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Detecção do Mycobacterium tuberculosis em imagens de baciloscopia de campo claro utilizando redes neurais convolutivasLópez, Yadini Pérez, 92-98231-6465 13 April 2018 (has links)
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Previous issue date: 2018-04-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Tuberculosis (TB) is a disease caused by a slow-growing bacterium named Mycobacterium tuberculosis (MT). Since 2000 has been included among the top 10 leading causes of death worldwide. In 2015, Brazil ranked eighteenth in TB incidence, representing 9% and 33% of the estimated cases worldwide and for the Americas respectively. Light field smear microscopy is the most commonly used exam in developing countries for diagnosis and follow-up of the disease. Since 2008, several researches have been developed focused on TB bacillus detection, aiming the automation of light field smear microscopy. These studies used datasets with different amounts of images, explored different color aspects of bacilli, and applied Digital Image Processing and / or Machine Learning techniques, and more recently, Deep Learning using Grayscale images. However, Deep Learning techniques have not been explored using a robust smear microscopy image dataset that reflect real conditions of smear microscopy exams. This work presents a method for automatic detection of TB bacillus using Convolutional Neural Networks (CNN) using a dataset of images taken from 2 patients in RGB, R-G and Grayscale color formats. To reach the proposed goal, a patch dataset containing bacilli (positive patches) and without bacilli (negative patches) was generated. This patch dataset was used for training three different RNC architectures. Then, Non-maximum Suppression (NMS) algorithm was applied using CNN models and complete smear images for bacillus detection. Best results in the patch classification stage were obtained using R-G and RGB images and two CNN models, achieving an accuracy of 99% in both cases. At final stage, Bacilli detection in full smear images, best results were achieved using RGB images reaching a Precision of 56,82%, Recall of 86,15% and F1-score of 68,47%. / A Tuberculose (TB) é uma doença causada por uma bactéria de crescimento lento, Mycobacterium tuberculosis (MT) e desde o ano 2000 tem sido incluída entre as dez causas principais de morte a nível mundial. No ano 2015 o Brasil ocupou a 18ª posição em incidência de tuberculose, representando 9% dos casos estimados no mundo, e 33% dos estimados para as Américas. O exame de baciloscopia de campo claro é o mais utilizado em países em desenvolvimento para o diagnóstico e acompanhamento da doença. Desde o ano de 2008 têm sido desenvolvidos trabalhos pela comunidade científica focados na detecção do bacilo da TB visando a automatização da baciloscopia de campo claro. Esses estudos utilizaram bases de dados com diferentes quantidades de imagens, exploraram aspectos de cor dos bacilos e aplicaram técnicas de Processamento Digital de Imagens e/ou Aprendizado de Máquina, e mais recentemente Aprendizado de Máquina Profundo. Entretanto, verificou-se que técnicas de Aprendizado de Máquina Profundo não têm sido exploradas utilizando bases de dados de imagens de baciloscopia robustas que refletem as condições reais dos exames de baciloscopia de campo claro. O presente trabalho visa o desenvolvimento de um método de detecção automática do bacilo da TB mediante a utilização de Redes Neurais Convolutivas (RNC), utilizando conjuntos de imagens baciloscópicas de 2 pacientes nos formatos de cor RGB, R-G e Escala de Cinza. Para atingir o objetivo proposto, foi gerada uma base de dados de patches contendo bacilos (positivos) e patches sem bacilos (negativos), os quais foram utilizados no treinamento de três arquiteturas diferentes de RNC. Posteriormente, foi aplicado o algoritmo Non-maximum Suppression utilizando imagens completas de baciloscopia para detectar cada bacilo. Os melhores resultados na etapa de classificação de patches foram obtidos utilizando as imagens de baciloscopia R-G e RGB e dois modelos RNC de duas e três camadas convolutivas, alcançando uma acurácia de 99%. Na etapa final de detecção dos bacilos nas imagens completas de baciloscopia os melhores resultados foram alcançados utilizando as imagens no formato RGB atingindo um Precision de 56,82%, um Recall de 86,15% e um F1-score de 68,47%.
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Fatores associados ao diagnÃstico de tuberculose pulmonar entre suspeitos da doenÃa na rotina de unidades de saÃde de Fortaleza, CE / Factors associated with the diagnosis of pulmonary tuberculosis among suspects of disease in routine health units in Fortaleza, CECid Carlos Soares de AlcÃntara 16 August 2010 (has links)
A Tuberculose (Tb) à uma doenÃa que tem desafiado a humanidade desde a antiguidade. Acreditava-se que com as novas tecnologias, as doenÃas infecto-contagiosas seriam facilmente controladas e banidas. A realidade, porÃm tem-se apresentado de modo diferente; apesar dos avanÃos no conhecimento da tuberculose e tecnologia disponÃvel para seu controle, o quadro atual encontra-se muito distante das metas estabelecidas pelos governos. à essencial o estudo dos fatores associados à tuberculose pulmonar, uma vez que eles estÃo presentes na primo-infeccÃÃo, na recidiva e na Tb pulmonar multi-resistente. O conhecimento de dados relacionados a tuberculose na populaÃÃo em geral e em grupos de risco especÃficos para Tb sÃo elementos fundamentais para avaliar a realidade epidemiolÃgica do nosso meio possibilitando uma organizaÃÃo adequada das atividades preventivas e assistenciais. OBJETIVO: Investigar os fatores associados ao diagnÃstico de Tb, a freqÃÃncia e as caracterÃsticas da tuberculose pulmonar entre sintomÃticos respiratÃrios atendidos na rotina de trÃs serviÃos de saÃde de Fortaleza. MÃTODOS: Estudo transversal de natureza quantitativa realizado por meio da aplicaÃÃo de um questionÃrio em pacientes atendidos em trÃs unidades de saÃde de Fortaleza. Os entrevistados foram divididos em pacientes com desfecho de tuberculose e desfecho nÃo tuberculose. Foi estudado a influÃncia dos fatores sÃcio demogrÃficos, condiÃÃes de moradia, fatores comportamentais, antecedentes relacionados a infecÃÃo por Tb e variÃveis clÃnicas para o desfecho tuberculose. RESULTADOS: A freqÃÃncia de Tb pulmonar entre sintomÃticos respiratÃrios da amostra estudada foi 41,2%, mas esse dados nÃo podem ser extrapolados, os fatores sÃcio demogrÃficos e clÃnicos independentes associados ao desfecho Tb foram tosse, febre e perda de peso considerando o nÃvel de seis por cento de significÃncia. O principal mÃtodo auxiliar utilizado para diagnÃstico de Tb presumida nos pacientes das unidades estudadas em Fortaleza foi a radiografia de tÃrax. O perfil de sensibilidade de Mycobacterium tuberculosis mostrou 8,82 por cento de cepas MDR e sensibilidade a isoniazida, rifampicina, etambutol e streptomicina de 88,23 por cento nas amostras realizadas, nÃo podendo ser extrapolado. Se excluÃdos todos os TSA provenientes do hospital de Messejana e considerado somente os TSA dos postos de saÃde, o valor da resistÃncia reduz para um caso de MDR para 28 TSA realizados representando 3,6% da amostra, a maioria dos pacientes com Tb pulmonar tiveram BAAR positivo somente uma cruz, o que pode significar tempo de doenÃa nÃo tÃo longo. / Tuberculosis (TB) is a disease that has challenged mankind since antiquity. It was believed that with the new technology, infectious diseases would be easily tracked and banned. The reality has been presented differently, despite advances in knowledge of tuberculosis and technology available for its control, the current picture is far from the targets set by governments. It is essential to the study of factors associated with pulmonary tuberculosis, since they are present in the prime-infeccÃÃo in relapse and multi-drug resistant pulmonary TB. Knowledge of data related to TB in the general population and specific groups at risk for TB are crucial to assess the epidemiological reality of our environment allowing proper organization of prevention and care activities. OBJECTIVE: To investigate factors associated with the diagnosis of TB, the frequency and characteristics of pulmonary tuberculosis with respiratory symptoms in three routine health services in Fortaleza. Cross-sectional study of quantitative accomplished through the application of a questionnaire in patients from three health units of Fortaleza. Respondents were divided on outcome of patients with tuberculosis and non tuberculosis outcome. We studied the influence of sociodemographic factors, housing conditions, behavioral factors, antecedents related to TB infection and clinical outcome for tuberculosis. RESULTS: The rate of pulmonary TB patients with respiratory symptoms among the study sample was 41.2%, but this data can not be extrapolated, the socio demographic and clinical outcome independently associated with TB were cough, fever and weight loss considering the level of six percent of significance. The main method used to assist diagnosis of TB in patients suspected of units studied in Fortaleza was the chest radiograph. The susceptibility profile of Mycobacterium tuberculosis showed 8.82 percent of MDR strains and sensitivity to isoniazid, rifampin, ethambutol and streptomycin from 88.23 percent in the samples taken and can not be extrapolated. If all TSA excluded from the hospital and found only Messejana TSA health posts, the resistance value reduces to a case of MDR 28 to TSA made, representing 3.6% of the sample, most patients with pulmonary TB had AFB positive only a cross, which may mean duration of disease not so long.
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Perfil transcriptômico comparativo de macrófagos em cultura, infectados com isolados clínicos de Mycobacterium tuberculosis com diferentes perfis de resistência a quimioterápicos / Comparative transcriptomics profile of macrophages in culture, infected with clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis with different profiles of resistance to chemotherapeuticGabriela Guimarães Sousa Leite 11 June 2014 (has links)
A tuberculose ainda é pontuada como uma doença de impacto mundial, sendo considerada desde 1993 um problema de saúde pública global. Uma das grandes preocupações é a contínua prevalência de cepas da Mycobacterium tuberculosis multidroga resistentes, especialmente o genótipo hipervirulento W-Beijing. Acredita-se que este genótipo apresenta alguma vantagem seletiva em relação a outros genótipos da M. tuberculosis, além de estar associado à falha terapêutica, tuberculose extrapulmonar, resistência à vacinação pela BCG e acentuada capacidade de disseminação. Estas cepas apresentam variável capacidade de sobrevivência dentro de macrófagos e do granuloma, modulando vias metabólicas específicas que culminam no escape do sistema imunológico e sucesso na infecção. Buscando entender esta vantagem seletiva e capacidade de persistência na infecção, este estudo teve como objetivo analisar e comparar o perfil transcriptômico de macrófagos infectados com as cepas da M. tuberculosis, W-Beijing 1471 e H37Rv. Os RNAs mensageiros dos macrófagos infectados foram sequenciados em plataforma HiScan Genome Analyzer Illumina. Foram gerados aproximadamente 30 milhões de sequências por amostra, em leituras single reads, com mais de 70% de sequências com valores de score Q de qualidade superior ou igual a 30. Foram mapeados e analisados 35.581 transcritos. Em média, 63% dos genes não apresentaram diferenças nos valores de expressões, 19% tiveram suas expressões reduzidas e 18% dos genes foram classificados como mais expressos, para todas as amostras de macrófagos sequenciadas. Após as análises terciárias e validação por PCR em tempo real, as amostras infectadas com a cepa W-Beijing 1471 apresentaram um aumento nas expressões de IFNs da classe I (p<0,001) e aumento exacerbado de TNF-alfa (p<0,001), comparativamente ao controle e as amostras infectadas com a cepa padrão H37Rv. Aditivamente foi observado um aumento nas expressões de duas quinases, RIPK1 e RIPK3 e de moléculas envolvidas na indução e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS), que em infecções por bactérias intracelulares, estão correlacionadas com a morte de macrófagos por necroptose. A cepa hipervirulenta da M. tuberculosis, W-Beijing 1471, apresentou reduzida persistência intramacrofágica e induziu morte precoce dos macrófagos ao quinto dia de infecção. A morte observada nos macrófagos foi associada a ativação de IFNs da classe I/TNF-α/RIPK1/RIPK3 e ROS, indicando necroptose. Ainda, foi observado um aumento na expressão do receptor TLR3 nas amostras infectadas com a cepa W-Beijing, comparativamente as amostras controles e infectadas com a cepa H37Rv. É provável que a ativação inicial dos IFNs da classe I tenha ocorrido via TLR3 através do reconhecimento de dsRNAs da M. tuberculosis. / Since 1993 the tuberculosis is considered as a disease of worldwide impact and a problem of public health. A major concern is the continuing prevalence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains, especially the hypervirulent W - Beijing genotype. It is believed that this genotype has a selective advantage over other genotypes of M. tuberculosis and has being associated with treatment failure, extrapulmonary tuberculosis, resistance to BCG vaccination and marked ability to spread. These strains have varying ability to survive within macrophages and granuloma, modulating specific metabolic pathways that culminate in the escape of the immune system response. To understand this selective advantage and ability to persist in infection, this study aimed to analyze and compare the transcriptomic profile of macrophages infected with strains of M. tuberculosis W - Beijing 1471 and H37Rv. The mRNAs of infected macrophages were sequenced in HiScan Illumina Genome Analyzer platform. Were generated approximately 30 million sequences per sample, in single-reads readings. More than 70 % of sequences had values of Q score superior or equal to 30. Were mapped and analyzed 35,581 transcripts. On average, 63% of the genes showed no differences in the expressions, 19% were downregulated and 18% were upregulated, for all samples sequenced macrophages. After tertiary analysis and validation by real-time PCR, samples infected with the strain W -Beijing in 1471 showed an increase in expression of IFN class I (p <0.001) and exacerbated increase of TNF- alpha (p < 0.001) when compared to the control samples and those infected with standard strain H37Rv. Additively was observed an increase in expressions of the two kinases RIPK1 and RIPK3 and molecules involved in the induction and control of reactive oxygen species (ROS). In infections by intracellular bacteria, activation of RIPK1, RIPK3, ROS and TNF-α, are correlated with death of macrophages by necroptosis. The hypervirulent M. tuberculosis W - Beijing 1471 strain showed reduced persistence inside macrophage and induced early death of macrophages in the fifth day of infection. The death observed in macrophages was associated with activation of IFNs class I/TNF-α/RIPK1/RIPK3 and ROS, indicating necroptosis. Also was observed an increase in the expression of TLR3 receptor in infected samples with W-Beijing 1471 strain compared to controls and those infected with H37Rv strain. Probably the initial activation of IFNs class I occurred by TLR3 through the recognition of M. tuberculosis dsRNAs.
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Sensibilidade de bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis as drogas anti tuberculosas avaliadas por duas metodologias em centro terciário de referência ambulatorial. / Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to antituberculous drugs by traditional and automated means in diagnosis and treatment of people with tuberculosis.Elisabete Aparecida de Almeida 10 December 2009 (has links)
Avaliou-se a aplicação rotineira de um método automatizado TSMA em comparação ao convencional TSMP na determinação da sensibilidade a drogas anti-micobacterianas de 126 isolados clínicos de bactérias do complexo M. tuberculosis. Os isolados clínicos foram divididos em: sem tratamento (NT), tratado anteriormente (RT) e multirresistentes (MDR). A concordância entre TSMP e TSMA, para Rifampicina no NT, foi de 98.3%, p=1.000 e Kappa=0.659. No RT, foi de 94.3%,p=0.625 e Kappa=0.639, no MR, foi de 96.6%, p=0.625 e Kappa=0.651. Para Hidrazida, no NT, foi de 88.5%, p=0.125 e Kappa=0.408 no RT foram de 88.6%, p=0.625 e Kappa=0.645 no de pacientes MR, foi de 86,7%, p=0.625 e Kappa=0.053. Para Estreptomicina no NT, foi de 93.5%, p=0.125 e Kappa=0.635. No RT, foi de 79.4%, p=0.016 e KAPPA=0.296 no MR, foi de 76,6%, p=0.453 e Kappa=0.533. Para Etambutol, no NT, foi de 93.4%, p=0.125 e Kappa=0.315, no RT foi de 94.3%, p=0.500 e Kappa=0.478. No MR, foi de 72.4%, p=0.70ª e Kappa=0.455. A metodologia automatizada mostrou-se mais rápida. / We evaluated the routinely application of an automated system(STAM) and the conventional method (STPM), used to determine the profile of sensitivity to antimycobacterial drugs of 126 clinical isolates of the complex M. tuberculosis. Clinical isolates was group divided into: without treatment (WT), previously treated (PT) and multidrug resistant (MDR).Concordant result between STPM and STAM, for Rifampin, in WT, was 98.3%, p=1.000 and Kappa=0.659. PT, was 94.3%, p=0.625 and Kappa=0.639; in MDR, was 96.6%, p=0.625 and Kappa=0.651. For Hidrazin, WT, was 88.5%, p=0.125 and Kappa=0.408; in PT, 88.6%, p=0.625 and Kappa=0.645; for MDR, 86.7%, p=0.625 and Kappa=0.053. For Streptomycin, PT was 93.5%, p=0.125 and Kappa=0.635. In PT, was 79,5%, p=0.016 and Kappa=0.296; in MDR, 76.6%, p=0.453 and Kappa=0.533. For Ethambutol, WT was 93.4%, p=0.125; in PT 94.3%, p=0.500 and Kappa=0.478. MDR was 72.4%, p=0.70 and kappa=0.455. Evaluation of mycobacterial sensitivity was faster in the automated method when compared with the conventional method.
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Estudo da resposta imunológica de anticorpos IgG, IgM e IgA, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e avidez de IgG, por Western Blotting, em amostras de soros de pacientes com tuberculose pulmonar e comparação de resultados com métodos microbiológicos e dosagem de interferon-gama / Study of the immune response of IgG, IgM and IgA, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and IgG avidity by Western blotting in serum samples collected from patients with pulmonary tuberculosis and comparing results with microbiological methods and gamma interferon determinationAlvina Clara Felix 29 April 2011 (has links)
Apesar das recomendações da Organização Mundial da Saúde, na reunião ministerial realizada em Amsterdam, Holanda em 2000, a tuberculose continua em ritmo crescente, atingindo principalmente os países em desenvolvimento e pessoas com o sistema imunológico comprometido, principalmente as infectadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida. Os métodos utilizados no diagnóstico continuam os mesmos utilizados por muitos anos, cujas limitações impedem a ação rápida dos programas de saúde que buscam interromper a cadeia de transmissão da doença. Continuando uma linha de pesquisa do Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do IMTSP, utilizando o método do Western Blotting, procuramos neste trabalho ampliar os conhecimentos da resposta imunológica de anticorpos em pacientes com tuberculose pulmonar, clinica e laboratorialmente definida, avaliando a participação das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e a avidez da imunoglobulina IgG em amostras de soros colhidas no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que o melhor marcador imunológico foi a imunoglobulina IgG por apresentar melhor desempenho diagnóstico quando comparada com os resultados dos métodos microbiológicos e de dosagem de interferon gama, Quantiferon TB Gold. As frações protéicas que apresentaram melhor desempenho diagnóstico foram as de 38 e 30 KDa / Despite the recommendations of the World Health Organization, during the Ministerial meeting held in Amsterdam, Holland in 2000, tuberculosis continues at an important increasing rate, affecting mostly developing countries and people with severe compromised immune systems, especially those infected with human acquired immunodeficiency virus. The methods used for diagnosis are the same used for many years, whose limitations prevent the rapid action of countries health programs that seek to stop the chain of disease transmission. Continuing a line of research of the Laboratory of Seroepidemiology and Immunobiology of IMTSP using the method of Western blotting, in this study we tried to broaden the knowledge of the immune response of antibodies in patients with pulmonary tuberculosis, clinical and laboratory defined by evaluating the participation of IgG, IgA and IgM, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and immunoglobulin IgG avidity in serum samples collected in the beginning and end of treatment. Our results showed that the immunoglobulin IgG was best immunological marker when compared with the results of microbiological methods and determination of interferon gamma, QuantiFERON TB Gold. The proteins fractions that showed better diagnosis performance were 38 and 30 KDa
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Avaliação da participação de mediadores lipídicos nas infecções experimentais induzidas por diferentes isolados de Mycobacterium tuberculosis de humanos / Evaluation of lipid mediators participation in the experimental infections induced by different isolates of Mycobacterium tuberculosis from human.Elyara Maria Soares 13 September 2013 (has links)
Os mecanismos que conferem resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à destruição pelo hospedeiro, além da sua capacidade em permanecer e/ou multiplicar-se no interior das células fagocitárias são ainda pouco compreendidos. Nosso grupo de pesquisa tem contribuído para o entendimento do papel dos mediadores lipídicos, que incluem prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) na tuberculose. PGs inibem a resposta imune celular TH1, a produção de citocinas e a fagocitose, e assim facilita a infecção. LTs estão envolvidos no recrutamento de leucócitos, e na modulação da síntese de citocinas, no aumento da fagocitose e dos mecanismos microbicidas, e assim contribui para a eliminação da micobactéria. Neste projeto, avaliamos in vivo e in vitro a produção dos mediadores lipídicos induzidos por cepas de Mtb isolados de pacientes com tuberculose ativa. Demonstramos neste trabalho que macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV009 levam a maior produção de TNF- e nitrito, do que aqueles infectados com a cepa SV068. Em contraste, macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV068 induzem a produção de muito mais LTB4, quando comparado aos bacilos da cepa SV009. Obtivemos maior recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC) de macrófagos alveolares tratados com MK886 e infectados com bacilos da cepa SV068; enquanto que mais UFCs foram recuperadas após o tratamento com ácido caféico e infecção com a cepa SV009. Com relação a formação de corpúsculos lipídicos (CLs), observamos um maior número destes quando macrófagos alveolares foram infectados com bacilos da cepa SV068. Ainda, observamos diminuição de CLs quando tratados com MK886 ou ácido caféico. Os bacilos da cepa SV068 foram mais fagocitados, mas os macrófagos não foram muito eficazes na atividade microbicida dos mesmos. Nos experimentos in vivo vimos que camundongos balb/c infectados com a cepa SV068 morrem mais e o tratamento com MK886 parcialmente os protege e a mortalidade não está relacionada com a maior carga bacilar no pulmão ou baço. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos induzido pela infecção especialmente após infecção com os bacilos da cepa SV068, sendo que o tratamento com MK886 inibe significativamente o recrutamento quando comparado à infecção com os bacilos da cepa SV009. Células mononucleares também foram recrutadas e permaneceram aumentadas até o final do período observado, sem muitas diferenças significativas quando comparamos a infecção com os isolados SV009 e SV068. A produção de nitrito também encontrou-se elevada em animais infectados com bacilos da cepa SV068. A análise histopatológica dos pulmões dos animais infectados mostrou intensa reação inflamatória com maior comprometimento do parênquima pulmonar dos camundongos infectados bacilos da cepa SV068, com intensa deposição de colágeno e multiplicação bacilar. Encontramos diferenças significativas em relação à producão de citocinas IL-6, IL-10, IL-1, IFN-, TNF- and IL-12 após infecção de 30 e 60 dias com as cepas SV009 e SV068. Também mostramos que há diferenças na produção de LTB4 e PGE2 após 30 e 60 dias de infecção com as cepas SV009 e SV068 em células do camundongos balb/c. Experimentos com animais 129 e 5LO-/- infectados com as duas cepas também foram realizados, e vimos que os animais 5LO-/- são mais suscetíveis à infecção especialmente quando infectados com a cepa SV068. Sugerimos que as cepas são diferentes, mas dependentes de um conjunto de fatores, e nossos dados sugerem que dentre estes mecanismos a produção de TNF- e também de mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2) estão envolvidos. / The mechanisms that confer resistance to Mycobacterium tuberculosis (Mtb) for destruction by the host, in addition to its ability to retain and/or multiply within phagocytic cells are still poorly understood. Our research group has contributed to the understanding of the role of lipid mediators, including prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) in tuberculosis. PGs inhibit Th1 cell immune response, cytokine production and phagocytosis, thus facilitating the infection. LTs are involved in the leukocytes recruitment, and modulation of cytokine synthesis, phagocytosis and microbicidal mechanisms enhancement, and contribute to the elimination of the mycobacteria. In this project, we evaluated in vivo and in vitro the lipid mediators production induced by Mtb strains isolated from patients with active tuberculosis. We demonstrated in this study that alveolar macrophages infected with bacilli from SV009 strain lead to an increase of TNF- production and nitrite, than those infected with the strain SV068. In contrast, alveolar macrophages infected with bacilli from SV068 strain induced more LTB4 production when compared to SV009 infection. We obtained higher recovery colony forming units (CFU) of alveolar macrophages treated with MK886 and infected with bacilli from SV068 strain; while more CFUs were recovered after treatment with caffeic acid and infection with bacilli from SV009 strain. Regarding the lipid bodies (LBs) formation, we observed a greater number of these structures, when alveolar macrophages were infected with bacilli from SV068 strain. Still, we observed a decrease of LBs when the macrophages were treated with MK886 and caffeic acid. Bacilli from SV068 strain were more phagocytosed, but macrophages were not very effective in the microbicidal activity. In the in vivo experiments we found that mice infected with SV068 strain die more than the other and MK886 treatment partially protects the mice, besides, the mortality is not related to the higher bacterial load in the lung or spleen. There was an increase in neutrophil recruitment induced after infection, especially after infection with SV068 strain, and treatment with MK886 significantly inhibits recruitment when compared to infection with SV009 strain. Mononuclear cells were also recruited and remained increased until the end of the observed period, without many significant differences when comparing infection with SV009 and SV068 strains. The nitrite production was also found greater in animals infected with bacilli from SV068 strain. Histopathological analysis of the infected mice lungs showed an intense inflammatory reaction with greater impairment of the mice lungs when infected with bacilli from SV068 strain with an intense collagen deposition and multiplication of bacilli. We suggest that the SV068 strain is more virulent and participates of the immune response by lipid mediators dependent mechanisms.
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ProGen AP: um Pipeline para Anotação Proteogenômica de Mycobaterium tuberculosis visando o Descobrimento de Genes com Potencial para Intervenção Biotecnológica. / ProGen AP: a Pipeline for Proteogenomic Annotation of Mycobacterium tuberculosis Seeking the Discovery of Potential Genes for Biotechnological Intervention.Beatriz Jeronimo Pinto 03 May 2013 (has links)
Anotação proteogenômica é uma abordagem que une a análise proteômica com a anotação genômica. O intuito de tal abordagem é prover uma anotação mais detalhada ao gene. Intuito esse, que nem sempre é possível quando se trata apenas de genes, uma vez que produtos gênicos, com funções importantes preditas, somente passam a ter papel na fisiologia do organismo quando expressos e traduzidos. Com todo o avanço atual de estudos na área proteogenômica, a geração de dados tem crescido de modo exponencial e, com esse crescimento, nota-se a necessidade cada vez maior da criação de sistemas capazes de processar, armazenar e gerenciar essas novas informações produzidas. Assim, é descrito nesse trabalho o desenvolvimento do ProGen AP , sendo constituído de uma interface web construída em HTML/PHP5, um banco de dados cujo SGBD é o mySQL e de módulos de processamento de dados proteômicos, neste caso o LabKey (com o core Xtandem!) e o QuickMod. Todos os módulos são open source e comunicam entre si através de scripts PERL. Nesse sistema, o pesquisador fornece dados de experimentos proteômicos e o sistema, então, os processa e retorna ao usuário informações sobre o gene expresso, a localização dos peptídeos dentro do gene aos quais pertencem e, ainda, informações quantitativas sobre o peptídeo e a proteína identificados. Além disso, o uso de um processamento esquematizado reduz a possibilidade de erro de entrada/saída de dados nos módulos intermediários do processamento. Aqui, o ProGen AP foi aplicado no estudo proteômico do Mycobacterium tuberculosis (MTb). Na literatura, o genoma do MTb cepa H37Rv contém apenas 4062 open reading frames (ORFs) preditos e o complemento funcional desse genoma, o proteoma, ainda não está totalmente elucidado. A análise do proteoma do MTb, com o uso do ProGen AP, resultou em uma lista total de 154.982 identificações de peptídeos, representando um total de 147.334 peptídeos únicos. Até o momento, foram identificadas 2.369 proteínas, cobrindo aproximadamente 58% de todo o genoma do MTB. É importante ressaltar que, dentre todas as proteínas identificadas até o momento, a maioria delas está anotada como proteinas hipotéticas em seu genoma, e, por consequência, os resultados obtidos nesse projeto confirmam e validam a existência de tais produtos gênicos. Além disso, 567 peptídeos foram identificados como N-terminal e 1229 como C-terminal, o que indica a correta predição do início e do término da tradução de tais genes. Todos esses resultados positivos confirmam que a abordagem utilizada no ProGen AP é eficiente e pode ser usada em vários outros organismos de interesse do pesquisador. / Proteogenomic annotation is an approach that combines proteomic analysis and genomic annotation. The aim of this approach is to provide a more detailed annotation, which is not possible in most of the times when dealing mostly with genes, once that genomic products, with important predicted functions are only important in the organism physiology when they are expressed and translated. There have been occurring several advances in proteogenomic studies and the generation of new data sets has been growing in an exponential wave. With all this growth, the creation of systems able to storing, processing and analyzing all the new knowledge produced is eminent. This study presents the deployment of ProGen AP, a system built with a HTML/PHP5 web interface, a mySQL data management system to store the data and two processing modules (LabKey, with core X!Tandem and QuickMod). In this system, the researcher provides a data set from a proteomic experiment and then the system processes it and returns to the researcher information about the expressed gene, the peptides localization inside the gene that they belong and, also, quantitative information about the peptide and the protein that were identified. Also, the use of an automated pipeline reduces the possibility of making mistakes in input/output of the data when using the intermediate modules. Here, the ProGen AP were applied to perform a proteogenomic annotation of Mycobacterium tuberculosis (MTb). In literature, the MTb genome, strain H37RV, have only 4062 predicted open reading frames (ORFs) and the functional complement of this genome is not completely known. The MTb analysis using ProGen AP, resulted in a list of 154.982 peptides identification, representing a total of 147.334 single peptides. Until now, were identified 2.369 proteins, covering nearly of 58% of the whole MTb genome. Is very important to highlight that, among all the identified proteins until now, most of them are annotated as hypothetical proteins in the MTb genome, so can be affirmed that the results of this project can confirm and validate the existence of all these genomic products. Beside this, 567 peptides were identified as been an N-terminal peptide and 1229 were identified as been a C-terminal, this fact indicates that the prediction of the beginning and the end of translation of those genes are right. All these positive results corroborate that the approach utilized in the ProGen AP is efficient and can be used in studies of other organisms.
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Papel da proteína HspX do Mycobacterium tuberculosis na regulação de genes relacionados à adaptação morfológica de micobactérias ao período de dormência, utilizando Mycobacterium smegmatis como organismo modelo / The role of HspX protein from Mycobacterium tuberculosis in regulation of genes involved with morphological adaptation to mycobacterial dormancy, with Mycobacterium smegmatis as model organism.Gisele Medeiros Bastos 22 March 2013 (has links)
A manutenção da infecção latente pelo M. tuberculosis (TBIL) pode ser atribuída à sua capacidade de sobreviver durante anos no organismo humano em um estado não replicativo (dormente). A proteína HspX do M. tuberculosis, induzida sob condições de hipóxia, está fortemente associada com a manutenção da viabilidade do bacilo na TBIL. O presente estudo tem como objetivo, verificar se a superexpressão da proteína HspX altera a expressão de genes envolvidos com a síntese de componentes da parede celular, replicação do DNA e divisão celular de bacilos, assim como, na expressão de genes envolvidos com a resposta imune inata em macrófagos infectados com esses bacilos. O gene hspX foi amplificado pela PCR a partir do DNA do M. tuberculosis H37Rv, clonado no vetor de expressão pFPCA1GFP, e a proteína HspX expressa em M. smegmatis mc2155. As bactérias, nas quais, a presença da proteína recombinante foi confirmada por Western Blot, foram utilizadas, para a análise de expressão gênica tanto em bactérias quanto em macrófagos infectados. O estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a RT-qPCR. Quando comparado aos controles, as bactérias que expressavam a proteína HspX apresentaram uma redução na expressão de genes de replicação do DNA e divisão celular, que foi acompanhado por uma tendência a filamentação das células e uma redução no tamanho das colônias. Além disso, nos macrófagos infectados com a bactéria expressando a proteína HspX, houve um aumento tanto da expressão do mRNA quanto da secreção de IL-1b, citocina importante para estabilização do granuloma, e uma redução na expressão de IRGM, gene relacionado com o processo autofágico, importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra bactérias intracelulares. Portanto, em conjunto, essas alterações de expressão gênica, em consequência da presença da proteína HspX sugerem uma contribuição, direta ou indireta, dessa proteína para a adaptação morfológica e metabólica da bactéria dormente durante a TBIL, e consequentemente, para a resposta imune inata dos macrófagos infectados favorecendo a viabilidade intracelular dessas bactérias. / The maintenance of Mycobacterium tuberculosis infection latent (TBIL) may be attributed to its ability to persist for years in the host in a non-replicative state (dormant). The HspX protein from M. tuberculosis, induced under hypoxic, is strongly associated with maintaining the bacillus viability in TBIL. This study aims to determine if HspX overexpression chances the expression of genes involved in the synthesis of cell wall components, DNA replication and cell division of bacilli, as well as, the expression of genes involved in innate immune response of macrophages infected. The gene hspX was amplified by PCR from DNA of M. tuberculosis H37Rv, and cloned into the expression vector pFPCA1GFP. The HspX was expressed in M. smegmatis mc2155 and the recombinant protein was confirmed by Western blot. The bacterias expressing HspX were used for gene expression analysis both in bacteria and in infected macrophages by RT-PCRq. In bacterias expressing HspX, it was observed a reduction in expression of genes involved in DNA replication and cell division, and with cells more filamentous and smaller colonies, compared with controls. In addition, in macrophages infected with bacillus expressing HspX, there was an increase in both mRNA expression and secretion of IL-1b, an important cytokine for granuloma stability, and a reduction in expression of IRGM, an autophagic gene, important for host defense mechanism against intracellular bacteria. Together, these results suggest a direct or indirect contribution of HspX protein for metabolic and morphological adaptation of dormant bacteria in TBIL, and for the innate immune response in infected macrophages, improving the bacteria intracellular viability.
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Résistance de Mycobacterium tuberculosis aux fluoroquinolones : histoire naturelle et diagnostic de la résistance / Mycobacterium tuberculosis fluoroquinolone resistance : natural history and diagnosis of resistanceBernard, Christine 10 October 2016 (has links)
La résistance aux fluoroquinolones (FQ) est le principal facteur d'aggravation du pronostic de la tuberculose multi-résistante. Il apparait donc essentiel de mieux comprendre le développement de la résistance aux FQ afin d'améliorer les outils permettant une détection précoce de cette résistance. Nous avons (i) évalué les performances du séquençage des gènes gyrA et gyrB dans la détection de la résistance aux FQ grâce à une étude prospective menée au CNR-MyRMA ; (ii) étudié l'histoire naturelle de l'émergence de la résistance aux FQ in vivo dans un modèle murin de tuberculose et (iii) identifié de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ par génomique comparative. Nous avons montré que la méthode des proportions, désignée comme méthode de référence, n'est pas performante pour la détection des bas niveaux de résistance aux FQ et que ni les méthodes génotypiques ni les méthodes phénotypiques, ne permettent le diagnostic de la résistance hétérogène aux FQ. Une stratégie combinée reposant sur une détection phénotypique d'une proportion anormale de bactéries résistantes et une caractérisation génotypique de ces bactéries résistantes permettrait d'améliorer la détection de cette résistance hétérogène. Nous avons identifié des pistes pour de nouveaux mécanismes de résistance aux FQ. Il pourrait s'agir de mécanismes responsables d'une résistance de bas niveau facilitant la sélection d'une résistance de haut niveau due à une mutation dans les gènes codant l'ADN gyrase dans un deuxième temps. Cependant, leur implication dans la résistance aux FQ, ainsi que notre hypothèse quant au processus de sélection, reste à démontrer. / Fluoroquinolone (FQ) resistance is the main factor of worsened prognosis of multidrug resistant tuberculosis. Therefore to better understand the development of FQ resistance is essential in order to improve the tools for early detection of this resistance. We have (i) evaluated the performance of gyrA and gyrB sequencing in the detection of FQ resistance through a prospective study; (ii) studied the natural history of the emergence of FQ resistance in vivo using a murine model of tuberculosis; and (iii) identified tracks for new mechanisms of resistance to FQ by comparative genomics. We showed that the proportion method, designated as the reference method, is not effective in detecting low levels of FQ resistance and that, neither genotypic methods nor phenotypic methods, allow the diagnosis of FQ heterogeneous resistance. A combined strategy based on phenotypic detection of an abnormal proportion of resistant bacteria and genotypic characterization of these resistant bacteria would improve the detection of this heterogeneous resistance. We have identified hypotheses for new FQ resistance mechanisms. These new mechanisms could be responsible of a low-level resistance facilitating the selection of a high-level resistance due to mutations in genes encoding DNA gyrase in a second time. However, their involvement in FQ resistance and our assumption about the selection process remain to be demonstrated.
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Molecular And Immunlogical Approaches For Understanding The Basis For Pathogenesis Of Mycobacterium TuberculosisRao, Amara Rama 02 1900 (has links) (PDF)
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