chronic bacterial infections has been well described, but their role in leprosy remains unclear. Previous studies from our group have shown increased proportions of Tregs in situ and in peripheral blood of multibacillary patients (but not in paucibacillary patients), and decrease in the proportion of Tregs in type 2 reaction (but not type 1 reaction), reinforcing the role played by these cells in the immunopathogenesis of leprosy. However, the low numbers of Tregs preclude further studies on their functional capabilities. OBJECTIVE: To establish a protocol for expansion of functional Tregs in patients with leprosy and evaluate the functional capacity of the expanded Tregs. METHOD: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were separated and cultured under anti-CD3 and anti-CD28 stimulation, plus IL-2 and rapamycin for 21 days. To evaluate the functional capacity of the expanded Tregs, a co-culture assay of the expanded Tregs and autologous PBMCs (labeled with CFSE) was performed. Different ratios of Tregs: PBMCs (1: 1, 1: 2 and 1: 5) were used. The sample consisted of 29 individuals diagnosed with leprosy, divided into four groups, according to the Ridley and Jopling classification. In addition, samples from 6 healthy individuals were collected to characterize better the cellular characteristics of the expansion protocol. For this, cultures of healthy individuals PBMC were submitted to two distinct cell purification protocols (magnetic beads and cell sorting), as well as immunophenotyping of the molecules CD39, PD-1 and LAG3. RESULTS: Expanded Tregs from the multibacillary patients without reaction, at 1:2 and 1:5 ratios, and with type 2 reaction, at 1: 5 ratio, showed greater suppressive capacity that the respective paucibacillary groups. Tregs from healthy individuals obtained through magnetic beads separation and through cell sorting did not show differences in suppressor capacity, and there was no significant expression of PD-1 + and LAG-3 + on cells of the expansion cultures. CONCLUSION: In all individuals tested, irrespective of the leprosy classification, the proposed protocol resulted in an exponential expansion of Tregs with suppressive capacity; however, preliminary evidence indicated stronger suppressor activity of the Tregs from multibacillary patients (with or without reaction), suggesting a direct correlation between Tregs activity and bacillary load in leprosy. In addition, our protocol with magnetic beads proved to be as effective as the cell sorting protocol. Immunophenotyping of expanded Tregs from healthy subjects revealed that there was no significant number of exhausted cells at the end of our protocol, nor there was the concomitant outgrowth of type 1 regulatory T cells in the expansion protocol