Dada a importância do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), a necessidade de uma eficiente caracterização bacteriológica dos focos como ponto fundamental do sistema de vigilância e as dificuldades encontradas pelos laboratórios quanto aos métodos de isolamento de Mycobacterium bovis fizeram crescer o interesse do meio científico por estudos, sobretudo moleculares, de isolados M. bovis. Para a realização dessas técnicas moleculares, é necessária abundância de massa bacilar, obtida através da manutenção dos isolados em laboratório e repiques em meios de cultura. Entretanto o crescimento fastidioso do M. bovis em meios de cultura traz grandes dificuldades para essas operações. Assim sendo, o presente estudo teve por objetivos: 1º) Comparar três métodos de descontaminação para homogeneizados de órgãos, etapa que precede a semeadura em meios de cultura, onde 60 amostras de tecidos com lesões granulomatosas, provenientes de abatedouros bovinos do Estado de São Paulo, foram colhidas e imersas em solução saturada de Borato de Sódio e transportadas para o Laboratório de Zoonoses Bacterianas do VPS-FMVZ-USP, onde foram processadas até 60 dias após a colheita. Essas amostras foram submetidas a três métodos de descontaminação: Básico (NaOH 4%), Ácido (H2SO4 12%) e 1- Hexadecylpyridinium chloride a 1,5% (HPC) e o quarto método foi representado pela simples diluição com solução salina (controle). Os resultados foram submetidos à comparação de proporções, pelo teste de &#967;², na qual verificou-se que o método HPC foi o que apresentou menor proporção de contaminação (3%) e maior proporção de sucesso para isolamento de BAAR (40%). 2º) Comparar três diferentes meios criopreservates para M. bovis, foram utilizados 16 isolados identificados pela técnica de spoligotyping. Cada um desses isolados foi solubilizado em três meios (solução salina, 7H9 original e 7H9 modificado), e armazenado em três diferentes temperaturas (-20ºC, -80ºC e -196ºC), sendo descongelado em três diferentes tempos (45, 90 e 120 dias de congelamento). Antes do congelamento e após o descongelamento foram feitos cultivos quantitativos em meios de Stonebrink Leslie. Os porcentuais de redução de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) nas diferentes condições foram calculados e comparados entre si através de métodos paramétricos e não-paramétricos. Os resultados obtidos foram: na análise da variável tempo, em 90 dias de congelamento foi observada uma maior proporção de perda de M. bovis, quando comparado ao tempo 120 dias (p=0,0002); na análise da variável temperatura, foi observada uma diferença estatística significativa entre as proporções de perda média nas temperaturas de -20ºC e -80ºC (p<0,05); na análise da variável meio, foi observada uma diferença significativa (p=0,044) entre os meios A e C, para 45 dias de congelamento e -20ºC de temperatura de criopreservação. Embora as medianas dos porcentuais de perdas de UFC terem sido sempre inferiores a 4,2%, permitiram sugerir que o melhor protocolo de criopreservação de isolados de M. bovis é solubilizá-los em 7H9 modificado e mantê-los à temperatura de -20ºC / In the context of the National Program of Control and Eradication of Brucellosis and Tuberculosis (PNCEBT), the necessity of an efficient bacteriologic characterization of the infected herds as a cornerstone of the monitoring system and the difficulties faced by the laboratories regarding the methods for Mycobacterium bovis isolation led to a growing interest for scientific studies, especially molecular, of M. bovis isolates. To use these molecular techniques it is necessary to have an abundant bacillary mass, obtained through the maintenance of isolates in laboratory and replication in culture media. However the fastidious growth of M. bovis in culture media brings out great difficulties for these activities. Thus, the present study has the following objectives: First, to compare three decontamination methods for organ homogenates, phase that precedes the sowing in culture media, 60 samples of tissues with granulomatosis injuries, proceeding from bovine slaughterhouses in the State of São Paulo, were obtained, immersed in sodium borato saturated solution and transported to the Laboratório de Zoonoses Bacterianas of the VPS-FMVZ-USP, where they were processed up to 60 days after the sampling. These samples were submitted to three methods of decontamination: Basic NaOH 4%, Acid (H2SO4 12%) and 1- Hexadecylpyridinium chloride (HPC) 1.5% and a simple dilution with saline solution (control method). The results were analysed by means of the &chi test to compare proportions, and it was verified that HPC method presented the smallest proportion of contamination (3%) and the greatest proportion of success for M. bovis isolation (40%). Second, to compare three different cryopreservation media for M. bovis, 16 isolates identified by the technique of spoligotyping were used. Each one of these isolates was solubilized in three media (original saline solution, 7H9 and 7H9 modified), and stored in three different temperatures (-20ºC, -80ºC and -196ordm;C), and defrosted in three different time periods (45, 90 and 120 days of freezing). Before the freezing and after the unfreezing, quantitative cultivations in Stonebrink Leslie media were carried out. The proportions of Colony-Forming Units (CFU) loss in the different conditions were calculated and compared with one another through parametric and non-parametric methods. The results obtained were: in the analysis of the variable time, at 90 days of freezing a bigger proportion of CFU loss was observed when compared to 120 days (p=0,0002); in the analysis of the variable temperature, a statistically significant difference was observed between the average proportions of CFU loss for the temperatures of -20ºC and -80ºC (p<0,05); in the analysis of the variable media, a significant difference was observed (p=0,044) between the media A and C, for 45 days of freezing and -20ºC of cryopreservation temperature. Althougth the medium ones of the proportion of losses of CFU to always have been inferior 4,2%, had allowed to suggest that the best protocol for cryopreservation of M. bovis isolates is to solubilize them in 7H9 modified medium and to keep them at a temperature of -20ºC

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:37:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_THEMYS DANYELLE VAL LIMA.pdf: 805232 bytes, checksum: 685404335d9cf877d65702bc0a9c6373 (MD5) Previous issue date: 2015-11-27 / Leprosy is a disease caused by Mycobacterium leprae, or Hansen bacillus, obligate intracellular parasite, affinity with skin cells and cells of the peripheral nerves, which settles in the body of the infected person and can multiply. The involvement of the disease in children under 15 is a priority of the National Program of Leprosy Control (PNCH) of the Department of Epidemiological Surveillance of the Ministry of Health, for when the disease manifests in childhood indicates high endemicity. This is a retrospective cross-sectional study with a quantitative approach in order to investigate the leprosy in rural schoolchildren in the city of Itapecuru-Mirim / MA and characterize the reported cases of leprosy in children under 15 years from 2009 to 2013. In the retrospective study enrolled 36 cases in 2009 to 2013 and found most frequent in females (72.3%), the age group 06-10 years (52.7%) 83.3% had less than 05 lesions; tuberculoid clinical form (58.3%); paucibacillary classification (66.6%), lack of nerves affected (94.4%); smear microscopy was not performed in 83.3% of cases; diagnostic spontaneous demand (47.2%); Disability zero degree (91.6%). In the examination of household contacts, the year 2013 had 100% of the contacts examined. For cross-sectional study was conducted active case finding in the school population and obtained higher frequency in females (75%); corresponding to 11 years old (50%); own home (50%); more than a minimum wage that income (50%); tuberculoid clinical form (50%); physical disability and no damage to the nerves (75%); likely ignored source of contagion (50%); presence of a BCG scar (75%); Previous treatment for these symptoms (75%); identified previous problem were dermatophytosis (75%). The study allowed the identification of 04 cases of leprosy in children under 15 years, highlighting the importance of further studies in this population. / A hanseníase é doença causada pelo Mycobacterium leprae, ou bacilo de Hansen, parasita intracelular obrigatório, com afinidade por células cutâneas e por células dos nervos periféricos, que se instala no organismo da pessoa infectada, podendo se multiplicar. O acometimento da doença em menores de 15 anos é prioridade do Programa Nacional de Controle da Hanseníase (PNCH) da Secretaria de Vigilância Epidemiológica do Ministério da Saúde, pois quando a doença se manifesta na infância indica alta endemicidade. Trata-se de um estudo retrospectivo e transversal com abordagem quantitativa com o objetivo de investigar a hanseníase em população de escolares no município de Itapecuru-Mirim/MA e caracterizar os casos notificados de hanseníase em menores de 15 anos no período de 2009 à 2013. No estudo retrospectivo registrou-se 36 casos nos anos de 2009 à 2013, e verificou-se maiores frequências no sexo feminino (72,3%), a faixa etária de 06 a 10 anos (52,7%) 83,3% apresentaram menos de 05 lesões; forma clínica tuberculóide (58,3%); classificação paucibacilar (66,6%), ausência de nervos afetados (94,4%); a baciloscopia não foi realizada em 83,3% dos casos; diagnóstico por demanda espontânea (47,2%); Grau zero de incapacidade física (91,6%).Em ao exame de contatos intradomiciliares, o ano de 2013 teve 100% dos contatos examinados. Para o estudo retropectivo foi realizada busca ativa de casos na população de escolares e obteve-se maiores frequências no sexo feminino (75%); idade correspondente a 11 anos (50%); residência própria (50%); renda referida de mais de um salário mínimo (50%); forma clínica tuberculóide (50%); grau de incapacidade física e ausência de lesões nos nervos (75%); provável fonte de contágio ignorada (50%); presença de uma cicatriz de BCG (75%); tratamento anterior para essa sintomatologia (75%); problema anterior identifidado foram as dermatofitoses (75%). O estudo permitiu a identificação de 04 casos de hanseníase em menores de 15 anos, destacando a importância da realização de outros estudos nessa população.

O presente trabalho objetivou avaliar o efeito da gordura do leite caprino na resistência térmica do Mycobacterium fortuitum. A realização desta pesquisa é motivada pelos seguintes fatos: 1. a pasteurização lenta é amplamente utilizada para o beneficiamento do leite caprino destinado ao consumo e industrialização; 2. o binômio tempo x temperatura foi estabelecido com base na resistência térmica do Mycobacterium ssp; 3. o valor D expressa o tempo que se leva, a uma dada temperatura, para se reduzir um ciclo logarítmico de um microrganismo; 4. a gordura exerce efeito protetor sobre os microrganismos; 5. M. fortuitum é a espécie recomendada para testes iniciais, por ser menos patogênica e de crescimento rápido. Foram realizados dois experimentos (um com leite integral e outro com leite desnatado, com três repetições cada), utilizando-se amostras de cabras sadias. As amostras foram contaminadas com inóculo previamente padronizado e distribuídas em oito tubos com tampa, que foram submetidos a tratamento térmico em banho-maria à 65oC. Realizou-se a contagem das UFC/mL do leite contaminado antes do tratamento térmico (controle da contaminação) e dos tubos retirados nos tempos 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos. Realizou-se a diluição seriada até 10-7, com posterior semeadura em duplicata em placas de petri com meio Lowenstein-Jensen, incubadas por cinco dias à oC. Os resultados, em logarítmo, foram plotados em diagrama de dispersão, com posterior regressão linear para construção da curva de sobreviventes (ou curva de morte térmica), o valor D65oC foi calculado a partir da equação da reta obtida em cada repetição, e também a melhor curva obtida a partir das três repetições. Através dos resultados obtidos no presente trabalho obteve-se o valor D65oC do Mycobacterium fortuitum em leite caprino integral de 10,2 minutos e 8,61 minutos para o leite desnatado. Isso mostra que, na condição estudada a pasteurização lenta é capaz de reduzir 3,48 log de M. fortuitum em leite desnatado, e apenas 2,94 log em leite integral e, portanto, resultará em diferentes níveis de segurança ao consumidor. A variação nos valores D65oC observadas neste trabalho sugerem que a gordura não é a única responsável por essa diferença, pois houve variação entre as repetições realizadas no mesmo substrato. A variação entre os resultados em leite integral pode ser atribuída, pelo menos em parte, à composição da gordura que têm influência na resistência térmica dos microrganismos. A gordura do leite interfere negativamente na eficiência da pasteurização lenta sobre destruição de M. fortuitum. A importância dessa informação para a saúde pública é dependente, em primeiro lugar, da comprovação de que esse fenômeno é comum às espécies patogênicas de micobactérias, e determinar sua intensidade. A gordura não interfere no padrão de morte térmica no leite de cabra. / This work describes the results obtained to evaluate the effect of fat goat milk on thermal resistance of Mycobacterium fortuitum. This research is motivated for the following motives: 1. The holder pasteurization is extensive method using for the processing goat milk destined for consumption and industrialization; 2. The couple time x temperature was established for the thermal resistance of Mycobacterium ssp; 3. The value D express the necessary time, in a given temperature, to reduce a logarithmic cycle of microorganism; 4. The fat causes a protecting effect on the microorganisms; 5. Mycobacterium fortuitum is the specie recommended for beginnings tests, because it is less pathogenic and have fast growth. Two experiments were done (one using raw goat milk and another using skim goat milk, with three repetition each). The samples were contaminated with previous standard inoculum and distributed in eight tubes, that had been submitted a thermal treatment in water-bath in 65°C. The cfu/mL were counted in the contamined milk before the thermal treatment (contamination control) and the tubes pulled off in the times: 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutes. Following was realized a series diluted until 10-7, with later spreaded in duplicate petri plates with medium Lowestein Jensen, incubated for five days in 37°C. The results obtained were represented in a logarithmic graph of dispersion diagram, with posterior linear regression for the construction survivor?s curve (or death thermal curve), the value D65oC was calculated from the equation of the straight line obtained in each repetition, and the best straight line obtained from the three repetitions too. Through the results obtained in the present work get a value D65oC of Mycobacterium fortuitum in raw goat milk the 10,2 minutes, and 8,61 minutes for skim goat milk, this mean that in these study conditions, the holder pasteurization is able to reduce 3,48 log of Mycobacterium fortuitum in skim milk and only 2,94 log in raw milk, and thus results in different security levels for the consumers. The variation observed in the values D65oC obtained in this work suggest that the fat doesn?t a unique responsible for this difference, because have a variation among the repetitions done in the same substrate. The variation between the results in raw milk can be attribute, in part, for the composition of fat that have a influence on the thermal resistance in the microorganisms. The fat milk interferes negatively in the holder pasteurization effective about the Mycobacterium fortuitum destruction. The importance on this information for the public health is dependent, in first moment, the proved that this phenomenon is common for the micobacteria pathogenic species, and determined its intensity. The fat doesn&#39;t interfere in the standard thermal death in the goat milk.

Avaliou-se a aplicação rotineira de um método automatizado TSMA em comparação ao convencional TSMP na determinação da sensibilidade a drogas anti-micobacterianas de 126 isolados clínicos de bactérias do complexo M. tuberculosis. Os isolados clínicos foram divididos em: sem tratamento (NT), tratado anteriormente (RT) e multirresistentes (MDR). A concordância entre TSMP e TSMA, para Rifampicina no NT, foi de 98.3%, p=1.000 e Kappa=0.659. No RT, foi de 94.3%,p=0.625 e Kappa=0.639, no MR, foi de 96.6%, p=0.625 e Kappa=0.651. Para Hidrazida, no NT, foi de 88.5%, p=0.125 e Kappa=0.408 no RT foram de 88.6%, p=0.625 e Kappa=0.645 no de pacientes MR, foi de 86,7%, p=0.625 e Kappa=0.053. Para Estreptomicina no NT, foi de 93.5%, p=0.125 e Kappa=0.635. No RT, foi de 79.4%, p=0.016 e KAPPA=0.296 no MR, foi de 76,6%, p=0.453 e Kappa=0.533. Para Etambutol, no NT, foi de 93.4%, p=0.125 e Kappa=0.315, no RT foi de 94.3%, p=0.500 e Kappa=0.478. No MR, foi de 72.4%, p=0.70ª e Kappa=0.455. A metodologia automatizada mostrou-se mais rápida. / We evaluated the routinely application of an automated system(STAM) and the conventional method (STPM), used to determine the profile of sensitivity to antimycobacterial drugs of 126 clinical isolates of the complex M. tuberculosis. Clinical isolates was group divided into: without treatment (WT), previously treated (PT) and multidrug resistant (MDR).Concordant result between STPM and STAM, for Rifampin, in WT, was 98.3%, p=1.000 and Kappa=0.659. PT, was 94.3%, p=0.625 and Kappa=0.639; in MDR, was 96.6%, p=0.625 and Kappa=0.651. For Hidrazin, WT, was 88.5%, p=0.125 and Kappa=0.408; in PT, 88.6%, p=0.625 and Kappa=0.645; for MDR, 86.7%, p=0.625 and Kappa=0.053. For Streptomycin, PT was 93.5%, p=0.125 and Kappa=0.635. In PT, was 79,5%, p=0.016 and Kappa=0.296; in MDR, 76.6%, p=0.453 and Kappa=0.533. For Ethambutol, WT was 93.4%, p=0.125; in PT 94.3%, p=0.500 and Kappa=0.478. MDR was 72.4%, p=0.70 and kappa=0.455. Evaluation of mycobacterial sensitivity was faster in the automated method when compared with the conventional method.

Apesar das recomendações da Organização Mundial da Saúde, na reunião ministerial realizada em Amsterdam, Holanda em 2000, a tuberculose continua em ritmo crescente, atingindo principalmente os países em desenvolvimento e pessoas com o sistema imunológico comprometido, principalmente as infectadas pelo vírus da imunodeficiência adquirida. Os métodos utilizados no diagnóstico continuam os mesmos utilizados por muitos anos, cujas limitações impedem a ação rápida dos programas de saúde que buscam interromper a cadeia de transmissão da doença. Continuando uma linha de pesquisa do Laboratório de Soroepidemiologia e Imunobiologia do IMTSP, utilizando o método do Western Blotting, procuramos neste trabalho ampliar os conhecimentos da resposta imunológica de anticorpos em pacientes com tuberculose pulmonar, clinica e laboratorialmente definida, avaliando a participação das imunoglobulinas IgG, IgA e IgM, subclasses de IgG (IgG1 e IgG3) e a avidez da imunoglobulina IgG em amostras de soros colhidas no início e no final do tratamento. Nossos resultados mostraram que o melhor marcador imunológico foi a imunoglobulina IgG por apresentar melhor desempenho diagnóstico quando comparada com os resultados dos métodos microbiológicos e de dosagem de interferon gama, Quantiferon TB Gold. As frações protéicas que apresentaram melhor desempenho diagnóstico foram as de 38 e 30 KDa / Despite the recommendations of the World Health Organization, during the Ministerial meeting held in Amsterdam, Holland in 2000, tuberculosis continues at an important increasing rate, affecting mostly developing countries and people with severe compromised immune systems, especially those infected with human acquired immunodeficiency virus. The methods used for diagnosis are the same used for many years, whose limitations prevent the rapid action of countries health programs that seek to stop the chain of disease transmission. Continuing a line of research of the Laboratory of Seroepidemiology and Immunobiology of IMTSP using the method of Western blotting, in this study we tried to broaden the knowledge of the immune response of antibodies in patients with pulmonary tuberculosis, clinical and laboratory defined by evaluating the participation of IgG, IgA and IgM, IgG subclasses (IgG1 and IgG3) and immunoglobulin IgG avidity in serum samples collected in the beginning and end of treatment. Our results showed that the immunoglobulin IgG was best immunological marker when compared with the results of microbiological methods and determination of interferon gamma, QuantiFERON TB Gold. The proteins fractions that showed better diagnosis performance were 38 and 30 KDa

Os mecanismos que conferem resistência do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) à destruição pelo hospedeiro, além da sua capacidade em permanecer e/ou multiplicar-se no interior das células fagocitárias são ainda pouco compreendidos. Nosso grupo de pesquisa tem contribuído para o entendimento do papel dos mediadores lipídicos, que incluem prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) na tuberculose. PGs inibem a resposta imune celular TH1, a produção de citocinas e a fagocitose, e assim facilita a infecção. LTs estão envolvidos no recrutamento de leucócitos, e na modulação da síntese de citocinas, no aumento da fagocitose e dos mecanismos microbicidas, e assim contribui para a eliminação da micobactéria. Neste projeto, avaliamos in vivo e in vitro a produção dos mediadores lipídicos induzidos por cepas de Mtb isolados de pacientes com tuberculose ativa. Demonstramos neste trabalho que macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV009 levam a maior produção de TNF- e nitrito, do que aqueles infectados com a cepa SV068. Em contraste, macrófagos alveolares infectados com os bacilos da cepa SV068 induzem a produção de muito mais LTB4, quando comparado aos bacilos da cepa SV009. Obtivemos maior recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC) de macrófagos alveolares tratados com MK886 e infectados com bacilos da cepa SV068; enquanto que mais UFCs foram recuperadas após o tratamento com ácido caféico e infecção com a cepa SV009. Com relação a formação de corpúsculos lipídicos (CLs), observamos um maior número destes quando macrófagos alveolares foram infectados com bacilos da cepa SV068. Ainda, observamos diminuição de CLs quando tratados com MK886 ou ácido caféico. Os bacilos da cepa SV068 foram mais fagocitados, mas os macrófagos não foram muito eficazes na atividade microbicida dos mesmos. Nos experimentos in vivo vimos que camundongos balb/c infectados com a cepa SV068 morrem mais e o tratamento com MK886 parcialmente os protege e a mortalidade não está relacionada com a maior carga bacilar no pulmão ou baço. Houve aumento no recrutamento de neutrófilos induzido pela infecção especialmente após infecção com os bacilos da cepa SV068, sendo que o tratamento com MK886 inibe significativamente o recrutamento quando comparado à infecção com os bacilos da cepa SV009. Células mononucleares também foram recrutadas e permaneceram aumentadas até o final do período observado, sem muitas diferenças significativas quando comparamos a infecção com os isolados SV009 e SV068. A produção de nitrito também encontrou-se elevada em animais infectados com bacilos da cepa SV068. A análise histopatológica dos pulmões dos animais infectados mostrou intensa reação inflamatória com maior comprometimento do parênquima pulmonar dos camundongos infectados bacilos da cepa SV068, com intensa deposição de colágeno e multiplicação bacilar. Encontramos diferenças significativas em relação à producão de citocinas IL-6, IL-10, IL-1, IFN-, TNF- and IL-12 após infecção de 30 e 60 dias com as cepas SV009 e SV068. Também mostramos que há diferenças na produção de LTB4 e PGE2 após 30 e 60 dias de infecção com as cepas SV009 e SV068 em células do camundongos balb/c. Experimentos com animais 129 e 5LO-/- infectados com as duas cepas também foram realizados, e vimos que os animais 5LO-/- são mais suscetíveis à infecção especialmente quando infectados com a cepa SV068. Sugerimos que as cepas são diferentes, mas dependentes de um conjunto de fatores, e nossos dados sugerem que dentre estes mecanismos a produção de TNF- e também de mediadores lipídicos (LTB4 e PGE2) estão envolvidos. / The mechanisms that confer resistance to Mycobacterium tuberculosis (Mtb) for destruction by the host, in addition to its ability to retain and/or multiply within phagocytic cells are still poorly understood. Our research group has contributed to the understanding of the role of lipid mediators, including prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) in tuberculosis. PGs inhibit Th1 cell immune response, cytokine production and phagocytosis, thus facilitating the infection. LTs are involved in the leukocytes recruitment, and modulation of cytokine synthesis, phagocytosis and microbicidal mechanisms enhancement, and contribute to the elimination of the mycobacteria. In this project, we evaluated in vivo and in vitro the lipid mediators production induced by Mtb strains isolated from patients with active tuberculosis. We demonstrated in this study that alveolar macrophages infected with bacilli from SV009 strain lead to an increase of TNF- production and nitrite, than those infected with the strain SV068. In contrast, alveolar macrophages infected with bacilli from SV068 strain induced more LTB4 production when compared to SV009 infection. We obtained higher recovery colony forming units (CFU) of alveolar macrophages treated with MK886 and infected with bacilli from SV068 strain; while more CFUs were recovered after treatment with caffeic acid and infection with bacilli from SV009 strain. Regarding the lipid bodies (LBs) formation, we observed a greater number of these structures, when alveolar macrophages were infected with bacilli from SV068 strain. Still, we observed a decrease of LBs when the macrophages were treated with MK886 and caffeic acid. Bacilli from SV068 strain were more phagocytosed, but macrophages were not very effective in the microbicidal activity. In the in vivo experiments we found that mice infected with SV068 strain die more than the other and MK886 treatment partially protects the mice, besides, the mortality is not related to the higher bacterial load in the lung or spleen. There was an increase in neutrophil recruitment induced after infection, especially after infection with SV068 strain, and treatment with MK886 significantly inhibits recruitment when compared to infection with SV009 strain. Mononuclear cells were also recruited and remained increased until the end of the observed period, without many significant differences when comparing infection with SV009 and SV068 strains. The nitrite production was also found greater in animals infected with bacilli from SV068 strain. Histopathological analysis of the infected mice lungs showed an intense inflammatory reaction with greater impairment of the mice lungs when infected with bacilli from SV068 strain with an intense collagen deposition and multiplication of bacilli. We suggest that the SV068 strain is more virulent and participates of the immune response by lipid mediators dependent mechanisms.

Anotação proteogenômica é uma abordagem que une a análise proteômica com a anotação genômica. O intuito de tal abordagem é prover uma anotação mais detalhada ao gene. Intuito esse, que nem sempre é possível quando se trata apenas de genes, uma vez que produtos gênicos, com funções importantes preditas, somente passam a ter papel na fisiologia do organismo quando expressos e traduzidos. Com todo o avanço atual de estudos na área proteogenômica, a geração de dados tem crescido de modo exponencial e, com esse crescimento, nota-se a necessidade cada vez maior da criação de sistemas capazes de processar, armazenar e gerenciar essas novas informações produzidas. Assim, é descrito nesse trabalho o desenvolvimento do ProGen AP , sendo constituído de uma interface web construída em HTML/PHP5, um banco de dados cujo SGBD é o mySQL e de módulos de processamento de dados proteômicos, neste caso o LabKey (com o core Xtandem!) e o QuickMod. Todos os módulos são open source e comunicam entre si através de scripts PERL. Nesse sistema, o pesquisador fornece dados de experimentos proteômicos e o sistema, então, os processa e retorna ao usuário informações sobre o gene expresso, a localização dos peptídeos dentro do gene aos quais pertencem e, ainda, informações quantitativas sobre o peptídeo e a proteína identificados. Além disso, o uso de um processamento esquematizado reduz a possibilidade de erro de entrada/saída de dados nos módulos intermediários do processamento. Aqui, o ProGen AP foi aplicado no estudo proteômico do Mycobacterium tuberculosis (MTb). Na literatura, o genoma do MTb cepa H37Rv contém apenas 4062 open reading frames (ORFs) preditos e o complemento funcional desse genoma, o proteoma, ainda não está totalmente elucidado. A análise do proteoma do MTb, com o uso do ProGen AP, resultou em uma lista total de 154.982 identificações de peptídeos, representando um total de 147.334 peptídeos únicos. Até o momento, foram identificadas 2.369 proteínas, cobrindo aproximadamente 58% de todo o genoma do MTB. É importante ressaltar que, dentre todas as proteínas identificadas até o momento, a maioria delas está anotada como proteinas hipotéticas em seu genoma, e, por consequência, os resultados obtidos nesse projeto confirmam e validam a existência de tais produtos gênicos. Além disso, 567 peptídeos foram identificados como N-terminal e 1229 como C-terminal, o que indica a correta predição do início e do término da tradução de tais genes. Todos esses resultados positivos confirmam que a abordagem utilizada no ProGen AP é eficiente e pode ser usada em vários outros organismos de interesse do pesquisador. / Proteogenomic annotation is an approach that combines proteomic analysis and genomic annotation. The aim of this approach is to provide a more detailed annotation, which is not possible in most of the times when dealing mostly with genes, once that genomic products, with important predicted functions are only important in the organism physiology when they are expressed and translated. There have been occurring several advances in proteogenomic studies and the generation of new data sets has been growing in an exponential wave. With all this growth, the creation of systems able to storing, processing and analyzing all the new knowledge produced is eminent. This study presents the deployment of ProGen AP, a system built with a HTML/PHP5 web interface, a mySQL data management system to store the data and two processing modules (LabKey, with core X!Tandem and QuickMod). In this system, the researcher provides a data set from a proteomic experiment and then the system processes it and returns to the researcher information about the expressed gene, the peptides localization inside the gene that they belong and, also, quantitative information about the peptide and the protein that were identified. Also, the use of an automated pipeline reduces the possibility of making mistakes in input/output of the data when using the intermediate modules. Here, the ProGen AP were applied to perform a proteogenomic annotation of Mycobacterium tuberculosis (MTb). In literature, the MTb genome, strain H37RV, have only 4062 predicted open reading frames (ORFs) and the functional complement of this genome is not completely known. The MTb analysis using ProGen AP, resulted in a list of 154.982 peptides identification, representing a total of 147.334 single peptides. Until now, were identified 2.369 proteins, covering nearly of 58% of the whole MTb genome. Is very important to highlight that, among all the identified proteins until now, most of them are annotated as hypothetical proteins in the MTb genome, so can be affirmed that the results of this project can confirm and validate the existence of all these genomic products. Beside this, 567 peptides were identified as been an N-terminal peptide and 1229 were identified as been a C-terminal, this fact indicates that the prediction of the beginning and the end of translation of those genes are right. All these positive results corroborate that the approach utilized in the ProGen AP is efficient and can be used in studies of other organisms.

A manutenção da infecção latente pelo M. tuberculosis (TBIL) pode ser atribuída à sua capacidade de sobreviver durante anos no organismo humano em um estado não replicativo (dormente). A proteína HspX do M. tuberculosis, induzida sob condições de hipóxia, está fortemente associada com a manutenção da viabilidade do bacilo na TBIL. O presente estudo tem como objetivo, verificar se a superexpressão da proteína HspX altera a expressão de genes envolvidos com a síntese de componentes da parede celular, replicação do DNA e divisão celular de bacilos, assim como, na expressão de genes envolvidos com a resposta imune inata em macrófagos infectados com esses bacilos. O gene hspX foi amplificado pela PCR a partir do DNA do M. tuberculosis H37Rv, clonado no vetor de expressão pFPCA1GFP, e a proteína HspX expressa em M. smegmatis mc2155. As bactérias, nas quais, a presença da proteína recombinante foi confirmada por Western Blot, foram utilizadas, para a análise de expressão gênica tanto em bactérias quanto em macrófagos infectados. O estudo de expressão gênica foi realizado utilizando a RT-qPCR. Quando comparado aos controles, as bactérias que expressavam a proteína HspX apresentaram uma redução na expressão de genes de replicação do DNA e divisão celular, que foi acompanhado por uma tendência a filamentação das células e uma redução no tamanho das colônias. Além disso, nos macrófagos infectados com a bactéria expressando a proteína HspX, houve um aumento tanto da expressão do mRNA quanto da secreção de IL-1b, citocina importante para estabilização do granuloma, e uma redução na expressão de IRGM, gene relacionado com o processo autofágico, importante mecanismo de defesa do hospedeiro contra bactérias intracelulares. Portanto, em conjunto, essas alterações de expressão gênica, em consequência da presença da proteína HspX sugerem uma contribuição, direta ou indireta, dessa proteína para a adaptação morfológica e metabólica da bactéria dormente durante a TBIL, e consequentemente, para a resposta imune inata dos macrófagos infectados favorecendo a viabilidade intracelular dessas bactérias. / The maintenance of Mycobacterium tuberculosis infection latent (TBIL) may be attributed to its ability to persist for years in the host in a non-replicative state (dormant). The HspX protein from M. tuberculosis, induced under hypoxic, is strongly associated with maintaining the bacillus viability in TBIL. This study aims to determine if HspX overexpression chances the expression of genes involved in the synthesis of cell wall components, DNA replication and cell division of bacilli, as well as, the expression of genes involved in innate immune response of macrophages infected. The gene hspX was amplified by PCR from DNA of M. tuberculosis H37Rv, and cloned into the expression vector pFPCA1GFP. The HspX was expressed in M. smegmatis mc2155 and the recombinant protein was confirmed by Western blot. The bacterias expressing HspX were used for gene expression analysis both in bacteria and in infected macrophages by RT-PCRq. In bacterias expressing HspX, it was observed a reduction in expression of genes involved in DNA replication and cell division, and with cells more filamentous and smaller colonies, compared with controls. In addition, in macrophages infected with bacillus expressing HspX, there was an increase in both mRNA expression and secretion of IL-1b, an important cytokine for granuloma stability, and a reduction in expression of IRGM, an autophagic gene, important for host defense mechanism against intracellular bacteria. Together, these results suggest a direct or indirect contribution of HspX protein for metabolic and morphological adaptation of dormant bacteria in TBIL, and for the innate immune response in infected macrophages, improving the bacteria intracellular viability.

Submitted in fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry, Durban University of Technology, Durban, South Africa, 2017. / In drug discovery and development of anti-tubercular therapeutics, it is necessary to study the physiology and genetics of the molecular mechanisms present in the Mycobacterium tuberculosis. The virulence of M. tuberculosis is attributed to its unique genome, which contains a high frequency of glycine-rich proteins and genes involved in the metabolism of the fatty acids. Consequently, the presence of a diversity of the pathogenic pathways such as acid tolerance and drug resistance mechanisms in M. tuberculosis makes the treatment of Tuberculosis (TB) challenging. However, the molecular basis of the virulence factors involved in the pathogenesis is not fully understood. Accordingly, the current study focuses on better understanding of the pathogenic proteins present in this bacterium using available computational techniques. In South Africa, there is an alarming increase in the drug-resistant TB in HIV co-infected patients, which is one of the biggest challenges to the current anti-tubercular therapies. An extensive literature search showed that the mutations in the virulent proteins of M. tuberculosis resulted in the development of drug tolerance in the pathogen. The molecular and genetic studies identified frequently occurring point mutations associated with the drug resistance in proteins of M. tuberculosis. Despite the efforts, TB infection is still increasing because different pathogenic pathways in the bacterial system are still undiscovered. Therefore, this study involves an in silico approach aimed at the identification of novel drug resistance implicated point mutations. The site- directed mutations leading to the development of resistance against four first-line drugs (Ethambutol, Isoniazid, Rifampicin, and Streptomycin) were studied extensively. In the primary investigation, pathogenic mutational landscapes were classified in the sequences of the studied proteins. The effects of these mutations on the stability of the proteins were studied using diverse computational techniques. The structural basis of the point mutations with the highest destabilizing effects was analyzed using the principles of the Density Functional Theory (DFT), molecular docking and molecular dynamics (MD) simulation studies. The varied conformational behavior resulted from these predicted substitutions were compared with the experimentally derived mutations reported in the literature. The outcome of this study enabled the identification of the novel drug resistance-associated point mutations which were not previously reported. Furthermore, a detailed understanding of the conformational behavior of diverse virulent proteins present in M. tuberculosis was also generated in this study. Literature study showed that inside the host’s macrophage cells, the virulent proteins such as isocitrate lyase, lipase lipF, magnesium transporter MgtC, porin protein OmpATb, a protein of two component systems PhoP, Rv2136c and Rv3671c have an established role in the development of the acid tolerance. On the other hand, information regarding their role in the acid resistance is scarce. Accordingly, the structural basis of their role in acid resistance was analyzed using constant pH based MD simulations. In the studied proteins, the lipF and PhoP showed highest structural stability in highly acidic conditions throughout the course of MD simulations. Therefore, these proteins may play a primary role in the process of resistance. In addition to these pathogenic proteins, there is a need to identify new undiscovered virulent proteins in the genome of M. tuberculosis, which increases the efficiency of the current therapy. The knowledge generated by the analyses of the proteins involved in resistance and pathogenic mechanisms of M. tuberculosis forms the basis for the identification of new virulence factors. Therefore, an in silico protocol was used for the functional annotations and analyses of the virulence characteristics. M. tuberculosis contains 1000 Hypothetical Proteins (HPs), which are functionally uncharacterized proteins and their existence was not validated at the biochemical level. In this study, the sequences of the HPs were extensively analyzed and the functions of 662 HPs were successfully predicted. Furthermore, 483 HPs were classified in the category of the enzymes, 141 HPs were predicted to be involved in the diverse cellular mechanisms and 38 HPs may function as transporters and carriers proteins. The 307 HPs among this group of proteins were less precisely predicted because of the unavailability of the reliable functional homologs. An assessment of the virulence characteristics associated with the 1000 HPs enabled the classification of 28 virulent HPs. The structure of six HPs with highest predicted virulence score was analyzed using molecular modelling techniques. Amongst the predicted virulent HPs, the clone for Rv3906c purchased from the DNASU repository because of the ease of its availability. The gene of Rv3906c was isolated and cloned into a pET-21c expression vector. The analyses of the nucleotide sequence showed that Rv3906c gene (500 bp) encodes a 169 amino acid protein of molecular weight 17.80 kDa (~18.0 kDa). The sequence analyses of Rv3906c showed that the HPs showed high similarities with pullulanase, a thermophilic enzyme. The stability profile at different temperatures for Rv3906c generated using MD simulations showed that Rv3906c maintained its structural identity at higher temperatures. It is expected that this study will result in the design of better therapeutic against the infection of M. tuberculosis, as novel undiscovered virulence factors were classified and analyzed in addition to the conformational profiles of the virulent proteins involved in the resistance mechanisms. / M

Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium abscessus produisent les β-lactamases BlaC et BlaMab qui contribuent à la résistance intrinsèque de ces bactéries aux β-lactamines. Notre objectif est de caractériser l’inhibition de ces β-lactamases par l’avibactam et le clavulanate pour contribuer au développement de nouveaux traitements. Nous avons déterminé le profil de substrat et d’inhibition de BlaMab ainsi que sa structure cristalline, révélant trois différences majeures avec BlaC. BlaMab a une activité supérieure à celle de BlaC pour toutes les β-lactamines sauf la céfoxitine qui est utilisée pour les infections dues à M. abscessus. BlaC est inhibée irréversiblement par le clavulanate et inefficacement par l’avibactam alors que BlaMab présente le comportement inverse impliquant une hydrolyse du clavulanate et une inhibition très rapide par l’avibactam. La structure de BlaMab diffère de celle de BlaC principalement par le remplacement du motif conservé SDN par SDG. L’introduction de SDG dans BlaMab et de SDN dans BlaC a montré que cette différence détermine le profil d’inhibition des β-lactamases. Une seule mutation peut donc entraîner l’émergence d’une résistance aux combinaisons d’une β-lactamine avec le clavulanate ou l’avibactam mais pas avec les deux inhibiteurs. L’avibactam et le clavulanate offrent donc des alternatives thérapeutiques en cas de résistance à l’un des inhibiteurs. Nous nous sommes également intéressés aux β-lactamines partenaires du clavulanate, pour le traitement de la tuberculose et montrer que la structure des carbapénèmes pouvait être optimisée pour améliorer l’inactivation des cibles et diminuer l’hydrolyse par BlaC. / Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium abscessus produce the β-lactamases BlaC and BlaMab that contribute to the intrinsic resistance of those bacteria to β-lactams. Our objective was to characterize the inhibition of these β-lactamases by avibactam and clavulanate in order to contribute to the development of new treatments. We have determined the inhibition and substrate profiles of BlaMab, as well as its crystal structure, revealing three major differences with BlaC. BlaMab is more active than BlaC with respect to hydrolysis of all β-lactams except cefoxitin, which is used for the treatment of infections due to M. abscessus. BlaC is inhibited irreversibly by clavulanate and inefficiently by avibactam. In contrast, BlaMab shows the opposite behavior involving hydrolysis of clavulanate and a rapid inhibition by avibactam. Structurally BlaC differs from BlaMab mainly by the replacement of the conserved motif SDN by SDG. The introduction of SDG in BlaMab and of SDN in BlaC revealed that this difference determines the inhibition profile of the β-lactamases. A single mutation can therefore lead to the emergence of resistance to the association of β-lactam with clavulanate or avibactam, but not to both associations. Thus, avibactam and clavulanate offer therapeutic alternatives in case of resistance to one of the two inhibitors. We have also investigated the β-lactam partners of clavulanate for the treatment of tuberculosis and showed that the structure of carbapenems could be optimized to enhance the inactivation of the targets and to reduce hydrolysis by BlaC.